一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法与流程

本发明属于毒品检测领域，尤其是批量样本检测领域，涉及一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法。

背景技术：

安非他命由盐酸麻黃素合成，能兴奋中枢神经,虽具有欣快、警觉及抑制食欲之作用，重复使用会成瘾。中毒症状包括多话、头痛、错乱、高烧、血压上升、盗汗、瞳孔放大、食欲丧失。大剂量使用引起精神错乱，思想障碍，类似妄想性精神分裂症，多疑、幻听、被害妄想等。长期使用导致器官性脑症候群，有高血压及脑中风之危险。停用之脱瘾症状包括精神呆滞、昏睡、易怒、烦躁不安、忧虑，有自杀的倾向。

目前安非他命的检测方法主要为胶体金法和色谱法。胶体金试纸条虽然检测方便，但其以吸毒人员尿液为检测对象，其灵敏度只有几百ng/ml，且每个试纸条每次只能检测一个人。色谱法虽然灵敏度高，但前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器。而本技术以其高灵敏度，可实现对待检人员的唾液进行毒品检测，从而避免因取尿对客体隐私的侵犯，并可实现在几分钟内进行80个样品的高通量检测。

生物膜干涉技术生物膜干涉技术(bio-1ayerinterferometry，bli)是一种实时、无需标记的快速检测技术，其原理是当生物分子结合到传感器表面形成一层生物膜层，该生物膜层对透过传感器的光的波形造成干涉现象。干涉现象以相位移动的方式被检测，可以检测结合到传感器分子数量的变化。bli技术已经成功应用于蛋白质分子间相互作用的检测，在小分子检测领域也有进一步研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速、高通量的检测待检人员唾液中安非他命含量的技术。所述检测方法取样方便，操作简单，检测快速，灵敏度高，在批量样品检测场合具有重要的应用价值。

本发明的目的由以下技术方案实现：

一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法，包括如下步骤：

步骤(1)：胶体金的制备。避光条件下，取一定体积的超纯水于磁力搅拌器上加热至80-90℃,按100:2的体积比加入氯金酸溶液继续加热至沸腾,再快速加入2％体积的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾反应10min后，冷却至室温后，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度；

所述的氯金酸溶液的质量分数为1％；柠檬酸三钠溶液的质量分数为1％；

所述的胶体金的粒径为30-40nm左右，在525nm波长下有最大吸光度值；

步骤(2)：金标抗体的制备。取一定体积的胶体金溶液,用碳酸钾溶液调节ph至7.2-7.4，室温搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/ml的安非他命单克隆抗体,室温搅拌20-30min；加入质量分数为10％的bsa溶液使其终浓度为1％；室温搅拌20-30min；4-8℃，12000rpm离心20-30min；弃上清液，留沉淀；沉淀用等体积的pbs缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；

所述的碳酸钾溶液浓度为0.2m；安非他命单克隆抗体为购买的鼠源单克隆抗体；bsa(牛血清白蛋白)溶液封闭抗体未结合的位置；pbs缓冲液的ph为7.4；

步骤(3)：光纤生物传感器的制备。将aps光纤传感器的检测端没入安非他命-bsa溶液中，室温静置20-30min；再将aps光纤生物传感器没入质量含量为10％的bsa溶液中，室温静置20-30min；再将光纤生物传感器没入蔗糖溶液中，室温静置20-30min；室温晾干，置于2～8℃干燥保存；

所述的aps光纤传感器是用无水乙醇配置的0.5-2m的aps(aminopropyls-ilane,氨基丙基硅烷)浸泡普通空白光纤传感器的检测端12小时并干燥后制得的，处理后的光纤探头表面能通过蛋白的氨基固定蛋白分子；

安非他命-bsa为安非他命完全抗原，即在bsa表面偶联了安非他命分子，可购买获得；安非他命-bsa溶液浓度为50-100μg/ml；

蔗糖溶液浓度为15％(质量含量)；

步骤(4)：待测样品准备。用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5-1ml溶液的ep管中并旋转混匀后弃掉棉签；ep管内的溶液待用；

