本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及丙泊酚中/长链脂肪乳注射液包封率的检测方法。
背景技术：
丙泊酚中/长链脂肪乳注射液为我公司开发的脂肪乳制剂，原研为德国费森尤斯卡比(freseniuskabi)公司，其产品2007年在我国上市，商品名竟安，为静脉注射用麻醉剂。制剂开发中为了获得与原研一致的药效、安全性及制剂特性，我们选择乳剂的粒径、粒径分布、包封率、外观状态作为考察指标，来筛选处方。在这些指标中，反映药物包封程度的包封率是微乳注射剂重要的质量指标，其检测方法的建立，也是研究工作中的难点，包封率的测定方法一般是先用一定的方法把未包封的游离药物与包封药物分离开并进行测定，根据总投药量计算得出，中国药典规定包封率一般不得低于80％。常用的测定方法包括葡聚糖凝胶法(分子筛法)、超滤膜过滤法、超速离心法、微型柱离心法和透析法等。我们参考相关文献，尝试了透析法、葡聚糖凝胶法等方案，均未能成功的测定丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的包封率。在透析法中，要求药物具有一定的溶解度，且不受乳剂基质干扰，游离药物可在适宜的时间内顺利通过透析袋，且不导致包裹物渗漏，但事实上此法费时，一般室温条件下，要除去95％以上的游离药物至少需要更换三次渗析介质，时间在10－24h以上。在实际操作中，我们也遇到了渗析时间长，且无法获得稳定的释药平台的问题。而葡聚糖凝胶法，通常难以证明被包封脂肪乳与未包封游离药物已得到充分且完全的分离，即所测包封率结果可能高于或低于实际真实结果。在我们的实践中，所优选的体系，完全无法分离游离药物与包封药物，包封率结果为100％。
本发明是我们通过实践，探索到的唯一可将包封药物与游离药物进行区分的可操作性方法。它的原理是基于丙泊酚微乳溶液中，被包封药物与游离药物粒径的区别，通过超滤离心的方法，对包封药物进行分离，然后根据总投料量进行计算的方法。方法经实践与工艺验证，具有操作简单、数据可靠，区分度好的特点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种方法简单、可操作性强的检测药物包封率的方法，以克服现有脂肪乳制剂包封率测定中普遍存在的对药物选择性高、操作繁琐、重复性差等问题。
为了达到上述的目的，本发明提供一种测定丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的药物包封率的方法，所述方法采用超滤离心与高效液相色谱检测相结合来测定丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的包封率。
本发明提供的测定丙泊酚中/长链脂肪乳注射液包封率的方法，其包括以下步骤：
1)采用超滤离心系统分离出丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中的被包封部分；
2)采用高效液相色谱系统测定步骤1)中所分离出的被包封部分中的丙泊酚浓度，记为c；
3)采用高效液相色谱系统测定与步骤1)等量丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中的丙泊酚浓度，记为c0；
4)按以下公式计算包封率：包封率＝c/c0×100％。
优选地，所述步骤1)中采用超滤离心系统分离丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中的被包封部分时以水为溶剂；所述的超滤离心系统采用的超滤管为milliporeamiconultra-4ultracel-100k；所述丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的体积为10～2000μl。
更优选地，本发明所述测定丙泊酚中/长链脂肪乳注射液包封率的方法包括以下步骤：
1)采用超滤离心系统分离10～2000μl的丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中的被包封部分；
2)采用高效液相色谱系统测定步骤1)中所分离的被包封部分中丙泊酚的浓度，记为c，具体色谱条件为：c18色谱柱，流动相为乙腈-水体积比7:3的混合溶剂，检测波长为275nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，进样量为5μl；
