一种淋巴细胞染色体G带的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种淋巴细胞染色体g带的制备方法。

背景技术：

染色体核型分析是指将待测细胞的染色体按照该生物固有的染色体形态特征和规定，进行染色体数目、形态特征的分析，确定其是否与正常细胞核型完全一致的过程。染色体核型分析属于形态学范畴，通过人工分析，找出染色体在宏观的形态学上的异常，比如缺失、增加、倒位或易位，以此为临床提供诊断依据。人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术(bandingtechnique)。上世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，根据不同的制备流程，染色体显带方法分为q带、g带、r带、c带、t带、n带，其中较为常用的是g带，因为它主要是被giemsa染料染色后而显带，故称之为g显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上，每条染色体都有较为恒定的带纹特征，所以g显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。关于g显带的机理目前有多种说法，例如，lee等(1973)认为染色体上与dna结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和dna结合牢固的区段可被染成深带。有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接到观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。一般认为，易着色的阳性带为含有at多的染色体节段，相反，含gc多的染色体段则不易着色。

目前染色体核型分析g显带制备常用的流程为：取适量外周血，根据不同的细胞浓度接种培养，放入温箱68-74小时后收获，先加秋水仙素，1.5小时后倒入离心管，离心去上清，加低渗液，温箱低渗至少30分钟，然后预固定，再离心再固定，反复两次，细胞沉淀后吸取固定液，留取细胞悬液进行滴片。传统滴片方法为：将载玻片平放于桌面，手持滴管吸取细胞悬液，于40厘米高空处向载玻片头体尾三处各滴一滴，然后载玻片在酒精灯上方过火，过火时尽量使玻载片上的固定液【由甲醇与乙酸(体积比)3：1构成】燃烧，但同时不能使载玻片在火焰上方烘烤过热，过火过度与不足都会导致效果不好。载玻片着火干燥后，放在室温下过夜，隔天进行显带。g显带液由ph值为5.8-6.0之间的磷酸盐缓冲液和0.025％的胰蛋白酶构成，显带液倒入染色缸，在水浴箱内升温至37度，放入载玻片，40-43秒取出，生理盐水涮洗显带液，再进行game染色4-6分钟。传统方法有四处不足，第一，低渗时间通常设定在30分钟甚至更长，操作者往往因一个上午无法完成滴片前的所有实验步骤而必须中午加班。第二，高位滴片不好把握，头体尾三个位置不可能滴的非常准确，可能有重叠部分，甚至会滴到片外造成浪费，很难标准化。第三，因为过火导致片子老化程度不固定，过火的火候无法掌握，难以标准化。第四，片子放在室温下过夜，会受季节气候的影响，造成染色体老化程度不固定，导致分裂像质量不稳定。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种更省时、标准化、分散程度高、分裂相的质量更好，带纹更清晰易分析的淋巴细胞染色体g带的制备方法，且实验流程标准化、操作简单，效果稳定可控。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种淋巴细胞染色体g带的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：接种

1.1.取外周血，接种于3ml含小牛血清的淋巴细胞培养液中，于37℃恒温培养68-74h；

1.2.于终止培养前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培养液的混合液；

步骤2：收获细胞

2.1.将步骤1.2得到的血液和培养液的混合液，倒入离心管内，1500r/min离心10-15min，取出，弃去上清；

2.2.低渗：加入已预温至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混匀，再于37℃恒温孵育12min；

步骤3：细胞固定

3.1.加入固定液2ml，混匀，静置2min，1500r/min离心10-15min；

3.2.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置30min，1500r/min离心10-15min；

3.3.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置2-3h，1500r/min离心10-15min；

3.4.取出，弃去上清，加入固定液，混匀，制成细胞悬液；

步骤4：制片

4.1.滴片：将步骤3.4制成的细胞悬液充分混匀，将细胞悬液滴于玻片左侧1/3处，随后将玻片向右下倾斜，待细胞悬液自然扩散直至布满整张玻片；

4.2.将玻片水平放置，于60-70℃干燥烘烤过夜或75-80℃烘烤3h，经胰酶消化和吉姆萨染色，即得所述淋巴细胞染色体g带。

本发明的方法，实验流程标准化、操作简单，效果稳定可控。其中步骤(2)中，细胞收获过程中，采用0.075mol/l的kcl，作用12分钟实现了短时间高效率的低渗处理。低渗处理是利用渗透压原理使已转化的淋巴细胞充分膨胀，细胞膜破裂而保留完整的核膜，同时使全血标本中的红细胞破裂，以达到获得更多中期分裂相的目的。此外，本发明人发现，越长的低渗时间对最终获得中期分裂相的数目并没有显著影响，经多次实验探索，将低渗时间定为12分钟一样获得理想的效果。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1.1中，所述外周血为0.3-0.8ml。

