本发明涉及到卷烟烟气的体外毒理学研究，具体来说是一种检测全烟气暴露实验下的烟气剂量学测定方法。
背景技术：
基于全烟气暴露的卷烟烟气体外毒理学研究是近年来烟草烟气体外毒性评价的热点之一。进行全烟气暴露实验可以模拟烟气暴露的体内微环境，更加全面真实的反映卷烟烟气的生物学效应。毒理学研究要基于准确的测试剂量，烟气剂量的实时监测和精准控制是影响全烟气暴露实验结果可靠性的一个重要因素。目前，在进行全烟气暴露实验时，暴露仓内的实际烟气浓度很难测定，通常是采用间接表征的方式，如以稀释空气流速、烟气稀释比例、抽吸烟支数量等形式表征。这些烟气剂量的表征方法虽然可以实现测试样品之间毒性差异比较的目的，但对于实际条件下的真实烟气暴露浓度并不知晓。因此，建立一种实际条件下烟气剂量的测定方法，真实表征全烟气暴露仓内实际的、实时的烟气浓度，对于烟草制品的体外毒性评价具有重要意义，更加准确地反映真实烟气浓度下的卷烟烟气生物学剂量效应关系。
技术实现要素：
本发明的目的正是基于上述状况而提供的一种检测全烟气暴露实验下的烟气剂量学测定方法。应用建立的方法可以对全烟气暴露实验中烟气暴露仓内的烟气浓度（包括烟气颗粒物质量浓度和烟碱浓度）进行实时监测、定量表征，为毒理学测试结果提供准确的毒性效应剂量基础。为烟草制品的健康风险评估研究提供方法基础。
本方法依据的发明机理在于：使用石英微量天平（Quartz Crystal Microbalance, QCM）晶片与插入式细胞培养皿（Transwell）结合，进行全烟气暴露仓内烟气剂量的实时、定量测定。QCM晶片可以获得暴露仓内烟气颗粒物的实际浓度，为毒性试验的测试结果提供剂量学数据支持，更准确地描述烟气的生物毒性效应。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种检测全烟气暴露实验下的烟气剂量学测定方法，使用石英微量天平（Quartz Crystal Microbalance, QCM）晶片与插入式细胞培养皿（Transwell）结合，进行全烟气暴露仓内烟气剂量的实时、定量测定；具体步骤如下：
1）全烟气暴露实验
将插入式细胞培养皿放置于全烟气暴露仓内，将石英微量天平晶片放置于Transwell小室的微孔膜上，进行烟气暴露实验，全烟气暴露仓与吸烟机和烟气稀释系统相连接，吸烟机抽吸产生的新鲜烟气经过烟气稀释系统与合成空气混合后，以5 mL/min的流速进入到全烟气暴露仓内，QCM晶片表面与暴露仓内的稀释烟气实时接触；Transwell小室的微孔膜下方可灌注细胞培养液，以模拟实际暴露的微环境；
2）烟气剂量测定—烟气颗粒物质量浓度测定
全烟气暴露仓内的QCM晶片在烟气暴露结束后可取出，进行人工称量，测定QCM晶片表面沉积的烟气颗粒物的质量，QCM晶片进行全烟气暴露后的质量差值除以QCM晶片表面积即可得到暴露仓内的烟气暴露累积浓度（单位表面积的烟气颗粒物质量）；当QCM晶片与电流信号传感器连接时，电流信号传感器可以将QCM晶片在烟气颗粒物沉积下的振动转换为电信号，从而表征暴露仓内烟气的实时质量浓度变化，实现烟气剂量的实时、自动定量监测；
3）烟气剂量测定—烟气烟碱浓度测定
将烟气中的烟碱作为表征烟气剂量的化学标志物，以 QCM晶片表面沉积的烟气颗粒物载带的烟碱质量来反映全烟气暴露仓内的烟气剂量；
全烟气暴露实验结束后，将暴露仓内Transwell小室微孔膜上的QCM晶片取出，转置于锥形瓶中，加入提取溶液，于180 rpm下振荡30 min-60 min，经0.22 μm的滤膜过滤后，吸取1 mL滤后溶液加入色谱瓶中，进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析，对烟碱进行定量测定。
所述提取溶液为异丙醇或甲醇。
本发明的最大特点是：模拟烟气暴露的实际微环境，实时、灵敏、定量检测全烟气暴露仓内卷烟烟气的实际浓度（包括烟气颗粒物的质量浓度和烟碱浓度），准确地表征烟气毒性效应的剂量-效应关系，为卷烟烟气体外毒理学效应评价提供真实的烟气剂量基础。应用建立的方法可以更好地解释卷烟烟气的毒性机制，为烟草制品的健康风险评估研究提供方法基础和技术支撑。同时，建立的方法适用性广，可应用于卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟以及不同来源的气溶胶的体外毒性测试研究，测试结果重复性好，稳定性高，灵敏度强。
附图说明
图1. 全烟气暴露下烟气剂量学测定结果（n=3，n为设定的平行独立测定个数，即一个剂量下有3个平行暴露仓内的测定结果），
其中：图1A为全烟气暴露仓内不同稀释比例烟气的烟气颗粒物质量浓度（μg/cm2），图1B为全烟气暴露仓内不同稀释比例烟气的烟气颗粒物载带的烟碱浓度（μg/mL）。
具体实施方案
本发明以下结合实例（附图）做进一步描述：
选取参比卷烟3R4F进行全烟气暴露的烟气剂量学测定实验。将插入式细胞培养皿（Transwell）放置于全烟气暴露仓内，将石英微量天平（Quartz Crystal Microbalance, QCM）晶片放置于Transwell小室的微孔膜上，进行烟气暴露实验。全烟气暴露仓与吸烟机和烟气稀释系统相连接，吸烟机按照ISO条件（35/2/60）抽吸3R4F参比卷烟，产生的新鲜烟气与不同流速的合成空气混合后，以5 mL/min的流速进入到全烟气暴露仓内，合成空气设置5个流速，分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 L/min。打开QCM晶片电流信号传感器，记录全烟气暴露仓内的烟气颗粒物质量浓度。全烟气暴露实验结束后，将暴露仓内Transwell小室微孔膜上的QCM晶片取出，置于锥形瓶中，加入10 mL甲醇溶剂（或者异丙醇溶剂），加入500 μL的内标正十七烷甲醇溶液（正十七烷浓度为1 mg/mL）；于180 rpm下振荡30 min，吸出1.5 mL萃取液经0.22 μm的滤膜过滤后，吸取1 mL溶液加入色谱瓶中，进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。GC-MS分析条件如下：
——进样口温度：260℃；
——进样体积：2 μL；
——分流比：10:1；
——载气：He气，流速：1.0 mL/min；
——传输线温度：280℃；
——色谱柱：DB-5MS (30 m× 250 μm× 0.25 μm)毛细管色谱柱；
——程序升温条件：起始温度100℃，保持3 min，以8℃/min升至260℃，保持5 min。
——质谱电离方式：EI电离，70 eV；
——扫描模式：SIM模式，烟碱（m/z 84），正十七烷（m/z 57）。
实验结果如图1所示，图1A为全烟气暴露仓内不同稀释比例烟气的烟气颗粒物质量浓度（μg/cm2），图1B为全烟气暴露仓内不同稀释比例烟气的烟气颗粒物载带的烟碱浓度（μg/mL）（即每毫升提取溶液中烟碱的质量）。