本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可采用胶乳增强免疫比浊法测定人血清和阴道分泌物中中性粒细胞弹性蛋白酶含量的中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂及其制备方法。
背景技术：
ne(中性粒细胞弹性蛋白酶)存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9kd，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30％～40％的同源性，最适ph值接近中性。hne的基因位于19号染色体的短臂末端，是50kb的dna片段，成熟的中性粒细胞中并无hne的mrna表达，说明此种酶只在未成熟的骨髓细胞中合成。酶的催化中心由his41、asp88和ser173三个氨基酸残基构成，空间位置相互靠近，均由发夹结构延伸到蛋白表面，其中ser残基侧链上羟基具有很高的亲核性，容易结合不带电的小分子氨基酸，如val、ala、leu、met等。
ne属于基质金属蛋白酶类即mmp-12，是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量zn2+和ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有ne的总量为3μg。
生理条件下，ne可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。而ne过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放il-8、tnf-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase3诱导的细胞凋亡。据报道，ne还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。
羊膜腔内感染或炎症与早产关系密切，特别是较早期的早产，而引起羊膜腔内感染的重要途径之一是经阴道、宫颈的上行感染。下生殖道感染时可使局部聚集、浸润大量炎性细胞如巨噬细胞，这些细胞被激活后释放多种炎性因子，如tnf-α、il-1β、il-6、il-8等，这些炎性细胞因子介导中性粒细胞聚集并被激活和脱颗粒，释放出ne，ne作用于宫颈组织，诱导局部组织细胞il-8的基因与蛋白表达；ne的释放，加剧局部的炎症反应，促进更多中性粒细胞的聚集和活化，从而释放更多ne，参与对宫颈组织的细胞外基质的降解，促进早产的发生和发展。
ne的检测
ne是一种相对稳定的蛋白质，在8℃下保存三天仍具有稳定的免疫活性，在-15℃下标本可以保存至少3个月。目前仅有层析定性和酶免定量的检测方法可用，层析定性仅能在样本浓度超过检测限后简单确定有无，无法准确定量，不能反映炎症的轻重程度及对炎症进行及早的发现和治疗，而且存在较大的假阴或假阳，酶免方法主要是被科学研究者应用于科研，由于各自进行检测试剂的制备，没有统一的配方及工艺，没有对检测条件深入研究，导致不同批次试剂检测结果差异较大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂及其制备方法。
为实现上述发明目的之一，本发明采用如下技术方案：
一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂，包括r1试剂、r2试剂、校准试剂；
所述r1试剂包括缓冲剂、反应促进剂、亲和素化胶乳微球、稳定剂，亲和素化胶乳微球的胶乳微球直径为50-100nm，所述r1试剂的ph值为7.4-8.0；
所述r2试剂包括缓冲剂、生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、稳定剂；
所述校准试剂包括定量的中性粒细胞弹性蛋白酶抗原。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述r1试剂中的反应促进剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇2000中的一种或多种，稳定剂为明胶、乳清蛋白、抗坏血酸中的一种或多种。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述r2试剂中生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体的抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体为鼠抗人中性粒细胞弹性蛋白酶单克隆抗体、羊抗人中性粒细胞弹性蛋白酶单克隆抗体、兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶单克隆抗体中至少一种，或者是鼠抗人中性粒细胞弹性蛋白酶多克隆抗体、羊抗人中性粒细胞弹性蛋白酶多克隆抗体、兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶多克隆抗体中至少一种。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述r2试剂中的稳定剂为明胶、乳清蛋白、抗坏血酸中的一种或多种。
为实现上述另一发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂的制备方法，分别制备r1试剂、r2试剂、校准试剂；
所述r1试剂的制备方法包括以下步骤：将缓冲剂、反应促进剂、亲和素化胶乳微球、稳定剂、无机盐、防腐剂与水混合调配为ph值为7.4-8.0的溶液即得；
所述r2试剂的制备方法依次包括以下步骤：
