一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白方法与流程

本发明属分析化学技术领域，涉及一种糖蛋白质谱相对/绝对定量的方法，具体涉及基于糖蛋白上不含糖基化位点的肽段(非糖肽)，利用质谱多反应监测定量糖蛋白的新方法。

背景技术：

现有技术公开了蛋白质糖基化是生物体内最复杂、最重要、也是最普遍的后修饰之一。蛋白质的糖基化修饰在生物体起着极其重要的作用。研究显示，蛋白质糖基化水平异常变化不仅影响着糖蛋白的生物功能，还与许多疾病密切相关，如，fda认证的癌症标志物中有25％是糖蛋白。可见，高效、准确的定量不同生理状态下的糖蛋白的变化，对于疾病机制研究及临床检验都有着重要的意义。

由于蛋白质糖基化具有宏观、微观不均一性，丰度低，离子化效率低，质谱检测困难等特点，使得对其定量存在着很大的技术挑战。近年发展的质谱多反应监测技术(mrm-ms)被认为是一种快速、高特异性、高准确性的质谱定量技术。还有研究将mrm用于糖蛋白定量的技术，如单个完整糖肽定量技术，岩藻糖修饰的肽段定量技术等。虽然mrm在糖蛋白质组定量中显示出了一定的优势和潜力，但是糖蛋白的mrm定量分析仍然存在很大挑战：由于糖蛋白含有n-糖基化位点的肽段仅有5％，限制了用于糖蛋白定量的肽段的选择；以及由于糖肽存在高度异质性，会影响定量结果的准确性。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基于非糖肽的mrm糖蛋白的定量方法，本方法能解决mrm技术在糖蛋白定量方面的困难，在糖蛋白质组学、糖生物学、生物医学、临床研究等领域具有着良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种准确、高效的糖蛋白相对/绝对定量方法，具体涉及一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白方法。本方法中利用肼化学法对样品中的糖蛋白进行富集，用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，利用色谱-质谱鉴定技术对非糖肽进行鉴定，合成适用于mrm定量的标准肽段，然后对这些肽段的保留时间，能量，母子离子对进行质谱优化，并建立相应的数据库；并将肽段可用于样品中糖蛋白的绝对/相对定量。

具体的，本发明提出的糖蛋白相对/绝对定量方法，是采用质谱多反应监测技术，对糖蛋白的非糖肽进行定量，从而实现对糖蛋白的相对/绝对定量的方法；它包括以下步骤：首先用肼化学法特异性的富集样品中的糖蛋白；然后利用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽(糖蛋白上不含糖基化位点的肽段)；再用色谱-质谱技术对这些非糖肽进行鉴定；并挑选可用于质谱多反应监测分析的非糖肽，合成标准非糖肽；利用质谱多反应监测技术对这些标准的非糖肽进行质谱优化；对这些非糖肽进行mrm定量分析，从而实现样品中糖蛋白质的相对/绝对定量。

本发明提出的基于糖蛋白mrm定量的方法，基于糖蛋白上不含糖基化位点的肽段，给可用于mrm分析的肽段提供了更多选择的可能性，避免了糖肽分析的限制性；同时避免了糖基化的微观不均一性以及多糖基化位点的糖肽对定量结果准确性产生的影响。

更具体的，本发明的一种基于糖蛋白非糖肽的质谱多反应监测定量糖蛋白的方法，其特征在于，采用肼化学法及串联质谱法鉴定糖蛋白上的非糖肽，其中，对所述非糖肽进行挑选并合成标准肽段，利用质谱多反应监测技术对所述非糖肽进行质谱定量条件优化后，实现所述非糖肽的糖蛋白质的相对/绝对定量；其包括步骤：

(1)用肼化学法特异性的富集样品中的糖蛋白；

(2)用蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，所述的非糖肽为糖蛋白上不含糖基化位点的肽段；

