一种用于细胞表面染色的染色增强液及染色方法与流程

本发明涉及细胞染色领域，具体地说是一种用于细胞表面染色的染色增强液及染色方法。

背景技术：

免疫荧光化学技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞表面或组织内的相应抗原(或抗体)。由于在细胞表面或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，该荧光素在受到激发光的照射后，由低能态进入高能态，而高能态的电子不稳定，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。

该细胞表面染色技术最重要的一点就是增强荧光强度，使染色效果在显微镜下观察更明显。但是由于细胞的异质性，每个细胞表面表达的抗原(抗体)量不一，导致有时荧光强度非常微弱，在荧光显微镜下难以分辨。另一方面，由于荧光染色是在细胞表面进行，染色效果不佳容易导致边界不清，当同时进行dapi细胞核染色时，往往难以分清荧光是否来自细胞表面，造成检测结果的不准确。

技术实现要素：

本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种用于细胞表面染色的染色增强液及染色方法，该染色增强液及染色方法能够提高染色效果，增强荧光强度，并且使细胞膜边界清晰。

在本发明的一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于细胞表面染色的染色增强液，其特征在于：所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/ml的表面活性剂，溶剂为细胞缓冲液。所述细胞缓冲液优选为常用的生物缓冲液，如pbs缓冲液等。

优选的，所述表面活性剂为tritonx-100、二甲基亚砜、np-40、十二烷基硫酸钠中的任一种。最优选的，所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠(sds)。

优选的，所述染色增强液中还包括占染色增强液质量百分含量0.1～3％的聚乙二醇。在染色增强液中加入聚乙二醇可以进一步增强染色效果。聚乙二醇优选为分子量在4000～8000之间的聚乙二醇，更优选为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。

优选的，所述表面活性剂的浓度为0.01～1mg/ml。最优选的，所述染色增强液包括浓度为0.01～1mg/ml的十二烷基磺酸钠和占染色增强液质量百分含量0.1～3％的聚乙二醇。

在本发明的另一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种利用上述染色增强液的染色方法，其步骤包括如下步骤：(1)染色预处理：将需要进行细胞表面染色的细胞与染色增强液混合，在室温下静置5～10分钟；(2)细胞表面染色：将步骤(1)预处理后的细胞直接与可以识别细胞的荧光染色剂混合，对细胞进行细胞表面染色。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)可以在溶液中进行或者在载玻片上进行。作为本领域技术人员公知的，如果步骤(1)和步骤(2)在溶液中进行时，则先将需要进行细胞表面染色的细胞重悬成细胞悬液，然后依次进行染色预处理、细胞表面染色后，再将细胞转移到载玻片上进行细胞固定、载玻片封片。而如果步骤(1)和步骤(2)在载玻片上进行，则先将细胞在载玻片上进行细胞固定，然后依次进行染色预处理、细胞表面染色后，再对载玻片封片。

当染色增强液的加入量越多时，加强荧光的强度越高，但是可能会对细胞膜造成损伤。因此本发明优选的，染色增强液加入后溶液中表面活性剂的终浓度为0.2μg/ml～1mg/ml。其中，所述染色增强液优选的加入量为1～20μl。

加入荧光染色剂的浓度越高，越容易造成非特异性染色，影响荧光的效果。因此本发明优选的，荧光染色剂加入后荧光染色剂的终浓度为2～10μg/ml。其中，所述荧光染色剂的浓度优选为1～10μg/ml。

优选的，所述荧光染色剂为带有荧光染料标记的膜抗体或膜配体。膜抗体或膜配体可以与细胞膜上相应的膜抗原特异性结合。优选的，所述膜抗体或膜配体可以为cd45抗体、egfr抗体、her2抗体、叶酸配体、psma抗体、psa抗体中的一种或多种。

本发明的染色增强液可以暴露细胞表面的膜蛋白抗原决定簇，使带荧光标记的抗体或配体更容易结合在细胞表面的细胞膜上，从而增强标记细胞膜的荧光强度，并且使细胞膜边界清晰。这样可以同时增强血源性细胞表面特异性荧光染色和肿瘤细胞表面特异性标志物的荧光染色效果，使得肿瘤细胞与血源性细胞更易于区分，降低检测的假阳性，提高检测的特异性。并且，本发明的染色方法仅需在进行细胞染色前加入染色增强液对细胞进行短时间的预处理，而不需要另外对细胞进行清洗等操作，就能提高染色效果，操作简单，效果好。同时，本发明的染色增强液成分简单，来源丰富，成本低，具有很强的实用性。