s1、将抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体在ph8.0-9.0的碳酸氢钠缓冲溶液中，于2-8摄氏度进行至少两次透析，以除去干扰标记反应的杂质；
s2、将透析后的抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液用ph7.0-7.4的磷酸盐缓冲液稀释到1-2mg/ml，加入过量的生物素，在25摄氏度持续、轻微混合1小时，进行标记反应以制得生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液；
s3、将步骤s2所得溶液在ph7.5-8.0的磷酸盐缓冲液中，于2-8摄氏度进行至少两次透析，除去未反应的生物素；
s4、将透析后的生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液用缓冲液稀释到目标浓度，并加入稳定剂即得；
所述校准试剂的制备方法包括以下步骤：使用稀释液将中性粒细胞弹性蛋白酶抗原稀释到所需浓度即得。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述r2试剂的制备步骤s2中的生物素为活化生物素，用超纯水溶解后直接进行标记反应。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述r2试剂的制备步骤s4中稳定剂为明胶、乳清蛋白、抗坏血酸中的一种或多种。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述r1试剂的亲和素化胶乳微球中的胶乳微球为单一的粒径，或由不同粒径大小的胶乳微球混合而成。
相对于现有技术，本发明的技术效果在于：
本发明通过生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体与亲和素化胶乳微球结合，采用胶乳增强免疫比浊法来测定人体阴道分泌物和血清中ne的含量，该试剂操作简便，准确度高，重复性好，适于高通量检测，能够在全自动生化分析仪上使用，与酶免定量方法测定的结果有很好的符合性。
具体实施方式
以下将结合具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
本发明提供了一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂，包括r1试剂、r2试剂、校准试剂；
所述r1试剂包括缓冲剂、反应促进剂、亲和素化胶乳微球、稳定剂，亲和素化胶乳微球的胶乳微球直径为50-100nm，所述r1试剂的ph值为7.4-8.0；
所述r2试剂包括缓冲剂、生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、稳定剂；
所述校准试剂包括定量的中性粒细胞弹性蛋白酶抗原。
进一步的，所述r1试剂中的反应促进剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇2000中的一种或多种，稳定剂为明胶、乳清蛋白、抗坏血酸中的一种或多种。
进一步的，所述r2试剂中生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体的抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体为鼠抗人中性粒细胞弹性蛋白酶单克隆抗体、羊抗人中性粒细胞弹性蛋白酶单克隆抗体、兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶单克隆抗体中至少一种，或者是鼠抗人中性粒细胞弹性蛋白酶多克隆抗体、羊抗人中性粒细胞弹性蛋白酶多克隆抗体、兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶多克隆抗体中至少一种。
进一步的，所述r2试剂中的稳定剂为明胶、乳清蛋白、抗坏血酸中的一种或多种。
本发明还提供了一种中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂的制备方法，分别制备r1试剂、r2试剂、校准试剂；
所述r1试剂的制备方法包括以下步骤：将缓冲剂、反应促进剂、亲和素化胶乳微球、稳定剂、无机盐、防腐剂与水混合调配为ph值为7.4-8.0的溶液即得；
所述r2试剂的制备方法依次包括以下步骤：
s1、将抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体在ph8.0-9.0的碳酸氢钠缓冲溶液中，于2-8摄氏度进行至少两次透析，以除去干扰标记反应的杂质；
s2、将透析后的抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液用ph7.0-7.4的磷酸盐缓冲液稀释到1-2mg/ml，加入过量的生物素，在25摄氏度持续、轻微混合1小时，进行标记反应以制得生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液；
s3、将步骤s2所得溶液在ph7.5-8.0的磷酸盐缓冲液中，于2-8摄氏度进行至少两次透析，除去未反应的生物素；
s4、将透析后的生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液用缓冲液稀释到目标浓度，并加入稳定剂即得；
所述校准试剂的制备方法包括以下步骤：使用稀释液将中性粒细胞弹性蛋白酶抗原稀释到所需浓度即得。
r2试剂的制备步骤s1、s3中采用的是低温多次透析方法，可以充分保证抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体的生物活性。
进一步的，所述r2试剂的制备步骤s2中的生物素为活化生物素，用超纯水溶解后直接进行标记反应。
