一种小型模块化多色流式细胞分析仪的制作方法

本发明涉及一种流式细胞分析仪，尤其是一种小型模块化多色流式细胞分析仪，属于生命科学和医学技术领域。

背景技术：

流式细胞分析仪是一种生物细胞分析和计数仪，可将液流内生物细胞穿过由激光器发射的一个或多个激光束，分析其物理和化学特性。对生物细胞进行荧光标记，然后在相应波长处经激光器激发发射光线。探测并测量荧光和散射光，以确定细胞的各种特性，流式细胞分析仪每秒可分析成千上万个细胞。

流式细胞分析仪通常由液流系统、光学系统和电子系统构成；液流系统以液流形式将细胞线性排列并传输穿过用于激发荧光的激光束，能够分析任何亚微米至100μm以上大小的细胞的。光学检测系统由一个或多个激光器构成，所发射激光被荧光标记细胞吸收并产生荧光，或被细胞散射。细胞发射的荧光、以及前向和侧向被细胞散射的激光分别通过透镜收集。光学反射镜可将光信号引至相应探测器，如光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管探测器(APD)或PIN二极管探测器(P型半导体区和N型半导体区之间具有较宽未掺杂本征半导体区的二极管)。电子系统能够将检测到的光信号转换成电子信号以供计算机处理，收集每个细胞的数据，根据荧光和光散射特性确定细胞特性。通过对大量细胞进行分析，以获取细胞群间异质性和不同亚群的信息。数据往往用单参数Histograms直方图或相关参数图呈现，其中相关参数图也称为Cytograms图，其又包括散点图、等高线图和密度图。

流式细胞术已被广泛应用于诊断白血病和人类免疫缺陷病毒(HIV)，也被广泛应用于基础研究和临床试验，如分子生物学、免疫学和病理学。流式细胞术已成为移植、肿瘤学、血液学、遗传学和产前诊断等方面的重要实验室过程，此技术也有助于识别细胞表面蛋白变体。

传统流式细胞分析仪因系统构造复杂，体型较大。实验室内工作台空间往往较为宝贵，特别是需要在实验室内放置很多诊断仪器并必须对客户和患者进行多项试验时，工作台空间就变得更加珍贵。通常而言，中心实验室需要布置多台流式细胞分析仪，那么仪器尺寸将成为一个更严重问题。

技术实现要素：

本发明的目的：旨在提供一种能够处理多达五十种颜色荧光标记细胞的小型化流式细胞分析仪。此类流式细胞分析仪更便携、更易于管理、成本维护更低并在中心实验室、医院和诊所内更方便用户使用。

本发明的另一个目的是提供一种更可靠、更节能的仪器，其采用更节能和功耗更低的光电元件与电子元件，实现了更佳屏蔽性能，降低了电磁辐射(EMI)。

这种小型模块化多色流式细胞分析仪，包括：

一个用于发射激光束的激光系统；

一个用于接收激发区激光束的流式细胞液流系统，在液流激发区，荧光细胞散射和吸收入射的激光，并发射荧光；

一个用于收集荧光的光纤组件和一个含有色散元件和探测器组件的光学系统，其中色散元件用于接收来自光纤组件的荧光并将色散光谱射向探测器组件。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

将激光系统、流式细胞液流系统和光学探测系统集成为流式细胞分析仪的光学板组件。

所述的流式细胞分析仪，其中探测器组件包括：

一个用于接收荧光光谱的光电探测器阵列，其中光电探测器阵列包括多个通道；用于将光电探测器阵列产生的电流信号转换成对应于每个通道的输出电压信号而配置的跨阻放大器电路。

所述的流式细胞分析仪，其中探测器组件还包括：

耦合至跨阻放大器电路的多个模数转换器，其中将每个跨阻放大器电路耦合至不同模数转换器。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

为测量穿过液流系统激光激发区的细胞或颗粒产生的脉冲，配置模数转换器以足够较高频率对跨阻放大器进行采样。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

液流系统至少包括13种荧光颜色；和流式细胞分析仪的正面宽度为550mm或以下。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，包括一个或多个激发激光器。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中激发激光器属于半导体激光器。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：半导体激光器并排定位于同一位置；并和半导体激光器输出光束共线排列，用于激发液体流中的细胞。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，还包括：一种与荧光采集透镜直接接触的流动室窗口。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中荧光采集透镜面对流动室的数值孔径大于1.0。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中光纤组件包括一个荧光采集光纤，输入数值孔径至少为0.10，输出数值孔径至少为0.10。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中可通过集成光纤透镜调节光纤输入数值孔径。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中光纤组件的纤芯直径为800μm或以下。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中光纤组件的纤芯直径为600μm或以下。