附图说明

图1为不用染色增强液处理的对照组荧光结果；

图2为用浓度为0.001mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果；

图3为用浓度为0.01mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果；

图4为用浓度为0.05mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果；

图5为用浓度为0.1mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果；

图6为用浓度为1mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1液态细胞表面染色

(1)用1×pbs配置1mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml五种十二烷基硫酸钠(sds)浓度梯度的染色增强液。

(2)细胞培养：将贴壁生长的hela细胞六孔板一孔生长至80-90％，加0.25％含edta胰酶0.3ml消化2min，弃胰酶加1ml培养基吹打混匀成细胞悬浮液。

(3)细胞重悬：将上述细胞悬浮液在1000rpm的转速下离心3min后弃上清，然后再用pbs缓冲液漂洗离心两次(1000rpm，3min)，然后再次弃上清，最后加入600μlpbs缓冲液重悬细胞，细胞计数并将悬液分装成6管，每管约有3.15×10⁵个细胞，悬液体积50μl。

(4)染色预处理：向上述每管细胞悬液中分别加入2μl步骤(1)中的五种浓度梯度的染色增强液进行预处理，并向最后一管中加入2μl纯的1×pbs作为对照组，然后静置10分钟。

(5)细胞表面染色：将egfr-alexa488荧光染色剂用pbs缓冲液按照1:200稀释后向预处理完成后的细胞悬液中加入200μl，再避光孵育20min。孵育后加1×pbs缓冲液清洗抗体，1000rpm离心3min重复两次，去上清至100μl。

(6)细胞固定：将步骤(5)中的细胞转移涂抹到载玻片上，然后加入固定液2％多聚甲醛，固定10min，pbs洗涤玻片2次，每次5min。

(7)室温、自然干燥载玻片。然后加入10μl封片剂封片(其中封片剂的含量为dapi：甘油＝1:9)，最后用nikonds-u3荧光显微镜观察结果，镜检条件为：激发光源：488nm(绿光)，曝光时间800ms；激发光源358(dapi蓝光)，曝光时间1～2ms，镜检结果如图1～图6所示，每张图的左图为绿光图，右图为dapi蓝光图。

实施例2固态细胞膜染色

(1)用1×pbs配置1mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml五种十二烷基硫酸钠(sds)浓度梯度的染色增强液，然后向每种染色增强液中加入染色增强液质量2％的聚乙二醇4000。

(2)将贴壁生长的hela细胞接种在载玻片上，在10％fbs、89％dmem培养基中，在37℃、5％co2环境下生长至48h，至细胞密度80-90％。

(3)细胞洗涤：弃掉培养基上清，然后再用pbs缓冲液漂洗两次，每次5min。

(4)细胞固定：固定液多聚甲醛，固定10min，pbs漂涤玻片2次，每次5min。

(5)染色预处理：将步骤(1)中的五种浓度梯度的染色增强液20μl涂抹到步骤(4)中的载玻片上，最后一只1×pbs作为对照组，然后静置10分钟。

(6)细胞表面染色：将egfr-alexa488荧光染色剂用pbs缓冲液按照1:200稀释，加200μl的稀释后抗体，避光孵育20min。孵育后加1×pbs缓冲液清洗抗体，1000rpm离心3min重复两次，去上清至100μl。

(7)室温、自然干燥载玻片。然后加入10μl封片剂封片(其中封片剂的含量为dapi：甘油＝1:9)，最后用nikonds-u3荧光显微镜观察结果，镜检条件为：激发光源：488nm(绿光)，曝光时间800ms；激发光源358(dapi蓝光)，曝光时间1～2ms。

其中，不用含sds的pbs缓冲液处理的对照组荧光结果如图1所示，用浓度为0.001mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果如图2所示，用浓度为0.01mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果如图3所示，用浓度为0.05mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果如图4所示，用浓度为0.1mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果如图5所示，用浓度为1mg/ml的sds染色增强液预处理后的荧光结果如图6所示。

从图1～图6可以看出，不加sds时，虽然egfr抗体是和细胞膜表面的egfr抗原结合，但是染色效果并没有在细胞膜周围出现光晕，而是整个细胞有不同程度的绿色荧光，并且荧光量较弱。

随着染色增强液中sds浓度的升高，0.001mg/ml时，细胞开始出现光晕，并且从0.001mg/ml到1mg/ml，细胞表面荧光信号不断增强。表面光晕越来越清晰可见。从0.1mg/ml到1mg/ml，细胞数量逐渐减少，而且聚集成团。这可能是由于sds对细胞膜有损害作用的原因。

在实施例2中，染色增强液中加入了聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000之后，荧光强度进一步增强，而且在染色增强液中的sds含量为1mg/ml时，细胞数量也未明显减少。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理以及权利要求的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。