反射式共焦CARS显微光谱测试方法及装置与流程

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种反射式共焦cars显微光谱测试方法及装置，可用于快速检测各类样品的微区反斯托克斯散射(cars)光谱，可实现高空间分辨的几何成像与探测，可获得高空间分辨的“图谱合一”图像。

技术背景

光学显微镜在生物医学领域和材料科学领域被广泛应用，而随着现代科学的快速发展，对显微成像的要求也从结构成像转向功能成像。1990年，共焦拉曼光谱显微技术的成功应用，极大的提高了探索微小物体具体组织成分及形貌的可能。它将共焦显微技术和拉曼光谱技术相结合，具备共焦显微术的高分辨层析成像特征，又兼有无伤检测和光谱分析能力，已成为一种重要的材料结构测量与分析的技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、石油化工、食品、药物、刑侦等领域。

传统的自发拉曼散射成像技术由于拉曼散射本身特性导致其发射信号极弱，即便用高强度的激光激发，要得到一副对比度好的光谱图像，依然需要很长的作用时间。这种长时间作用限制了拉曼显微技术在生物领域的应用。基于相干拉曼效应的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)过程能够很大程度上增强拉曼信号，从而实现快速检测。相干拉曼效应是通过受激激发的光将分子锁定在振动能级上，这种方法产生的振动信号的强度与激发光的强度成非线性关系，可以产生很强的信号，也称为相干非线性拉曼光谱。它具有很强的能量转换效率，曝光时间短，对样品的损害也比较小，同时它的散射具有一定的方向性，容易与杂散光分离。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的产生是一个三阶非线性光学过程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探测光。一般而言，为了减少光源的数量，简化过程，常用泵浦光代替探测光，它们之间的关系如图2所示，当泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的频率之差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，将激发出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的产生过程包含特定的拉曼活性分子的振动模式和导致分子从基态至激发态振动跃迁的入射光场的相互作用过程，它的能级示意图如图3所示。图3(a)表示拉曼共振和非共振单光子增强对cars过程的贡献，图3(b)表示拉曼共振和非共振双光子增强对cars过程的贡献；当wp和ws之间的频差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，激发出的信号得到共振增强，同时非共振部分也会由于电子跃迁响应得到增强，因此要得到较好的cars信号，需要尽可能的抑制非共振背景信号，常见的方法是偏振cars(p-cars)方法。

p-cars的原理如图4所示，光源1发出的频率为ws的斯托克斯光，起偏后经过四分之一波片和半波片后与光源2发出的频率为wp的泵浦光(探针光)汇合，经二向分光镜后由反射镜发射至水浸显微物镜，聚焦在样品上，激发出载有光谱特性的cars光后，透射进入信号采集系统；信号由一个油浸的显微物镜采集，经过一个偏振片过滤非共振背景，然后通过一个滤光片滤除其他谱段的干扰后，被一个雪崩光电二极管所采集，即获得特定频谱的光谱信号。

p-cars能够很大程度的抑制非共振信号和激发光的干扰，但是由于其采用的是两个单波长激光器，只能获得特定频谱的光谱信息，因此它的广泛使用受到了极大的限制。

传统cars显微术没有强调系统的定焦能力，导致实际光谱探测位置往往处于离焦位置。即便光线在离焦位置也能激发出样品的拉曼光谱并被针孔后的光谱仪探测，但是强度并不能合理表征该点正确的光谱信号强度。在cars显微系统中，只有当系统精确定焦，才能获得最佳空间分辨力和最好的光谱探测能力。

上述原因限制了cars显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用。基于上述情况，本发明提出将系统收集到的样品表面散射的强于样品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光进行高精度探测，使其与光谱探测单元有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同步探测，以实现高空间分辨的、高光谱分辨的共焦cars显微图谱成像和探测。

本发明专利的核心思想是选用超连续谱脉冲激光器和单波长脉冲激光器作为激发光源，扩大激发光谱范围，提高光谱激发强度；将共焦显微结构与cars光谱结构结合，利用共焦响应曲线的“最大值点”与被测样品顶点位置(显微物镜焦点位置)精确对应这一特性，精确定焦，实现高空间分辨；精确定焦后，进行光谱探测，获得最佳光谱分辨能力。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种具有高空间分辨力的反射式共焦cars显微光谱测试方法及其装置。

