本发明公开了一种连作滁菊土壤中总酚的测定方法。具体涉及到一种基于近红外光谱技术，以连作滁菊土壤总酚为对象的快速无损测定方法，采用近红外光谱分析技术，应用偏最小二乘法构建数学模型，预测连作滁菊种植土壤中总酚含量。
背景技术：
中草药或蔬菜连续在同一田地中种植，容易产生连作障碍问题。其中的原因之一是由于植物根系分泌或植株残体腐解后，形成的酚酸类物质导致植物产生自毒作用。植物产生的酚酸类自毒物质很多，总体上分为单酚和多酚，在一起合称为总酚。因此，为了监测中草药或蔬菜生产过程中总酚含量，避免连作障碍现象的产生，酚酸类物质的检测分析成为实际生产活动的技术要求。对于单酚、多酚和总酚的测定方法很多，主要有液相色谱法、紫外分析法、分光光度法以及流动注射化学发光法，这些方法需要对样品进行前处理，需要加入化学试剂，对样品扰动大，测试耗时长，再加上各种酚酸具有稳定性差，见光容易分解的特点，使得上述分析测试方法，很难满足实际生产活动中对酚酸分析要快速、简便、无污染、扰动小的需求。因此，开发出新的酚酸测试新方法势在必行。
近红外光谱技术是正在快速发展的绿色无损分析技术，已经广泛应用在农业、食品、烟草、药物行业的成分定量分析。近红外光谱属于分子振动光谱的倍频和主频吸收光谱，主要是由于分子振动的非谐振性，使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，具有较强的穿透能力。近红外光可以对酚酸类物质中的酚羟基Ar—OH振动的倍频和合频吸收，从而构成了酚酸类化合物的组成和分子结构的信息。由于不同的酚酸类物质含有不同的基团，不同的基团有不同的能级，不同的基团和同一基团在不同物理化学环境中对近红外光的吸收波长都有明显差别，且吸收系数小，发热少，因此近红外光谱可作为单酚和多酚获取信息的一种有效的载体。因此，选用连续改变频率的近红外光照射样品时， 由于试样对不同频率近红外光的选择性吸收，通过试样后的近红外光线在某些波长范围内会变弱，透射出来的红外光线就携带样品酚酸类物质组分和结构的信息。通过检测器分析透射或反射光线的光密度，就可以确定酚酸类物质的含量。
目前，有研究者利用近红外光谱技术研究了单酚的定量分析，比如刘黎锋研究了近红外光谱法快速测定当归提取过程中阿魏酸含量，也有人研究了多酚的定量分析，比如中国发明专利公开号CN103592258A和CN101059426A研究了茶多酚的近红外光谱定量技术，中国发明专利公开号CN105319331A发明了一种检测水果酒中多酚类物质的方法及数学模型。还有人发明了总酚的测定方法，比如中国发明专利公开号CN105628696A研究了参芎葡萄糖注射液中总酚酸含量的近红外光谱分析方法。
总体上来说，对于酚酸类物质导致土壤产生连作障碍的发生，不应该只是某一个单酚或多酚，亦或是几个单酚或几个多酚起作用。相对单酚或多酚，考量土壤中总酚含量的变化情况，对于土壤连作障碍的实际意义更大。因此，利用近红外技术定量分析土壤中总酚含量，对于防治连作障碍问题至关重要。然而，尽管前人对各种样本中的总酚做了大量研究，但是酚酸样品的差异、校正集数量、验证集数量、不同的近红外光谱仪、原始光谱采集后预处理方法、奇异样品的剔除、波段的选择、回归模型的选择在内的一些因素，都可极大影响近红外模型预测的精度和可靠性，所以，有必要利用红外光谱技术，对不同的连作土壤中的总酚进行针对性监测。
截至目前，尚无连作滁菊土壤中总酚近红外光谱定量分析方法的报道，因此，利用近红外光谱技术，研发连作滁菊土壤中总酚的快速无损监测技术，对于提早预防和防治滁菊连作障碍问题有着重大意义。
技术实现要素：
本发明是基于当前对于总酚测试分析技术的不足，提供了一种连作滁菊种植土壤中，总酚含量的近红外光谱定量分析技术。采用近红外光谱分析技术可对连作滁菊土壤样品中总酚进行快速无损测定，有效解决了传统分析技术的问题，为连作滁菊土壤总酚含量的分析提供了新的绿色便捷、精确可靠的分析方法。
本发明的技术方案如下：
（1）建立校正样品光谱集。收集连作5年滁菊土壤样品，利用近红外光谱仪对样品集进行光谱扫描，获得校正样品集的近红外光谱数据，该数据为样品的原始光谱。
（2）样品中总酚含量的化学定量分析。利用分光光度法对所收集的样品进行测试，得到的数据为样品总酚含量的真实值。
（3）异常光谱判断。样品谱图采集过程中，由于设备本身的误差，操作的失误，波长的漂移以及环境因素的变化，近红外光谱谱图可能出现异常，从而引起模型精度的降低。对于异常样品的诊断，采用马氏距离、标准杠杆值和学生残差来剔除奇异样品。
（4）光谱数据的预处理。样品的物理性质的差异会产生光谱基线和斜率的变化，在构建校正模型之前，需要对近红外光谱进行预处理，来消除这些因素的影响。常见的光谱预处理方法有两种，一种是平滑处理，另一种是导数处理。
（5）最佳波段的选择和数学模型的构建。选择最佳的波数范围，利用偏最小二乘法（partial least squares, PLS）将步骤（2）中的数据与模型预测数据建立数学模型，利用该模型预测验证集样品中总酚含量，进行多元交叉验证。