根据以上技术方案提出的这种小型模块化多色流式细胞分析仪，与目前普遍使用的流式细胞分析仪相比较具有以下特点：

1、提供一种能够处理多达五十种颜色荧光标记细胞的小型流式细胞分析仪。因此，此类流式细胞分析仪更便携、更易于管理、成本维护较低并在中心实验室和许多医院和诊所内更方便用户使用。

2、由于采用更节能和功耗较低的光电元件与电子元件，实现了更佳屏蔽性能，降低了电磁辐射(EMI)。一种可靠仪器在医疗急救环境中的应用非常重要，而低电磁辐射仪器在临床应用环境中至关重要，因为可降低对其他救生仪器的干扰。

附图说明

图1为本发明的整体结构示意图(左透视、前透视和顶透视图)；

图2为本发明的整体结构示意图(前透视、右透视和顶透视图)；

图3为模块化多色流式细胞分析仪的前视图；

图4为模块化多色流式细胞分析仪的后视图；

图5以模块化多色流式细胞分析仪顶视图形式呈现了光学板组件；

图6为探测器阵列信号链示意图。

图中：100-模块化流式细胞分析仪 110-光学板组件 120-液流组件 130-试样注入管组件 140-样品台 150-电气面板组件 160-光栅组件 170-激光器系统 170A-半导体激光器 170B-半导体激光器 170C-半导体激光器 199-模块外壳 299-内层搁架 308-流式细胞液流系统流动室 309-穿板式连接器310-手动进样口 340-样品台 411-数据采集子系统 412-电源模块 420-插卡座 421-主板 422-从板 510-双色分光镜 513-采集透镜 514-前向散射探测器 515-侧向散射探测器 516-光纤输入端 516A-光纤输入端 516B-光纤输入端 516C-光纤输入端 517-光纤组件 517A-光纤组件 517B-光纤组件517C-光纤组件 518-小型准直透镜 519-光栅 520-探测器组件 530A-光束整形器 530B-光束整形器 530C-光束整形器 532-反射镜 532A-反射镜532B-反射镜 532C-反射镜 570-激光束 570A-激光束 570B-激光束 599-直射激光 599A-激光束 599B-激光束 599C-激光束 601-光线 610-光谱色散开的光束 621-探测器阵列 622-跨阻放大器电路 623-跨阻偏置电压 624-模数转换器 625-信号脉冲 626-电磁辐射屏蔽 635-输出波形。

具体实施方式

以下结合说明书附图进一步阐述本发明并给出本发明的实施例。

如图所示的这种小型模块化多色流式细胞分析仪，包括：

一个用于发射激光束的激光系统；

一个用于接收激发区激光束的流式细胞液流系统，在液流激发区，荧光细胞吸收和散射入射的激光束，并发射荧光；

一个用于收集荧光的光纤组件和一个含有色散元件和探测器组件的光学系统，其中色散元件用于接收来自光纤组件的荧光并将色散光谱射向探测器器组件。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

将激光系统、流式细胞液流系统和光学探测系统集成为流式细胞分析仪的光学板组件。

所述的流式细胞分析仪，其中探测器组件包括：

一个用于接收荧光光谱的光电探测器阵列，其中光电探测器阵列包括多个通道；用于将光电探测器阵列产生的电流信号转换成对应于每个通道的输出电压信号而配置的跨阻放大器电路。

所述的流式细胞分析仪，其中探测器组件还包括：

耦合至跨阻放大器电路的多个模数转换器，其中将每个跨阻放大器电路耦合至不同模数转换器。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

为测量穿过液流系统激光激发区的细胞或颗粒产生的脉冲，配置模数转换器以足够较高频率对跨阻放大器进行采样。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

液流系统至少包括13种荧光颜色；和流式细胞分析仪的正面宽度为550mm或以下。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，包括一个或多个激发激光器。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中激发激光器属于半导体激光器。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中：

半导体激光器并排定位于同一位置；并和半导体激光器输出光束共线排列，用于激发液体流中的细胞。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，还包括：一种与荧光采集透镜直接接触的流动室窗口。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中荧光采集透镜面对液流的数值孔径大于1.0。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中光纤组件包括一个荧光采集光纤，输入数值孔径至少为0.10，输出数值孔径至少为0.10。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中可通过集成光纤透镜调节光纤输入数值孔径。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中光纤组件的纤芯直径为800μm或以下。