本发明是通过以下技术方案实现的。一种反射式共焦cars显微光谱测试方法，包括以下步骤：

a)在激光发射单元(1)中，由超连续谱激光器(3)发出超连续谱激光，经过带通滤光片(4)后通过二向色镜(5)与单波长激光器(2)发出的单波长激光混合，形成混合光束(频率一致，时间一致，空间重合)；混合光束经过半反半透棱镜(6)由位于z向平移台(7)上的显微物镜(8)会聚在被测样品(9)上，激发出瑞利光和载有被测样品(9)光谱特性的cars光；cars光和瑞利光经分光棱镜反射进入二向色镜(11)后分成两束，其中包含cars光的光束进入光谱探测单元(12)，另一束包含瑞利光的光束进入共焦探测单元(18)；在光谱探测单元(12)中，包含cars光的光束先经过带通滤光片(13)，滤除光束中的非cars干扰光，然后通过第一会聚镜(14)会聚进入光谱仪(17)，获得cars光谱信息i(λ)；在共焦探测单元(18)中，包含瑞利光的光束经过第三会聚镜(19)后通过位于焦点位置的第二针孔(20)滤除杂散光后被第一光电探测器(21)探测，获得共焦强度信号i(x,y,z)；

b)z向平移台(7)移动，共焦信号强度随之改变，得到共焦响应曲线，利用共焦响应曲线“最大值点”与测量显微物镜(8)焦点位置精确对应的特性，通过“最大值点”来精确捕获激发光斑焦点位置后，再测量获得光谱信息i(x,y,λ)，从而实现高空间分辨的几何探测和光谱探测。

c)当对接收cars光的光谱探测单元(12)获得的光谱信号进行处理时，系统能够进行光谱探测(x,y,λ)；当对接收瑞利光的共焦探测单元(18)获得的共焦信号进行处理时，系统能够获得三维几何形貌(x,y,z)；当对共焦信号和cars信号同时处理时，系统能够进行高空间分辨的微区图谱层析成像(x,y,z,λ)，即实现对被测样品“图谱合一”的激光共焦cars显微光谱高空间分辨成像与探测。

特别的，在本发明方法中，激发光束由两束频率相同，时间一致的脉冲激光组成，其中一束是单波长脉冲激光，另一束是超连续谱脉冲激光。

特别的，在本发明方法中，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，由此实现不同谱段的光谱探测。

特别的，在本发明方法中，二向色镜(8)与分光棱镜(6)反射光束轴线的夹角可变，由此提高系统的灵活性。

特别的，在本发明方法中，在激光发射单元(1)和半反半透镜(6)之间添加光瞳滤波器(24)，有助于提高系统的空间分辨力。

特别的，在本发明方法中，激光发射单元还可以用单波长激光器加光子晶体光纤进行光谱展宽实现，此外，将光谱探测单元(12)中的光谱仪(17)替换成光电点探测器(31)，旋转偏振片(30)可以实现光谱扫描输出，进而激发cars光谱并由光电点探测器(31)探测得到cars光谱信号；

本发明提供了一种反射式共焦cars显微光谱测试装置，包括激光发射单元(1)、光谱激发单元、二向色单元(11)、光谱探测单元(12)、共焦探测单元(18)、计算机(32)；其中，光谱激发单元位于激光发射单元(1)出射方向、二向色单元(11)位于光谱激发单元出射方向、光谱探测单元(12)位于二向色单元(11)透射方向、共焦探测单元(18)位于二向色单元(11)反射方向。激光发射单元(1)由单波长脉冲激光器(2)、超连续谱脉冲激光器(3)、带通滤光片(4)和二向色镜(5)组成；光谱激发单元由半反半透棱镜(6)、z向平移台(7)、显微物镜(8)、待测样品(9)和x-y平移台(10)组成；二向色单元(11)即二向色镜(11)；光谱探测单元(12)由带通滤光片(13)、第一会聚镜(14)、第一针孔(15)、第二会聚镜(16)和光谱仪(17)组成；共焦探测单元(18)由第三会聚镜(19)、第二针孔(20)、第一光电探测器(21)组成，其中，第二针孔(20)位于第三会聚镜(19)的焦点位置。

本发明装置中，激发cars光谱的方式包括：当单波长激光器(2)发出的光作为斯托克斯光和探测光，连续谱激光器(3)发出的连续谱激光作为泵浦光；当连续谱激光器(3)发出的连续谱激光作为斯托克斯光，单波长激光器(2)发出的光作为泵浦光和探测光；

本发明装置中，光谱探测单元(12)中光谱仪(17)前添加一个针孔(15)过滤杂散光。

本发明装置中，滤光片(4)与滤光片(13)的滤光谱带关于单波长激光器(2)的中心波长对称，两滤光片可更换。

有益效果

本发明方法，对比已有技术具有以下创新点：

1、本发明融合了共焦显微技术和cars光谱探测技术，通过共焦响应曲线最大值点与高精度显微物镜的焦点精确对应这一特性，精确定焦样品，在获得几何位置的同时获得最佳cars信号，在大幅提高现有cars光谱显微镜的微区光谱探测能力的同时也大大简化了系统的光路结构，这是区别于现有cars光谱探测技术的创新点之一；