所述的棉签为医用一次性棉签，ep管内的溶液为步骤(2)制得的安非他命金标抗体溶液，ep管内的溶液作为后续检测的样品；

步骤(5)：标准曲线的制作。采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①8个步骤(3)制备的光纤传感器没入pbs缓冲液中30-100s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的安非他命标准品溶液中60-100s进行梯度标准品的检测，根据检测结果，绘制标准曲线，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入pbs缓冲液中30-100s进行平衡；

所述的具体过程可通过操作软件设置后仪器自动操作进行；甘氨酸-盐酸缓冲液的ph为1.5-2；光纤传感器经过再生后可重复使用；

步骤(6)：样品检测。采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪对步骤(4)的样品进行检测；检测过程为①步骤(5)平衡后的光纤传感器没入步骤(4)的样品中60-100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入pbs缓冲液中30-100s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，即可求得样品中安非他命的浓度；

本发明的有益效果：

(1)本发明所述方法取样方便，避免检测人员在尿液取样中的不便和对待测人员隐私的侵犯。

(2)本发明所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/ml。

(3)本发明所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。

(4)本发明所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。

附图说明

图1为制备的胶体金的吸光度检测结果。

图2为8个梯度标准品的检测结果。

图3为8个梯度标准品的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详述本发明，但不限于此。

以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。

表1

表2

实施例1：

(1)取100ml超纯水于磁力搅拌器上加热至90℃,加入2ml的1％氯金酸溶液继续加热至沸腾,再快速加入2ml的1％的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾反应10min后，冷却至室温后，采用分光光度计检测，制备的胶体金的吸光度如图1所示，其λmax在525nm处，表明制备的胶体金的直径在40nm左右；

(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节ph至7.2，室温搅拌10min；加入1mg安非他命单克隆抗体,室温搅拌20min；加入2mlbsa溶液封闭抗体,室温搅拌20min；4℃，12000rpm离心20min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100ml的ph＝7.4的pbs缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；

(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5m的aps溶液中12小时后干燥获得aps光纤传感器；将其末端没入50μg/ml安非他命-bsa溶液中，室温静置20min；再将光纤生物传感器没入10％的bsa溶液中，室温静置20min；再将光纤生物传感器没入15％蔗糖溶液中，室温静置20min；室温晾干，置于4℃干燥保存；

(4)用医用一次性棉签沾取1-8号待检人员的下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5ml安非他命金标抗体溶液的1.5ml的ep管中并旋转混匀后弃掉棉签；ep管内的溶液作为后续检测的样品；

(5)采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①将上述制备好的8个光纤传感器没入pbs缓冲液中30s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的安非他命标准品溶液中100s进行梯度标准品的检测，检测结果如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入ph＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中30s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入ph＝7.4的pbs缓冲液中30s进行平衡；

(6)采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪上述待测样品进行检测；检测过程为①将上述平衡后的光纤传感器分别没入1-8号待检样品中100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入ph＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中30s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入ph＝7.4的pbs缓冲液中30s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得1-8号样品中安非他命的含量分别为202.31ng/ml，178.41ng/ml，>1000ng/ml，<10ng/ml，567.15ng/ml，10.53ng/ml，40.67ng/ml，369.55ng/ml；

(7)验证本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得待检人员1-8号唾液中的安非他命含量分别为231.41ng/ml，186.23ng/ml，1210.72ng/ml，1.22ng/ml，591.21ng/ml，12.11ng/ml，45.23ng/ml，381.41ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例2：

(1)取100ml超纯水于磁力搅拌器上加热至90℃,加入2ml的1％氯金酸溶液继续加热至沸腾,再快速加入2ml的1％的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾反应10min后，冷却至室温后，采用分光光度计检测，制备的胶体金的吸光度如图1所示，其λmax在525nm处，表明制备的胶体金的直径在40nm左右；