所述的小型模块化多色流式细胞分析仪，其中光纤组件的纤芯直径为600μm或以下。

为透彻理解本发明，以下本发明实施例详细说明提出了许多具体细节。但很明显，对于所述技术领域的技术人员而言，可以在没有这些具体细节的情况下实施本发明的实施例。在其它实例中，未详细说明公知方法、过程、组件和电路，以避免使本发明的实施例难以理解。

图1为小型模块化多色流式细胞分析仪100的左透视、前透视和顶透视图。模块化流式细胞分析仪100含有一个模块外壳199，而光学板组件110安装于模块外壳199顶部。模块化流式细胞分析仪100还包括一个试样注入管(SIT)组件130、一个样品台140、一个带电源的电气面板组件150和一个安装于模块外壳199中或内部的液流组件120。模块化流式细胞分析仪100还包括多个光栅组件160、一个含激光发射器的激光器系统170和一个流式细胞液流系统308。

图2为小型模块化多色模块化流式细胞分析仪100的前透视、右透视和顶透视图。

图2中透视图进一步说明了试样注入管组件130、样品台140和光栅组件160，包括设置在模块外壳199顶部以及设置在模块外壳顶部以下内层搁架299上的光栅组件。三个光栅组件160对应于激光系统的三个激光器170；另外，每个光栅组件可对应于激光系统的任意一个激光器170。另一个实施例包括其它数量(即四个)光栅组件160，视所使用激光系统的激光器数170或流式细胞分析仪100的其他配置而定。

图3为小型模块化多色模块化流式细胞分析仪100的前视图。模块化流式细胞分析仪100宽520mm，高530mm，不包括加载器时深约500mm，包括加载器时深约640mm。

该尺寸实现了一个典型实验室工作台，即长72英寸(1829mm)，深24英寸(610mm)，此实验室工作台可并排放置三台模块化流式细胞分析仪100。

图5为模块化流式细胞分析仪100光学板组件110的顶视图。光学板组件110含有一个激光系统170，该激光系统包括向流式细胞液流系统流动室308发射激光的三个半导体激光器170A、170B和170C。

激光系统170以共线方式向流式细胞液流系统流动室308发射多束(如三束)激光。但是，多束激光相互略有偏移。激光系统170含有三个半导体激光器170A、170B和170C，波长一般为405nm、488nm和640nm。405nm半导体激光器输出功率通常大于30mW；488nm半导体激光器输出功率通常大于20mW；640nm半导体激光器输出功率通常大于20mW。电子控制器控制半导体激光器在恒定温度和恒定输出功率条件下运行。

光学系统能够在空间上操纵分别由半导体激光器170A、170B和170C生成的激光束570A、570B和570C。光学系统包括透镜、棱镜和反射镜，能够将激光束聚焦至携带生物细胞的细胞液流上。穿过细胞液流的聚焦激光束横向大小为50-80μm，而顺着流式细胞液流系统流动室308中液流方向的聚焦激光束大小为5-20μm。如图5所示，光学系统含有光束整形器530A-530C，分别接收由半导体激光器170A-170C发射的激光。将从光束整形器530A-530C输出的激光分别耦合至反射镜532A-532C，向流式细胞液流系统流动室308直射激光599A、599B和599C，并射入流式细胞液流系统流动室308，射向目标颗粒(如生物细胞)。激光599A、599B和599C彼此略有偏离，但经反射镜532A-532C后直接大致沿着液流方向平行进入流式细胞液流系统流动室308。

激光束599A、599B和599C到达流式细胞液流系统流动室308内细胞流中的生物细胞(颗粒)后，被细胞流中的细胞散射和吸收。并产生荧光。前向散射探测器514收集轴上散射光。采集透镜513收集离轴散射光和荧光并将这些光线一起入射至双色分光镜510。分光镜510将离轴散射光引致侧向散射探测器515，将细胞发射的荧光聚集到至少一个光纤输入端516。至少有一个光纤组件517将细胞荧光引向一个或多个光栅组件160。

若要使用不同荧光染料和激光波长对生物样品进行更详细分析，可使用多个光纤输入端516、多个光纤组件517和多个光栅组件160。可平行布置三个光纤输入端516A、516B和516C，用于接收荧光，并且可使用三个光纤组件517A、517B和517C将荧光入射至三个光栅组件160A、160B和160C。