进一步，步骤4.1中，所述滴片的环境温度为25℃，湿度为50-70％；所述细胞悬液滴于玻片前，与玻片的距离小于2cm；所述玻片为冰水混合物浸泡过的冰玻片。

采用上述进一步的有益效果是：上述方法，解决了现有技术中高位滴片造成的细胞浪费、滴片位置不准、细胞叠加分散不良等种种弊端，提高了细胞悬液利用率，更容易操作；适宜的滴片环境温湿度以及湿润的冰玻片更有利于细胞悬液的扩散，使细胞分散更好。其中，冰水混合物浸泡过的冰玻片指的是，将玻片浸泡在冰和水按体积比1:1混合后的混合物中0.5h以上。

进一步，步骤4.2中，所述玻片水平放置的工具为烤片架，所述干燥过夜的温度为65℃。

采用上述进一步的有益效果是：恒温烤片大大减小了过火处理导致片子老化程度的不固定性，减小因更换操作者对实验结果的影响，更容易实现标准化操作。

本发明的有益效果是：

1.本发明的整个流程不仅标准化，效果稳定可控，在保证分裂相质量的前提下，更短的细胞低渗时间使制片前的所有实验步骤可以在一个上午或下午完成，避免了工作人员加班。

2.本发明的细胞悬液低位滴于冰玻片的方法，解决了现有技术中高位滴片造成的细胞浪费、滴片位置不准、细胞叠加分散不良等种种弊端，提高了细胞悬液利用率，更容易操作。

3.本发明用恒温烤片大大减小了过火处理导致片子老化程度的不固定性，减小因更换操作者对实验结果的影响，更容易实现标准化操作。

4.本发明的制备方法简单，市场前景广阔，适合规模化生产。

附图说明

图1为本发明的实验组1-1的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

图2为本发明的实验组1-2的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

图3为本发明的实验组1-3的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

图4为本发明的对照组1的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

图5为本发明的实验组2-1的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

图6为本发明的实验组2-2的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

图7为本发明的对照组2的淋巴细胞染色体g带的镜下g带图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例的淋巴细胞染色体g带的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：接种

1.1.取0.3ml外周血，接种于3ml含小牛血清的淋巴细胞培养液中，于37℃恒温培养68h；

1.2.于终止培养前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培养液的混合液；

步骤2：收获细胞

2.1.将步骤1.2得到的血液和培养液的混合液，倒入离心管内，1500r/min离心10min，取出，弃去上清；

2.2.低渗：加入已预温至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混匀，再于37℃恒温孵育12min；

步骤3：细胞固定

3.1.加入固定液2ml，混匀，静置2min，1500r/min离心10min；

3.2.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置30min，1500r/min离心10min；

3.3.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置2-3h，1500r/min离心10min；

3.4.取出，弃去上清，加入固定液，混匀，制成细胞悬液；

步骤4：制片

4.1.滴片：环境温度为25℃，湿度为50％，将步骤3.4制成的细胞悬液充分混匀，距离玻片的距离小于2cm，将细胞悬液滴于玻片左侧1/3处，随后将玻片向右下倾斜，待细胞悬液自然扩散直至布满整张玻片；

4.2.将玻片水平放置于烤片架上，于60℃干燥烘烤过夜或75℃烘烤3h，经胰酶消化和吉姆萨染色，即得所述淋巴细胞染色体g带。

实施例2

本实施例的淋巴细胞染色体g带的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：接种

1.1.取0.5ml外周血，接种于3ml含小牛血清的淋巴细胞培养液中，于37℃恒温培养71h；

1.2.于终止培养前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培养液的混合液；

步骤2：收获细胞

2.1.将步骤1.2得到的血液和培养液的混合液，倒入离心管内，1500r/min离心12min，取出，弃去上清；

2.2.低渗：加入已预温至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混匀，再于37℃恒温孵育12min；

