一种法罗培南杂质的检测方法与流程

本发明涉及高效液相色谱
技术领域：
，具体涉及一种高效液相色谱法测定法罗培南所含杂质中间体c的方法。
背景技术：
：法罗培南钠是由日本suntory公司开发，于1997年上市的一种青霉烯类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强。对β-内酰胺酶稳定，对超广谱β-内酰胺酶产生菌、枸橼酸杆菌、肠球菌有良好作用的特点，罗培南钠由法罗培南经过碳酸钠、碳酸氢钠或2-乙基己酸钠处理得到。因此法罗培南是法罗培南钠生产的关键中间体，法罗培南生由中间体c经过加氢反应制得，由于加氢反应不彻底时法罗培南中会有部分中间体c残留，不仅影响收率，还会对成品法罗培南钠的质量造成影响。为此通过合理的手段检测并控制法罗培南中中间体c的量具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是建立一种法罗培南杂质的检测方法，可以更好的控制法罗培南的质量，更好的对法罗培南中可能存在的中间体c进行检测。本发明的技术方案是：高效液相色谱测定法罗培南中中间体c的方法，它包括如下步骤：系统测试液的制备：称取中间体c对照品置量瓶中，中间体c分子结构图见图1，另称取法罗培南对照品适量，法罗培南分子结构图见图2，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含中间体c3.75μg、法罗培南25μg的混合溶液溶液，作为系统测试液；对照品溶液制备：精密称取法罗培南对照品适量，精密称定，用流动相溶解并用稀释液稀释制成每1ml约含25µg的溶液即得；供试品溶液制备：精密称取本品适量置容量瓶中加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含法罗培南2.5mg的溶液，作为供试品溶液；空白溶液的制备：流动相；测定：高效液相色谱仪的固定相为100%多孔渗水石墨，流动相为0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50，柱温为35℃，检测波长为220nm。吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取数据；计算对照品溶液浓度的值与相应峰面积值的线性回归方程，相关系数而应不小于0.99，对照品溶液峰形对称，理论塔板数以法罗培南2000以上；每克法罗培南中间体中，中间体c总量不得超过50mg。附图说明：图1为中间体c分子结构式；图2为法罗培南分子结构式；图3为法罗培南系统测试液色谱图；图4中间体c峰面积与浓度曲线关系图；图5法罗培南峰面积与浓度曲线关系图。以下通过实施例形式再对本发明的内容做进一步详细说明，但不应就此理解为本发明上述主题范围内仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述技术前提下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改，均包括在本发明内。实施例1色谱柱及流动相的确定系统测试液的制备：称取中间体c对照品置量瓶中，中间体c分子结构图见图，另称取法罗培南对照品适量，法罗培南分子结构图见图2，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含中间体c3.75μg、法罗培南25μg的混合溶液溶液，作为系统测试液；色谱柱：watersxterrarp，150mm×4.6mm×3.50µm；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：5mg/l乙酸铵缓冲液：乙腈=90:10；取系统测试液注入液相色谱仪，结果显示色谱图中出现一个色谱峰。结论：该方法保留时间法罗培南和中间体c无法分离实施例2色谱柱及流动相的确定系统测试液的制备，同实施例1。色谱柱：watersxterrarp，150mm×4.6mm×3.50µm；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液5mg/l乙酸铵缓冲液：乙腈=50:50；取系统测试液注入液相色谱仪，结果显示色谱图中出现一个色谱峰，保留时间为3.53min。结论：法罗培南保留时间太短，理论板数达不到要求。实施例3色谱柱及流动相的确定系统测试液的制备，同实施例1。色谱柱：thermohypercarb，150mm×4.6mm×3.00µm,100%多孔渗水石墨填料；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=80:20；取系统测试液注入液相色谱仪，结果显示色谱图中出现两个色谱峰，法罗培南保留时间为2.64min，中间体c保留时间为2.51min。结论：法罗培南和中间体c不能完全分离，分离度达不到要求。实验例4系统适用性实验系统测试液的制备，同实施例1色谱柱：thermohypercarb，150mm×4.6mm×3.00µm,100%多孔渗水石墨填料；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50。取系统测试液注入液相色谱仪，结果显示色谱图中出现两个色谱峰，法罗培南保留时间为4.72min，中间体c保留时间为3.79min，结果见图3。结论：法罗培南和中间体c能完全分离，分离度达符合要求。实验例5线性和范围色谱柱：thermohypercarb，150mm×4.6mm×3.00µm,100%多孔渗水石墨填料；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50；取不同浓度的中间体c和法罗培南溶液注入色谱仪结果见图4、5和表1、2。