2、本发明利用二向色分光装置对系统收集到的瑞利光和载有样品信息的cars光进行分光，然后瑞利光进入共焦探测单元，cars光进入光谱探测单元，实现光能的合理利用，并提高系统的光谱探测灵敏度，而且二向色分光装置可以根据需求调整角度，有利于cars光谱探测的实现。这是区别于现有cars光谱探测技术的创新点之二；

3、本发明将共焦显微系统和cars光谱成像系统在结构上和功能上结合，可实现样品微区几何参数的层析成像，又可实现样品微区的光谱探测，还可以结合系统获得的几何位置信息和光谱信息实现图谱层析成像，这是区别于现有cars光谱探测技术的创新点之三；。

本发明方法，对比已有技术具有以下显著优点：

1、结合共焦技术实现精确定焦，大幅提高cars光谱探测的空间分辨力；

2、本发明具有几何测量、光谱测试及图谱层析成像三种功能，与时俱进，更大程度满足cars光谱测试的要求。

3、本发明采用宽谱带激光与单波长激光组合的方式，实现了宽谱带cars光谱测量。

附图说明

图1为摘要附图，即本发明基本实施图；

图2为相干反斯托克斯(cars)光激发原理图；

图3为cars光与泵浦光、斯托克斯光的关系图

图4为传统偏振探测显微光路图；

图5为共焦cars测试方法示意图；

图6为二向镜方向可变的共焦cars测试方法示意图；

图7为加光瞳滤波器的共焦cars测试方法示意图；

图8为改进光谱探测的共焦cars显微测试方法示意图；

图9为单激光器光源的共焦cars显微测试方法示意图；

图10为时域扫描的共焦cars显微测试方法示意图；

图11为反射式共焦cars显微测试装置示意图，即实施例用图；

其中，1-激光发射单元、2-单波长激光光源、3-超连续谱激光光源、4-带通滤光片、5-二向色镜、6-分光棱镜、7-z向平移台、8-显微物镜、9-被测样品、10-x-y平移载物台、11-二向色镜、12、光谱探测单元、13-带通滤光片、14-第一会聚镜、15-第一针孔、16-第二会聚镜、17-光谱仪、18-共焦探测单元、19-第三会聚镜、20-第二针孔、21-第一光电探测器、22-光斑、23-共焦曲线、24-光瞳滤波器、25-偏振分光棱镜、26-光子晶体光纤、27-第一反射镜、28-光学延时线、29第二反射镜、30-偏振片、31-光电点探测器、32-计算机；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

图5是共焦cars测试方法示意图，激光发射单元(1)发射出单波长脉冲激光和连续谱段脉冲激光的混合光束(两脉冲激光空间重合，时间一致)，经分光棱镜(6)和显微物镜(8)直射在被测样品(9)表面，激发出瑞利散射光和载有被测样品(9)光谱信息的cars光；瑞利光和cars光被系统回收至光路中，经物镜(8)被分光棱镜(6)反射至二色向镜(11)进行分光，其中cars光透射进入光谱探测单元(12)进行光谱探测，瑞利光反射进入共焦探测单元(18)进行几何探测。其中，二向色镜(11)与分光棱镜(6)反射光束轴线的夹角可变，相对应的共焦探测单元(18)的位置可以调整，即图6所示，这种结构设计有利于本发明方法的实现。

在分光棱镜(6)和显微物镜(8)之间添加光瞳滤波器(24)，产生结构光束，即图7所示，此结构可以提高光谱探测的空间分辨力；

将显微物镜(8)固定在高精度z向平移台(7)，被测样品(9)放置在高精度x-y平移台(10)，结合光谱探测单元(12)、共焦探测单元(18)可实现高空间分辨显微光谱测量；在光谱探测单元(12)中，在光谱仪(17)前添加第一针孔(15)过滤杂散光可以实现高信噪比的光谱测量，整个光路组成构成了高精度共焦cars显微测量方法，即图8。

图9是单激光器共焦cars显微测试方法示意图，目的是将激光发射单元的双激光器输入改为单激光器输入，降低成本；单波长脉冲激光器(2)发出单波长激光，经偏振分光棱镜(25)分光，透射部分进入光子晶体光纤(26)进行谱带展宽并用带通滤波片(4)进行特定要求波长截取，反射部分经第一反射镜(27)、光学延时线(28)和第二反射镜(29)后与展宽后的连续谱激光在二向色镜(5)处进行耦合，输出空间一致、时间一致的混合光束，对被测样品进行cars光谱激发。其中，光学延时线(28)的作用是保证两束激光时序重合。