（6）模型的评价。评价近红外光谱定量模型建模效果的指标，主要有校正相关系数Rc、交叉验证相关系数Rcv，交叉验证误差均方根（root mean square error of cross-validation, RMSECV）、校正集误差均方根（root mean square error of calibration, RMSEC）和预测误差均方根（root mean square error of validation, RMSEP），相对预测偏差（relative prediction error, RSEP）。
本发明与现有技术相比，具有的有益效果是：
（1）分析时间极大缩短。运用近红外光谱技术进行连作滁菊土壤样品中总酚含量的测定，分析时间为30秒以内，有效提高了测定效率。
（2）对样品无扰动，做到了无损检测。
（3）测试过程中无任何化学试剂使用，降低了分析成本，也不污染样品。
附图说明
图1是近红外光谱法快速无损检测连作滁菊土壤样品中总酚的技术原理图。
具体实施方式
下面对本发明的内容作详细描述。
（1）样品的制备。取连作5年滁菊土壤样品，加入30倍量无水乙醇，加热回流提取3 h，提取3次，冷却后抽滤3次后合并提取液，旋转蒸发至无乙醇味，收集浓缩液，再加入5倍量45℃温水，室温静置24h，在5000rpm条件下离心30min，上清液储存于棕色瓶中，4℃冷藏备用。D-101大孔树脂先用无水乙醇浸泡过夜，用超纯水反复冲洗直至无乙醇味，再用4%NaOH浸泡过夜，用超纯水冲洗至中性，然后用4%HCl溶液浸泡过夜，用超纯水冲洗至中性，装柱（200 mm×50 mm）备用。将提取液用50%乙醇以20 ml/h的速度洗脱，洗脱过程中每隔一段时间收集大孔树脂富集纯化后的样品，5根树脂柱子平行操作，每根收集30个样品，总共得到150个样品，随机取100份样品为校正集，剩余为验证集。
（2）样品近红外光谱的采集。采集样品的透射光谱，光谱扫描范围为4000～10000 cm-1，扫描次数64次，增益2倍，单个样品光谱扫描时间30 s，分辨率8 cm-1，液体样品池为2 mm光程的石英比色皿。采用空气为参比光谱，测试环境为25℃，相对湿度为50%。
（3）总酚含量的化学定量分析。总酚的测定，采用福林酚法测定。
a. 标准品的处理：
准确称取0.1 g没食子酸，用50 mL蒸馏水溶解、定容至100 mL，得到质量浓度为1000 mg/L 的没食子酸标准储备液，分别取标准储备液0、1.25、2.5、5、10、20、40mL 于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制质量浓度为0、12.5、25、50、100、200和400 mg/L 的系列标准溶液。
b. 样品的处理：
称取2 g样品，加入蒸馏水20 mL，溶解。以3000 r/min转速离心10min后，取其上清液，稀释50倍。
c. 测定与计算：
取1 mL标准液或样品液于15 mL 的试管中，分别加入1 mL FC（福林酚）显色剂及3 mL 20% Na2CO3，混匀，于50 ℃水浴反应30 min。在765 nm波长下测定吸光度。每个浓度做3个平行试验，取平均值，绘制标准曲线，得到吸光度值A与没食子酸标准溶液浓度(T，mg/mL)之间的回归方程，计算总酚含量。
（4）奇异样品的剔除。采用标准杠杆值（Standard leveragel）、学生残差（Studentized residual）和马氏距离（Mahalanobis distance）判断异常光谱，如果马氏距离超过阈值，可判断该样品光谱异常。杠杆值越接近1，表示该样品越不利于建模，可视为异常样品。最后通过样品杠杆值和学生残差联合诊断，逐步剔除异常点。
（5）光谱数据的预处理。谱图的平滑处理可以有效去除噪声，导数处理可以净化谱图信息。TQ Analyst软件提供了Savitzky-Golay和Karl Norris两种平滑滤波方法。根据RMSECV值最小和模型相关系数较高的筛选原则，本发明采用一阶导数和Norris平滑滤噪预处理，建模效果比较理想。
（6）最佳波段的选择和数学模型的构建。利用TQ Analyst软件中的Suggest向导工具，自动选择最佳的波数范围作为参考，根据光谱波段对PLS近红外模型R和RMSECV的影响为依据，判断连作滁菊土壤总酚近红外光谱波段是7500-4000 cm-1，在此波数范围内，利用偏最小二乘法（partial least squares, PLS）将步骤（3）中的数据与模型预测数据建立数学模型，利用该模型预测验证集样品中总酚含量，进行多元交叉验证。
（7）模型的评价。模型预测值与真实值呈现良好相关关系，校正相关系数Rc为0.9896，交叉验证相关系数Rcv为0.9905，校正集误差均方根RMSEC为0.396，预测误差均方根RMSEP为0.417，交叉验证误差均方根RMSECV为0.523，相对预测偏差RSEP是4.06%。