因为三个激光束599A、599B和599C略有位置偏移(即非精确共线)，可同时启用三个光纤输入端516A、516B和516C(三个光纤组件517A、517B和517C)分别聚集收集来自具有三种不同波长的三个激光束599A、599B和599C产生的荧光数据。随后，三个光纤组件517A、517B和517C将荧光入射至三个不同光栅(即三个不同光栅519)。

该模块化流式细胞分析仪100也可使用同一个光栅519收集所有荧光数据。例如，三个光纤组件517A、517B和517C将荧光入射至同一个光栅519，而非三个不同光栅(即三个不同光栅519)，然后进行数据处理操作，分离荧光数据，而不是使用三个不同光栅分离荧光数据。从硬件备置角度而言，使用一个光栅的复杂性较低。但是，数据处理操作较为复杂，因为分离荧光数据便需要更多数据操作(即识别不同波长，并分离相应光束数据)。

通过分析前向散射数据和侧向散射数据可对细胞几何特性进行分类。使用400nm至900nm可见光波长染料对液体流中的细胞进行标记。经激光器激发后，染料产生的荧光由光纤组件517收集并传输至光栅组件160。模块化流式细胞分析仪100通过小型半导体激光器170、11.5倍采集透镜513和光电倍增管(PMT)阵列/雪崩光电二极管(APD)光栅组件160实现了体积相对袖珍的光学板组件。11.5倍采集透镜513的焦距短，面对荧光发射时的数值孔径(NA)约1.3，面对采集光纤时的数值孔径约0.12，可显著降低仪器深度。同时，光栅组件160用结构紧凑型印刷电路板(PCB)阵列探测器取代了传统单光电倍增管滤光片，从而免除了探测模块内部或端部反射镜和滤光片的空间占用。

光栅组件输入端的小型准直透镜518将光纤中的荧光入射至衍射光栅519。采集光纤组件517的纤芯直径约400μm至800μm，纤芯直径约600μm时的光纤数值孔径约为0.12mm。为便于使用较小接收面的探测器而不影响探测效率，可将光纤输出端逐渐缩小至纤芯直径约100μm至300μm，用于控制在光电探测器上的成像尺寸。也可在采集光纤输入端集成光纤透镜、增加采集数值孔径，以允许使用约400μm以下的纤芯直径。由于光纤具有灵活性，可将光线传输至系统内的任何地方，所以使用光纤采集荧光可以优化小型流式细胞分析仪100接收探测器组件520和电子元件的位置。光栅519至少在200nm波长宽度范围内具有平坦衍射效率，最好在350nm至850nm可见光波长范围内有400nm波长宽度的平坦衍射效率。

另外，可将双色分光镜与两个光栅519合用，通过双色分光镜将较宽波长范围荧光分成两个光谱范围，其中一个光谱范围为350nm至600nm，另一个光谱范围为600nm至850nm。这样，使用两个光栅可对任一光栅的衍射光谱范围要求减半；也可使用其它色散元件，如线性渐变长通滤光片，以取代光栅519使荧光色散。

图6为模块化流式细胞分析仪100中三个可配置的探测器阵列信号链中至少一个探测器阵列信号链的示意图。将来自小型准直透镜518的荧光光线601耦合至光栅519。光栅519将荧光601色散成光谱610，并直接聚焦至印刷电路板上的光电探测器阵列621。每个探测器阵列621至少设有两组探测器以线形排列，且每组探测器通常为8个通道。例如，图6中的探测器阵列621设有两组通道，每组8个通道，共16个通道。在另一个实施例中，印刷电路板配置的探测器阵列可能含有8个通道、9个通道、10个通道或其它数量通道。

每个通道设有一个跨阻放大器电路622，可将探测器产生的电流转换成输出电压信号。在每个通道内，将跨阻放大器电路622输出电压信号耦合至模数转换器(ADC)624。模块化流式细胞分析仪100能够控制每个通道跨阻放大器电路622中跨阻偏置电压623，以调节生成的输出电压。然后，模块化流式细胞分析仪100将各跨阻偏置电压623耦合至各模数转换器624。