步骤3：细胞固定

3.1.加入固定液2ml，混匀，静置2min，1500r/min离心12min；

3.2.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置30min，1500r/min离心12min；

3.3.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置2-3h，1500r/min离心12min；

3.4.取出，弃去上清，加入固定液，混匀，制成细胞悬液；

步骤4：制片

4.1.滴片：环境温度为25℃，湿度为60％，将步骤3.4制成的细胞悬液充分混匀，距离玻片的距离小于2cm，将细胞悬液滴于冰玻片左侧1/3处，随后将冰玻片向右下倾斜，待细胞悬液自然扩散直至布满整张冰玻片；

4.2.将冰玻片水平放置于烤片架上，于65℃干燥烘烤过夜或78℃烘烤3h，经胰酶消化和吉姆萨染色，即得所述淋巴细胞染色体g带。

实施例3

本实施例的淋巴细胞染色体g带的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：接种

1.1.取0.8ml外周血，接种于3ml含小牛血清的淋巴细胞培养液中，于37℃恒温培养74h；

1.2.于终止培养前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培养液的混合液；

步骤2：收获细胞

2.1.将步骤1.2得到的血液和培养液的混合液，倒入离心管内，1500r/min离心15min，取出，弃去上清；

2.2.低渗：加入已预温至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混匀，再于37℃恒温孵育12min；

步骤3：细胞固定

3.1.加入固定液2ml，混匀，静置2min，1500r/min离心15min；

3.2.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置30min，1500r/min离心15min；

3.3.取出，弃去上清，加入固定液8ml，混匀，静置2-3h，1500r/min离心15min；

3.4.取出，弃去上清，加入固定液，混匀，制成细胞悬液；

步骤4：制片

4.1.滴片：环境温度为25℃，湿度为70％，将步骤3.4制成的细胞悬液充分混匀，距离玻片的距离小于2cm，将细胞悬液滴于玻片左侧1/3处，随后将玻片向右下倾斜，待细胞悬液自然扩散直至布满整张玻片；

4.2.将玻片水平放置于烤片架上，于70℃干燥烘烤过夜或80℃烘烤3h，经胰酶消化和吉姆萨染色，即得所述淋巴细胞染色体g带。

实验例1

取同一样本经培养后的淋巴细胞进行对比实验，采用常规方法设立实验组1-1、实验组1-2、实验组1-3和对照组1，实验组分别采用同一浓度、同一吹打方法下不同的低渗时间，其中：

实验组1-1：低渗时间8分钟；

实验组1-2：低渗时间20分钟；

实验组1-3：低渗时间30分钟；

对照组1：低渗时间12分钟。

在镜下观察制片结果，使用的显微镜为zeissimager.z2，如图1-4所示，低渗时间12分钟时(对照组1，图4)细胞已充分膨胀，细胞膜破裂而保留了完整的染色体，缩短了制片时间且制片效果较好。

实验例2

取同一样本经培养后的淋巴细胞进行对比实验，采用常规方法设立实验组2-1、实验组2-2和对照组2，实验组分别采用同一浓度不同的滴片方法，其中：

实验组2-1：滴管口距离玻片40cm，玻片头、体尾部各一滴，待细胞悬液在载玻片上自然扩散，玻片快速经过酒精灯外焰至表面液体干燥；

实验组2-2：滴管口距离玻片20cm，玻片头、体尾部各一滴，待细胞悬液在载玻片上自然扩散，玻片快速经过酒精灯外焰至表面液体干燥；

对照组2：滴管口距玻片约1cm，将细胞悬液滴于冰玻片左侧约1/3处中心位置，此时玻片稍向右下倾斜，待悬液自然扩散至片尾直到布满整张玻片,平放于60-70℃干燥箱烤干过夜。

在镜下观察制片结果，使用的显微镜为zeissimager.z2，如图5-7所示，对照组2制片方法(图7)提高细胞悬液利用率、避免高位滴片造成的细胞浪费、滴片位置不准、细胞叠加分散不良等情况，制片效果比较好。

根据上述说明书的揭示，本申请所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。