将图9中光谱探测单元(12)中的光谱仪(17)替换成光电点探测器(31)，在偏振分光棱镜(25)和光子晶体光纤(26)之间添加偏振片(30)，即构成图10；通过旋转偏振片(30)，改变光束的偏振态，使光子晶体光纤(26)输出的光束实现光谱扫描输出，结合光学延时线(28)可以实现时域扫描cars光谱激发，进而实现宽谱带的cars光谱测量。

实施例

在本实施例中，采用波长为1064nm的皮秒激光器作为泵浦光源和探测光源，采用重复频率与之一致的超连续谱皮秒激光器添加1100～1300nmm带通滤光片作为斯托克斯光源，在满足空间重合，时间一致的条件下混合出射，通过高倍显微物镜紧聚焦在样品上，此时满足相位匹配条件，激发出波长范围在900～1030nm的反斯托克斯散射光(cars)。

如图11所示,反射式共焦cars显微光谱测试装置，其测试步骤如下：

首先，在激光发射单元(1)中，超连续谱激光器(3)发出的连续谱激光通过带通滤光片(4)滤光后得到1100～1300nm的宽谱带激光，然后与单波长(1064nm)激光器(2)发出单色激光在二向色镜(5)处汇合，形成混合光束，其中，两束激光重复频率一致，到达分光片时间一致，光束汇合后能够完全重合(泵浦光斑完全包络于斯托克斯光斑里)；混合光束经光瞳滤波器(24)调制后通过位于z向平移台(7)上的显微物镜(8)紧聚焦在被测样品(9)上，激发出瑞利光和载有被测样品(9)光谱特性的cars光。

此时，对样品扫描可通过以下方式完成：由位于显微物镜上的pzt实现z向扫描，由位于样品下的载物台实现x-y方向位移扫描，或在激光出射后的光路中添加振镜扫描结构，实现x-y方向扫描。

被测样品反射回的光束包含斯托克斯光、泵浦光、瑞利光、cars光；其中，cars光和斯托克斯光进入光谱探测单元(12)，1064nm的泵浦光和瑞利光经二向色镜(11)反射进入共焦探测单元(18)。在光谱探测单元(12)中，由斯托克斯光和cars光混合的光先经过900～1030nm的带通滤光片(13)后只保留cars光，然后通过第一会聚镜(14)会聚通过第一针孔(15)，过滤环境光干扰后再由第二会聚镜(16)会聚进入光谱仪(17)，从而探测得到cars光谱i(x,y,λ)，其中x,y表示当前测量横向位置，λ为被测样品(9)受激发光所激发出cars光的波长。在共焦探测单元(18)中，瑞利光经过第三会聚镜(19)会聚后通过第二针孔(20)过滤环境干扰光后，被第一光电探测器(21)所探测，得到共焦信号i(x,y,z)，其中x,y,z表示当前测量点的三维位置；

在标准测量模式下，计算机(32)控制x-y平移台(10)和z向平移台(7)移动，实现三维扫描，通过共焦探测单元实现z向跟踪测量，得到共焦响应曲线(23)，根据共焦强度曲线最大值点与测量物镜焦点位置精确对应这一特性，确定测量点的z向高度，结合x-y平移台位置，得到被测样品三维信息i(x,y,z)。得到准确的z向位置后，计算机控制z向平移台(7)使显微物镜(8)精确定焦，然后光谱探测单元(12)对被测样品cars光谱信息进行测量，得到当前测量点的cars光谱i(x,y,λ)。

i(x,y,z)+i(x,y,λ)＝i(x,y,z,λ)

将三维几何信息和光谱信息结合，即实现了高空间分辨的cars光谱探测。

以上，沿激光出射方向，依次放置激光发射单元(1)，分光棱镜(6)，在分光棱镜(6)透射方向放置光瞳滤波器(24)、z向平移台(7)、显微物镜(8)、被测样品(9)、x-y平移台(10)，在分光棱镜(6)反射方向放置二向色镜(11)，在二向色镜(11)透射方向放置光谱探测单元(12)，在二向色镜(11)反射方向放置共焦探测单元(18)。激光发射单元(1)包括位于二向色镜(5)透射方向的超连续谱激光器(3)、带通滤光片(4)和二向色镜(5)反射方向的单波长脉冲激光器(2)；光谱探测单元(12)中依次放置带通滤光片(13)、第一会聚镜(14)、第一针孔(15)、第二会聚镜(16)、光谱仪(17)；共焦探测单元(18)中依次放置第三会聚镜(19)、第二针孔(20)、第一光电探测器(21)；在整个系统中，单波长脉冲激光器(2)、超连续谱激光器(3)、x-y平移台(10)、z向平移台(7)、光谱仪(17)、第一光电探测器(21)均受计算机(32)控制，系统得到的三维位置信息和光谱信息也由计算机(32)进行融合处理。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。