3)采用高效液相色谱系统测定与步骤1)等量的丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中的丙泊酚浓度，记为c0，具体色谱条件为：c18色谱柱，流动相为乙腈-水体积比7:3的混合溶剂，检测波长为275nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，进样量为5μl；
4)按以下公式计算包封率：包封率＝c/c0×100％。
进一步优选地，步骤3)在测定前，先将丙泊酚中/长链脂肪乳注射液溶于有机溶剂，所述有机溶剂选自四氢呋喃、异丙醇中的一种或几种，优选地，所述有机溶剂为四氢呋喃-异丙醇体积比为5:3的混合液。
进一步优选地，步骤1)所述的分离包括以下步骤：
a)将超滤管用质量分数为50％的乙醇水溶液浸泡过夜，待用；
b)取本品0.2ml于超滤管中，加水1.8ml，在20℃3400g，250角转子，离心25min；
c)下层滤液弃去，上层加水2ml，机械振荡3min后，在20℃3400g，250角转子，再次离心25min，下层滤液弃去，上层液加水1ml，机械振荡3min后移至10ml容量瓶中，并用0.4ml水清洗2次，清洗液全部转移至10ml容量瓶中，以四氢呋喃-异丙醇(v/v，5:3)混合液定容。
有益效果
使用本发明的制备方法，对于亚微乳制剂，包封率是反应药物包封状态的重要指标。本发明所建立的方法，操作简单、数据重复性好，经工艺验证可有效区分样品的包封状态，具有很好的实用性。现有文献中，未检索到该品种的包封率检测信息，具有新颖性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
1.仪器、材料与试药
安捷伦1100型高效液相色谱仪、梅特勒xp56型百万分之一天平、sigma3k15离心机。milliporeamiconultra-4ultracel-100k(过滤体积4ml，nmwl：100kdal)超滤管。
1.2试药
待测样品：丙泊酚中/长链脂肪乳注射液，由发明人按照cn201210419120.6公开的原料比例自制，将处方量的油相及水相①通过蠕动泵进入均质机混合均匀后，加入水相②，搅拌混匀后，制成初乳，再经均质、过滤、充氮、灭菌制得成品，具体的所述待测样品的配置方法：
(1)油相的配置：
称取中链甘油三酯(mct)60g、油酸0.05g、丙泊酚10g、大豆油85g，至预热至70±5℃的进料罐，搅拌混匀后加入蛋黄卵磷脂(pl-100m)1g，充氮，剪切至pl-100m全溶。
(2)水相的配置：
水相①：称取10g甘油溶于10l水中，充氮，搅拌混匀，预热至70±5℃。
水相②：称取0.5gnaoh加入6.75l水中，置于70±5℃保温罐。
(3)油相及水相①通过蠕动泵恒速进入均质机混合均匀后，加入水相②，搅拌混匀后，在100bar的压力下高压均质6遍制成初乳，均质全程充氮，均质后将样品转至干净容器。
(4)均质结束后，迅速通入冷凝水使物料冷却至30～40℃。
(5)过滤：用1.2μm聚丙烯滤芯过滤2次。
(6)充氮，灌封。
(7)灭菌：用旋转式灭菌柜121℃高压蒸汽灭菌12分钟，即得成品。
制得的成品批号分别为：20090717-1、100804-5s、100804-10s、100804-15s。商品名为竟安的丙泊酚中长链脂肪乳注射液购自费森尤斯卡比，批号：16dc0082。商品名为力蒙欣的丙泊酚长链脂肪乳注射液购自西安立邦，批号：0808261。工作对照品：丙泊酚原料由上海医药集团股份有限公司提供，产品号：49340790792，ndc12502-4934-0。
2、检测方法
采用高效液相色谱法检测。
色谱条件
采用agilent的xdb-c18(4.6×150mm，5μm)作为色谱分离柱；乙腈-水(v/v，7:3)为流动相；检测波长为275nm；柱温为25℃；流速为1.0ml/min；进样量为5μl。
测定法
将超滤管(amiconultra-4)用50％乙醇水溶液浸泡过夜，待用。
取待测样品0.2ml于10ml容量瓶中，加四氢呋喃-异丙醇(v/v，5:3)混合液溶解并定容，采用高效液相色谱进样测定其中丙泊酚的浓度，记为c0。
另取待测样品0.2ml于超滤管中，加水1.8ml，20℃离心25min(3400g，250角转子)。下层滤液弃去，上层加水2ml，机械振荡3min。
在机械振荡3min后，以相同条件在20℃以3400g，250角转子，再次离心25min，下层弃去，上层液加水1ml，机械振荡3min后移至10ml容量瓶中，并用水清洗2次(每次0.40ml水)，清洗液全部转移至10ml容量瓶中，以四氢呋喃-异丙醇(v/v，5:3)混合液定容。采用高效液相色谱在上述色谱条件进样测定其中被包封的丙泊酚的浓度，记为c。
