新型全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置及标定方法与流程

本发明属于荧光显微镜成像领域，具体涉及一种新型全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置及标定方法。

背景技术：

全内反射荧光显微镜(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,tirfm)是近年来新兴的一种光学成像技术，该技术利用全内反射时产生的隐失波来激发荧光分子，以观察荧光标记样品在靠近交界面的极薄区域。由于隐失波场存在能量在轴向上呈指数衰减的特性，使得可观察区域的动态范围通常在200nm以下，有效地控制了激发体积，大大降低了背景光噪声干扰，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度。故此项技术目前已广泛应用于细胞膜表面物质的动态观察。

根据隐失波场的特性可知，当入射角越大时，产生的隐失波场的入射深度越浅。故每张全内反射荧光显微镜拍摄得到的二维投影图像中都含有丰富的三维信息。因此，确定出各个入射角对应的入射深度就显得尤为重要。

目前市场上的商业全内反射荧光显微镜无法提供激发光的入射角与tirf入射深度的对应信息。尽管全内反射荧光显微镜有个理论指数衰减模型，但这只是理想情况中的光学模型，并不适用于实际情况。此外，由于实验条件的差异，不同显微镜的轴向衰减模型也不尽相同。所以，建议一种方便快捷的全内反射荧光显微镜入射深度的系统标定方法就显得尤为重要。

目前，不少研究人员付出过精力来研究标定全内反射荧光显微镜的入射深度，比较常用的两种方法是荧光小珠子法和荧光大珠子法。荧光小珠子标定法的原理图如图1所示，其原理是选取a，b等若干个点放置荧光小珠子，每二者距离25nm。以一定的振镜电压v发射光线，测量得到a，b等处荧光的光强为i(a)和i(b)。将测得光强与荧光小珠子所在位置联立拟合曲线，得到i(z)-z曲线，根据公式(1)可以得到渗透深度d。

其难点在于需要特殊的工具来确保荧光小珠子之间的距离为25nm且需要制作工艺复杂且直径很小的荧光小珠子。

荧光大珠子标定法的原理图如图2所示，其原理是一定入射角下的激发光激发的隐失波场深度一定，当荧光珠子直径足够大，利用拍得的投影图即可推算出真实的入射深度。

这两种方法虽然能得到较好的标定结果，但是需要特殊的荧光珠子或实验工具，且后期还需要进行复杂的图像处理数据拟合等过程，使用方法不太方便。

环状全内反射荧光显微镜利用一个环状光圈形成tirf图像，它的优势在于减少了干涉条纹，快速多角度成像减少了3d成像以及单角度成像产生的色差。

epi指的是垂直式荧光显微镜。激发光以近乎垂直交界面的形式入射，使得进入样本区域的荧光强度仍旧非常强，可激发样本上标记出的全部荧光染料。

技术实现要素：

鉴于上述，本发明提供了一种全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，该装置结构简单、成本低，操作方便灵活。

一种全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，包括：

载玻片；

方形盖玻片，所述方形盖玻片盖于所述载玻片的上表面上且右侧边对齐布置；

玻璃片，所述玻璃片置于所述载玻片上且左侧边接触并对齐布置，所述玻璃片的下表面支撑于所述方向盖玻片上；

所述玻璃片的下表面均匀地涂布有荧光染料。

所述的玻璃片与载玻片的尺寸相同。

作为优选，所述的玻璃片的尺寸为25mm×75mm，为了克服荧光成像的点扩散效应，玻璃片上的荧光染料的厚度为8～12nm。

作为优选，所述的载玻片为electronmicroscopysciences公司生产的规格为25mm×75mm的载玻片。

作为优选，所述的方形盖玻片为fisherbrand公司生产的规格为18mm×18mm厚度为0.17mm的方形盖玻片。

本发明还提供了一种利用上述的标定装置对全内反射荧光显微镜入射深度进行标定的方法，具体步骤为：

(1)将标定装置置于可自由切换入射角的全内反射荧光显微镜的载物台上；

(2)将显微镜可视场区域边界在均匀涂有荧光染料的玻璃片的相应位置设为b点，将b点距离载玻片的距离定为z0；

(3)选择显微镜可视场区域范围内的任一一点作为标定的荧光目标点a，则荧光目标点a的实际深度za可表示为：

za＝z0+xtanα

其中，x为荧光目标点a与可视场区域边界之间的距离，α为均匀涂有荧光染料的玻璃片与载玻片之间的夹角；

(4)固定可视场区域，改变显微镜激发光的入射角θi，得到该入射角下的tirfm图像，进而得到荧光目标点a在tirfm图像的强度ia(tirfm)(θi)；

(5)改变显微镜激发光垂直射入，得到epi图像，进而得到荧光目标点a在epi图像的强度ia(epi)，则荧光目标点a在tirfm图像和epi图像中的强度比的对数值表示为：

其中，ia(0,θi)表示在激发光的入射角为θi时隐失波场在两种折射率的交界面处的光强，dp(θi)表示激发光的入射角为θi时的隐失波场的渗透深度，e约为2.718，对于入射角θi是个常量。

(6)选取一列不同的荧光目标点，通过步骤(4)与步骤(5)的方法获得每个荧光目标点在强度tirfm图像和epi图像中的强度比的对数值，再对所有荧光目标点在强度tirfm图像和epi图像中的强度比的对数值进行线性拟合，得到拟合直线的斜率的负倒数为入射角θi对应的渗透深度dp(θi)。