为测量穿过激光激发区的液流颗粒(即生物细胞)产生的脉冲625，模数转换器以足够较高频率对跨阻放大器622的输出电压进行采样。模数转换器624的输出脉冲随着时间的推移形成多个输出波形635。为保持信号完整性并降低噪声，模块化流式细胞分析仪100对每个通道跨阻放大器和模数转换器之间的差分信号线应用了电磁辐射(EMI)屏蔽626。

再次参考图2，流式细胞分析仪100含有三个光栅组件160。如果每个阵列设有8个通道，则流式细胞分析仪100共有24个通道(3个光栅组装阵列x8个通道/阵列)。如果每个阵列设有16个通道，则流式细胞分析仪100共有48个通道(3个光栅组装阵列x16个通道/阵列)。

再次参考图3，流式细胞分析仪100含有液流系统，位于模块液流组件120内、流式细胞分析仪100前部并靠近流式细胞液流系统流动室308。所有液流相关组件集中在一起可最大限度地减少管路长度(和其它与液流有关的辅助部件，如防溅罩和液流管道管理部件)，并且将液流与对潮湿敏感的电子和光电子部件隔离。用于输入鞘液和输出废液的液体输入/输出(I/O)端口的穿板式连接器309与液流系统120配置于流式细胞仪100的前部，而非侧面板或被面板。这样，能够节省空间，易于与输入鞘液和输出废液的容器连接。模块化的液流组件120易于拆卸，以便售后服务与维修。

在使用过程中，液流系统将液流中颜色标记的细胞排成一列供激光束激发。在此流式细胞分析仪100中，一台激光器可以同时激发10种以上颜色标记，三台激光器可同时激发、检测和分析20种以上的颜色标记，其标记数量只局限于可提供的荧光染料的种类。由于在探测系统中用色散元件代替固定波长的滤光片来检测信号，流式细胞分析仪100能支持的细胞颜色标记数量几乎没有限制。通常而言，基于市场上可用流式细胞分析仪染料，激光器小型流式细胞分析仪100可容纳14种以上颜色。

试样注入管(SIT)组件130减少了取样交换空间并增加了Z轴功能，通过允许样品台与手动进样口310共用空间，显著降低样品台140的尺寸。为了缩小流式细胞分析仪100的宽度，样品台340采用x-级电机，这比传统使用的x-y电机更简捷方便。

图4为模块化流式细胞分析仪100的后视图。

模块化流式细胞分析仪100使用一个专用、可扩展、最先进的数据采集子系统411，如图4所示。数据采集子系统411含有一块主板421和多达五块与主板421耦合的从板422。主板421与从板422不同，因为主板含有用于处理通信功能的附加组件。

在一个模块化流式细胞分析仪100的48通道实施例中，所有主板421和从板422均配有用于检测荧光的16-位精度模数转换电路，用于检测前向散射光(FSC)的12-位精度模数转换电路。数据采集子系统411含有一个插卡座420，用于接收6块电路主板421和从板422(1块主板和5块从板)，插卡座420宽约250mmx高183mmx深117mm。

流式细胞分析仪100由电源模块412供电。在一个实施例中，就48通道实施例而言，电源模块412由三个低噪声模拟电源和一个通用电源。低噪声模拟电源为信号检测电子元件提供低噪声电源。通用电源为数据采集、液流、试样注入管和样品台电子元件供电。

经实际应用表明：采用上述技术方案提出的这种小型模块化多色流式细胞分析仪，不仅能够实现多达五十种颜色实现荧光标记细胞，而且使分析仪更便携、更易于管理，成本维护更低并在中心实验室和许多医院和诊所内更方便用户使用，从而达到了本发明的第一个发明目的。同时，由于采用更节能和功耗更低的光电元件与电子元件，实现了更佳屏蔽性能，降低了电磁辐射(EMI)，达到了安全可靠、可降低对其他救生仪器的干扰的第二个发明目的。

小型模块化流式细胞分析仪的实现，通过了模块化设计、子系统协同效应的优势利用以及当代技术的创新使用，缩小了各个关键部件的尺寸，达到了与传统细胞分析仪的同等或更佳性能。

上文对本发明的实施例进行了说明。虽然本说明书已对本发明的实施例进行了郑重说明，但上述实施例不应理解为对本发明的限制，而应按照权利要求所公开的技术方案进行理解。

尽管上文已经描述了本发明的实施例并用附图予以呈现，但可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，且本发明的实施例不局限于本文所呈现和所描述的特定结构和布置。本领域的一般技术人员可对上述实施例进行修改。任何采用本发明设计原理提出的相应设计均应视为与本发明类同。