(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节ph至7.4，室温搅拌10min；加入1mg安非他命单克隆抗体,室温搅拌30min；加入2mlbsa溶液封闭抗体,室温搅拌30min；4℃，12000rpm离心30min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100ml的ph＝7.4的pbs缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；

(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5m的aps溶液中12小时后干燥获得aps光纤传感器；将其末端没入100μg/ml安非他命-bsa溶液中，室温静置30min；再将光纤生物传感器没入10％的bsa溶液中，室温静置30min；再将光纤生物传感器没入15％蔗糖溶液中，室温静置30min；室温晾干，置于4℃干燥保存；

(4)用医用一次性棉签沾取1-8号待检人员的下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5ml安非他命金标抗体的1.5ml的ep管中并旋转混匀后弃掉棉签；ep管内的溶液作为后续检测的样品；

(5)采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①将上述制备好的8个光纤传感器没入pbs缓冲液中60s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的安非他命标准品溶液中60s进行梯度标准品的检测，检测结果如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入ph＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中60s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入ph＝7.4的pbs缓冲液中60s进行平衡；

(6)采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪上述待测样品进行检测；检测过程为①将上述平衡后的光纤传感器分别没入1-8号待检样品中60s进行检测，②检测后的光纤传感器没入ph＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中60s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入ph＝7.4的pbs缓冲液中60s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得1-8号样品中安非他命的含量分别为252.15ng/ml，193.32ng/ml，>1000ng/ml，<10ng/ml，601.24ng/ml，14.21ng/ml，50.41ng/ml，396.47ng/ml；

(7)验证本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得待检人员1-8号唾液中的安非他命含量分别为231.41ng/ml，186.23ng/ml，1210.72ng/ml，1.22ng/ml，591.21ng/ml，12.11ng/ml，45.23ng/ml，381.41ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例3：

(1)取100ml超纯水于磁力搅拌器上加热至90℃,加入2ml的1％氯金酸溶液继续加热至沸腾,再快速加入2ml的1％的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾反应10min后，冷却至室温后，采用分光光度计检测，制备的胶体金的吸光度如图1所示，其λmax在525nm处，表明制备的胶体金的直径在40nm左右；

(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节ph至7.4，室温搅拌15min；加入1.5mg安非他命单克隆抗体,室温搅拌25min；加入1.5mlbsa溶液封闭抗体,室温搅拌25min；4℃，12000rpm离心25min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100ml的ph＝7.4的pbs缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；

(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5m的aps溶液中12小时后干燥获得aps光纤传感器；将其末端没入75μg/ml安非他命-bsa溶液中，室温静置25min；再将光纤生物传感器没入10％的bsa溶液中，室温静置25min；再将光纤生物传感器没入15％蔗糖溶液中，室温静置25min；室温晾干，置于4℃干燥保存；

(4)用医用一次性棉签沾取1-8号待检人员的下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5ml安非他命金标抗体的1.5ml的ep管中并旋转混匀后弃掉棉签；ep管内的溶液作为后续检测的样品；

(5)采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①将上述制备好的8个光纤传感器没入pbs缓冲液中100s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的安非他命标准品溶液中100s进行梯度标准品的检测，检测结果如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入ph＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中100s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入ph＝7.4的pbs缓冲液中100s进行平衡；

(6)采用fortebiooctetred生物分子相互作用仪上述待测样品进行检测；检测过程为①将上述平衡后的光纤传感器分别没入1-8号待检样品中100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入ph＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中100s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入ph＝7.4的pbs缓冲液中100s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得1-8号样品中安非他命的含量分别为236.61ng/ml，195.61ng/ml，>1000ng/ml，<10ng/ml，581.31ng/ml，13.78ng/ml，42.92ng/ml，387.63ng/ml；

(7)验证本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得待检人员1-8号唾液中的安非他命含量分别为231.41ng/ml，186.23ng/ml，1210.72ng/ml，1.22ng/ml，591.21ng/ml，12.11ng/ml，45.23ng/ml，381.41ng/ml，与本发明测得的结果一致。