本发明为全内反射荧光显微镜标定入射角与渗透深度的对应关系提供了一种新思路，能有效确定全内反射荧光显微镜不同入射角下的入射深度。本发明具有操作简便、装置简单和标定效率高等特性。对实验条件无特殊要求，适用于各种类型的全内反射荧光显微镜的标定。

附图说明

图1是背景技术中荧光小珠子标定方法原理图；

图2是背景技术中荧光大珠子标定方法原理图；

图3是本发明全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置侧视图；

图4是本发明全内反射荧光显微镜入射深度的标定方法原理图。

具体实施方式

为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。

建立如图1所示的全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置，构建标定装置的主要设备为：尺寸为25mm×75mm且单面均匀涂有10nm厚的荧光染料的玻璃片、electronmicroscopysciences公司生产的规格为25mm×75mm的载玻片以及fisherbrand公司生产的规格为18mm×18mm厚度为0.17mm的方形盖玻片。在载玻片右侧叠放方形盖玻片，使两块玻片的右边缘对齐。然后在上方叠放玻璃片，并保证玻璃片的左边缘与载玻片左边缘对齐，且玻璃片的左端架在方形盖玻片上。从而保证涂有染料的玻片与底部载玻之间倾斜角α＝0.18°。

利用上述标定装置进行全内反射荧光显微镜入射深度进行标定的原理图如图4所示，①表示样品所处的液体环境，在本标定实验中，该区域的液体为水，折射率为1。②表示放置于显微镜载物台上的载玻片，其折射率为1.52。③表示的是显微镜目镜的可视场区域，目镜与载玻片之间为折射率和载玻片相匹配的油浸(即油浸折射率也为1.52)。

利用上述标定装置进行全内反射荧光显微镜入射深度进行标定的方法为：

步骤1，在全内反射荧光显微镜的目镜上涂上目镜油，该目镜油与载玻片的折射率相匹配；

步骤2，将标定装置置于可自由切换入射角的全内反射荧光显微镜的载物台上；

步骤3，将显微镜可视场区域边界在均匀涂有荧光染料的玻璃片的相应位置设为b点，将b点距离载玻片的距离定为z0；

步骤4，选择显微镜可视场区域范围内的任一一点作为标定的荧光目标点a，则荧光目标点a的实际深度za可表示为：

za＝z0+xtanα

其中，x为荧光目标点a与可视场区域边界之间的距离，α为均匀涂有荧光染料的玻璃片与载玻片之间的夹角；

步骤5，固定可视场区域，改变显微镜激发光的入射角θi，得到该入射角下的tirfm图像，进而得到荧光目标点a在tirfm图像的强度ia(tirfm)(θi)；

步骤6，改变显微镜激发光垂直射入，得到epi图像，进而得到荧光目标点a在epi图像的强度ia(epi)，则荧光目标点a在tirfm图像和epi图像中的强度比的对数值表示为：

其中，ia(0,θi)表示在激发光的入射角为θi时隐失波场在两种折射率的交界面处的光强，dp(θi)表示激发光的入射角为θi时的隐失波场的渗透深度，e为2.178，对于入射角θi是个常量。

步骤7，选取一列不同的荧光目标点，通过步骤(4)与步骤(5)的方法获得每个荧光目标点在强度tirfm图像和epi图像中的强度比的对数值，再对所有荧光目标点在强度tirfm图像和epi图像中的强度比的对数值进行线性拟合，得到拟合直线的斜率的负倒数为入射角θi对应的渗透深度dp(θi)。

实施例1

将上述建立的全内反射荧光显微镜入射深度的标定装置置于thornlabs公司的扫描振镜系统中，而后激光从mellesgriot公司生产的激光器发出，经过单模光纤导入thornlabs公司的准直透镜完成准直；经过准直后的光束入射到thornlabs公司的扫描振镜系统中进行光路偏折，之后入射到thornlabs公司的扫描透镜中进行聚焦。由扫描透镜射出的光束经过第一场镜扩束之后平行射出经thornlabs公司的聚焦镜和二色镜聚焦和反射后，光束聚焦于olympus公司生产的全内反射荧光显微镜的物镜上并投射于其样品台上。待测样品所发射的信号光被全内反射荧光显微镜的纤维物镜收集，先通过二色镜再依次经过滤波片滤去杂散光，经过第二场镜聚焦，最终被olympus公司的ccd探测器采集，ccd探测器记录此时探测到的光强信号。改变控制扫描振镜的电压即可得到这个视场中不同入射角下的全内反射荧光显微镜图像。最后使入射光束垂直射入，拍摄得同一个视场下的epi图像。至此，标定所需的图像数据准备完全。

对于拍摄得到的全内反射荧光显微镜图像中的任何一个目标点，根据倾斜面的倾角可算得其相对于载玻片的轴向深度。

对于每张全内反射荧光显微镜图像，取一系列轴向深度不同的目标点，将该点在全内反射荧光显微镜图像中对应的强度与在epi图像中对应的强度相比取对数，即可得到一系列的线性关系式，对线性关系式进行拟合，得到直线的斜率的负倒数为入射角对应的渗透深度。

以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。