包封率％＝c/c0×100％。
3、本方法的重复性验证
在一日内，对同一批样品(批号：20090717-1)平行取6份样品，对其进行包封率测定，结果如表1所示。
表1、样品20090717-1的包封率检测方法重复性(日内)
在三日间，对同一批样品(批号：20090717-1)进行包封率测定，连续检测三天，每天平行3份，实验结果如表2所示。
表2、样品20090717-1的包封率检测方法重复性(日间)
上述实验通过对同一批样品，在同一天，独立取样3份进行检测，以及在不同天，每天独立取样三份进行检测，对比这些数据的相对标准偏差，结果证明，本方法的重现性好。
4、采用本方法对不同样品进行检测
表3包封率测定结果
采用上述的检测方法对不同样品进行检测，表3所示结果，表明，所建立的方法，对不同来源样品，包封率检测具有区分力。
5、分离验证
采用上述包封率测定方法基于丙泊酚中/长链脂肪注射液中，被包封及未包封游离丙泊酚大小不同的特性，丙泊酚微乳溶液经过超滤离心后，被包封的丙泊酚因为粒径大，会截留在离心管的超滤膜上层，而游离的丙泊酚分子量小，会被甩到离心管的超滤膜下层或被吸附到超滤膜上。我们通过以下实验，对上述理论进行了验证。
取125μg/ml丙泊酚水溶液2ml(即250μg)于超滤管中。超滤离心后移出下层滤液(约2ml)；上层加水2ml，涡旋混合3min。上下层液均取出100μl于hplc进样检测。重复上述操作2次，获得离心三次，上下层的数据。平行操作做2次，得到第一份和第二份的实验结果，见表4。hplc测试上下层残留丙泊酚的质量分数如下：
表4测定方法可行性的考察
由以上试验结果可知：超滤膜可吸附大部分的游离丙泊酚，被吸附的游离丙泊酚解吸附量很小。离心2次后，上层几乎不残留游离丙泊酚(丙泊酚残留质量分数<1％)。本发明所述的测试方法可行。
并且，上述结果表明，本发明采用的超滤管，经2次离心清洗之后，对游离药物的截留或残留，可以忽略不计。因此，本发明的包封率测定方法能直观表现被包封丙泊酚中/长链脂肪乳及未包封游离丙泊酚的分离。
6、与葡聚糖凝胶法的结果比较
参考cn201110444547.7中公开的硫酸长春新碱包封率的测定方法，我们尝试采用葡聚糖凝胶(sephadexg25柱)法，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液样品20090717-1按照下述测试方法进行测定丙泊酚脂肪乳包封率。
操作过程：取法玛西亚公司生产的葡聚糖凝胶sephadexg25适量，加适量去离子水室温溶胀至少24小时。待充分溶胀后，大量去离子水洗涤，直至上层液澄清为止。将sephadexg25装入层析柱(1.0cm×30cm)中，填装柱高20cm。
打开葡聚糖凝胶柱流出阀，使柱液面刚好下降至凝胶层凹面处，取丙泊酚中/长链脂肪乳注射液0.5ml，缓慢滴加样品于葡聚糖凝胶层析柱顶端，再打开流出阀(同时收集流出液)，使样品液面下降至凝胶层凹面以下，滴加去离子水，旋紧凝胶柱，洗脱液洗脱，流速0.5ml·min-1，紫外检测器245nm处检测吸光度。前20ml以去离子水为洗脱液洗脱，后20ml以10％乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，置量瓶中，乙腈溶解或经适当稀释，定容至50ml，用0.45μm滤膜过滤后，hplc测定丙泊酚浓度，平行试验3次，结果取平均值，得被包封的药物量。
另，精密量丙泊酚中/长链脂肪乳注射液0.5ml到50ml，用四氢呋喃:异丙醇(v/v，5:3)混合液作为稀释剂制成1ml中约含丙泊酚100μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。
另配制浓度约为100μg/ml的丙泊酚乙腈溶液，作为，作为对照品溶液。精密量取上述供试品溶液和对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的含量，按包封率测定取样量折算，即得所取体积的乳液中总药物量。
按照下述包封率计算公式：
如表5所示，葡聚糖凝胶法的实验结果无法使游离药物与包封药物分离，各批样品检测结果，包封率基本为100％，无法分离包封与游离药物。
表5葡聚糖凝胶法的实验结果
该实验结果表明，葡聚糖凝胶法对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的包封率的测定不可行。