进一步的，所述r2试剂的制备步骤s4中稳定剂为明胶、乳清蛋白、抗坏血酸中的一种或多种。
进一步的，所述r1试剂的亲和素化胶乳微球中的胶乳微球为单一的粒径，或由不同粒径大小的胶乳微球混合而成。通过不同粒径的胶乳微球组合，可以使该中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂的性能达到更高灵敏度以及更宽线性范围。
本发明进行样本中中性粒细胞弹性蛋白酶含量测定的原理是：利用抗原抗体反应，先加入r1试剂，使样本中的中性粒细胞弹性蛋白酶的抗原位点暴露，并使抗原与亲和素化胶乳微球通过物理吸附接近，便于快速形成反应复合物，当加入生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体试剂，即r2试剂，使反应液中的抗原抗体交联反应形成抗原抗体复合物，同时亲和素和生物素作用使胶乳微球凝集，从而产生一定的浊度，样本中中性粒细胞弹性蛋白酶的含量在一定范围内与产生的浊度成正相关，再通过校准曲线进行计算，从而得到中性粒细胞弹性蛋白酶的含量。
本发明与现有技术相比，具有如下特点：
1)本发明的中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂具有高的检测灵敏度，最低检测能够达到5.0ng/ml，操作简便，快速，从检测到出结果最多只需要10分钟，甚至更短。
2)r2试剂中的生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体的制备由于采用活化生物素直接标记法，对抗体功效无伤害，结合效率高，稳定性好，批间差异小，在2-8摄氏度至少可以保存一年。打破传统，将放大吸光度信号的胶乳微球放于r1试剂中，检测抗体放于r2试剂中，改变以往检测抗体和胶乳微球直接偶联在一起的方式，这样既简化生产工艺又提高试剂稳定性。采用亲和素与生物素高亲和力结合的方式将亲和素化胶乳微球与检测反应中形成的抗原抗体复合物连接，以此放大吸光度信号，这样保证了提高试剂的灵敏度。
3)本发明的中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂对样品中中性粒细胞弹性蛋白酶含量检测的数据经统计分析，与科研的酶免法无显著性差异，检测结果可靠，临床评价良好，可用于临床应用。
以下结合一实施例对本发明进行说明
实施例一
一、制备r2试剂
将10mg抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体在ph8.5的0.1mol/l，1l碳酸氢钠缓冲溶液中，于2-8摄氏度进行3次透析，每次1小时，除去防腐剂等干扰标记反应的杂质。
将透析后的抗体溶液用ph7.2的0.1mol/l磷酸盐缓冲液稀释到1mg/ml，用1ml超纯水溶解1mg活化生物素nhs-biotin，加入到抗体溶液中，在25摄氏度持续、轻微混合1小时进行标记反应。
将生物素化抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体溶液在ph7.5，0.1mol/l，5l磷酸盐缓冲液中于2-8摄氏度进行3次透析，除去未反应的生物素。
将透析后的生物素化抗体用ph7.5，0.01mol/l磷酸盐缓冲液稀释到0.1mg/ml，加入0.1g明胶，0.1g乳清蛋白，1g抗坏血酸溶解并混合均匀即得r2试剂。
二、制备r1试剂
配制0.01mol/l，ph7.4，含聚乙烯吡咯烷酮5g/l，聚乙二醇200040g/l，氯化钠9g/l，亲和素化胶乳微球0.1％，明胶1g/l，乳清蛋白1g/l，抗坏血酸10g/l，proclin3000.1％的磷酸盐缓冲液即r1试剂。
三、制备校准试剂
配制0.05mol/l，ph7.4，含明胶1g/l，乳清蛋白1g/l，抗坏血酸10g/l，氯化钠8g/l，氯化钾2g/l，proclin3000.1％，吐温200.1％的磷酸盐缓冲液即得稀释液。
按照需要的中性粒细胞弹性蛋白酶参考校准试剂浓度将纯化过的重组中性粒细胞弹性蛋白酶抗原用稀释液稀释到所需浓度即得。
以下对中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂的测定方法进行说明
校准试剂浓度：1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、0ng/ml；
测定波长：660nm；
r1试剂：r2试剂：样本＝270μl∶50μl∶5μl；
校准方式：spline。
检测过程：r1试剂与样本加入，反应5分钟，然后加入r2试剂后20秒，读取反应液吸光度a1，加入r2试剂后5分钟，再读取反应液吸光度a2，计算吸光度的变化δa＝a2-a1。
用校准试剂浓度做横轴，δa做纵轴，建立校准曲线。未知样本的浓度通过其反应的δa从校准曲线计算得到。
以下对本发明中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂的性能指标进行说明
1.空白检测限测定
用中性粒细胞弹性蛋白酶测定试剂对空白样本(校准试剂稀释液)重复测定20次，空白检测限浓度为均值浓度加上二个标准差，得到空白检测限浓度要求≤2ng/ml。
2.线性范围5-1000ng/ml。
3.与酶联免疫方法的试剂盒测定结果的相关性。
通过测定100例标本(样本浓度在5-1000ng/ml范围内均匀分布)本试剂制备的试剂盒与酶联免疫方法的试剂盒的相关系数r2＝0.970，相关方程为：y＝0.95x+0.328。
其中，x为本试剂的检测值，y为酶免方法检测值。
4.精密度
同一试剂检测同一样本10次，用10次测值的标准差除以平均值即重复性变异系数，≤5％。
最后应说明的是：以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施方式技术方案的精神和范围。