表1中间体c峰面积与浓度曲线关系表浓度ug/ml平均峰面积峰面积rsd5.3612240.47%4.7520410.86%3.8426621.86%1.9216352.38%0.9124052.95%0.445900.03%表2法罗培南峰面积与浓度曲线关系表浓度ug/ml平均峰面积峰面积rsd28.93671560.78%24.13036460.22%9.61231232.01%5.6649201.28%4.7569170.89%3.8456031.99%1.9225962.13%0.9132801.45%0.3856570.42%结论：中间体c在0.4~5.3μg/ml范围内y=13147.8x+885.5r=0.999，法罗培南0.4~28.92μg/ml范围内y=12692.8x-1252.0r=0.9998，各峰峰面积与浓度呈良好线性关系。实验例6检测限与定量限色谱柱：thermohypercarb，150mm×4.6mm×3.00µm,100%多孔渗水石墨填料；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50；检测限和定量限是根据通过信噪比法来确定的，测出的信号与空白处的信号进行比较，算出能被可靠的检测出的最低浓度或百分比。当s/n≈3时为检测限，当s/n≈10时为定量限。结论：中间体c检测限为0.0814µg/ml，法罗培南检测限为0.2088µg/ml。实验例7精密度试验色谱柱：thermohypercarb，150mm×4.6mm×3.00µm,100%多孔渗水石墨填料；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50；精密称法罗培南对照品适量，精密称定，用流动相溶解并用稀释液稀释制成每1ml约含25µg的溶液，连续进对照品溶液6针；记录色谱图。平均峰面积的rsd为1.7%结论：该方法的进样精密度良好。实验例8重复性试验色谱柱：thermohypercarb，150mm×4.6mm×3.00µm,100%多孔渗水石墨填料；波长：220nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50；重复性是通过配制6个样品溶液并进行测试，每个溶液进样1针来验证的，结果见表3。表3法罗培南重复性测试结果表序号浓度中间体c未知杂质总杂质12.5970.13%未检出0.13%22.5470.13%未检出0.13%32.4380.12%未检出0.12%42.5020.12%未检出0.12%52.510.13%未检出0.13%62.5120.13%未检出0.13%rsdn/a　2.97%n/a2.97%结论：6次测定结果的含量在检测限以上的各杂质峰数一致，杂质之和的绝对偏差不得超过质量标准的50%，上表结果表明该方法的重复性良好。实验例9液相色谱条件耐用性，流动相比例变化对分离度的影响。流动相变化1：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=45:55；流动相变化2：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=55:45；原始流动相比例：0.1mol/l甲酸铵缓冲液，10mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇=50:50，测试结果见表4。表4流动相比例变化测试结果对比表流动相变化流动相变化1流动相变化2原始流动相比例分离度4.383.974.17结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见流动相比例在条件允许范围内变化对杂质分离没有影响。实验例10液相色谱条件耐用性，柱温变化对分离度的影响将柱温变化为：变化1：30℃、变化:2：40℃、柱温：35℃，测试结果见表5。表5柱温变化测试结果对比表柱温30℃40℃35℃分离度4.104.274.17结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见柱温在30℃～40℃范围内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。实验例11液相色谱条件耐用性，流速变化对分离度的影响将流速变化为：流速变化1：流速0.9ml/min，流速变化2：流速1.1ml/min，原始流速：流速1.0ml/min，测试结果见表6。表6流速变化测试结果对比表流速0.9ml/min1.1ml/min1.0ml/min（原始流速）分离度4.154.204.17结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见流速在0.9ml/min～1.1ml/min范围内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。实验例17液相色谱条件耐用性，检测波长变化对分离度的影响将检测波长变化为：检测波长1：218nm、检测波长2:222nm、原始波长：220nm，测试结果见表7。表7检测波长变化测试结果对比表波长218nm222nm220nm分离度4.174.184.17结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见波长在218nm～220nm范围内色谱条件的变化对杂质分离没有影响。当前第1页12