(3)用色谱-质谱技术鉴定所述的非糖肽；

(4)挑选可用于质谱多反应监测分析的非糖肽，并合成标准非糖肽；

(5)利用质谱多反应监测技术对获得的标准的非糖肽进行质谱优化；并利用优化的条件实现样品中糖蛋白质的相对/绝对定量。

本发明中，步骤(1)中富集方法为肼化学法或以肼化学法为基本原理的富集方法。

本发明中，所述步骤(2)中使用的蛋白酶根据蛋白序列选自胰蛋白酶或lys-c蛋白酶，arg-c蛋白酶，所述的蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，得到的非糖肽长度适合质谱分析。

本发明中，步骤(4)中挑选的非糖肽是：1)肽段不含漏切位点；2)在质谱中带2+或3+电荷；3)肽段氨基酸组成不含甲硫氨酸(met)；4)肽段长度为5-25个氨基酸。

本发明中，步骤(5)中采用多反应监测技术对非糖肽进行质谱优化，优化的参数包括保留时间(rt)，碰撞能量(ce)，母子离子对。

本发明中，步骤(5)中通过掺入合成的重同位素标记的非糖肽，或以合成的标准非糖肽做标准曲线，实现糖蛋白的绝对/相对定量。

本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现糖基化的单个蛋白质/糖蛋白质组的快速、精准定量。

本发明方法的积极效果有：

1.基于非糖肽定量糖蛋白，增加了mrm选择肽段的范围，使得更多的肽段成为候选肽段，增加定量的可靠性和准确性；

2.非糖肽上不含糖基化位点和糖链，避免了糖基化微观不均一性对糖蛋白定量产生的影响，增加定量准确性和重复性；

3.非糖肽易于合成，成本比糖肽低，大大降低了糖蛋白定量实验的经济成本；

4.定量的样本无样本类型的限制，应用范围广；

5.可实现糖蛋白的相对(不同样本间比较)，以及绝对(同一样本质含量)定量。

附图说明

图1为本发明方法的技术流程图，其中显示了，首先富集糖蛋白并鉴定糖蛋白的非糖肽，然后对这些非糖肽进行分析优化，最后利用mrm对这些非糖肽进行定量从而实现糖蛋白的相对/绝对定量。

图2为该本方法用于标准糖蛋白的定量分析结果，其中显示了采用本方法对标准蛋白辣根过氧化物酶(a图)和胎球蛋白(b图)进行定量分析，并将定量结果与实际混合比值作散点图。

图3为本发明方法用于血清中的5个糖蛋白定量分析，其中显示了采用本发明方法分别对血清中的5个糖蛋白进行定量分析，依次为(a图，蛋白p01781)(b图，蛋白p00738)(c图，蛋白p12259)(d图，蛋白p04004)(e图，蛋白p02771)，(f图，5个蛋白在正常人血清和肝癌病人血清的定量结果)。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体步骤作进一步描述。

以标准蛋白辣根过氧化物酶hrp、去唾液酸化的胎球蛋白asf，以及正常人和肝癌病人血清中几个糖基化蛋白为例说明本发明方法的具体实施方式。

实施例1

将用肼化学法富集样品中的糖蛋白，洗去非特异性富集的蛋白之后，用蛋白酶酶切被抓住的糖蛋白，并收集这些非糖肽，用液质联用鉴定这些非糖肽；

对这些鉴定到的非糖肽进行挑选，挑选规则是：1)肽段不含漏切位点；2)在质谱中带2+或3+电荷；3)肽段氨基酸组成不含甲硫氨酸(met)；4)肽段长度为5-25个氨基酸；并用mrm质谱技术对这些非糖肽进行检测，优化鉴定条件；

合成标准的非糖肽或重标氨基酸的标准非糖肽；用mrm质谱鉴定技术实现实际样品的相对/绝对定量；

本发明中，富集方法为肼化学法或以肼化学法为基本原理的富集方法；

本发明中，使用的蛋白酶根据蛋白序列选自胰蛋白酶或lys-c蛋白酶，arg-c蛋白酶，所述的蛋白酶释放糖蛋白的非糖肽，得到的非糖肽长度适合质谱分析；

本发明中，步骤(5)中采用多反应监测技术对非糖肽进行质谱优化，优化的参数包括保留时间(rt)，碰撞能量(ce)，母子离子对；

本发明中，步骤(5)中通过掺入合成的重同位素标记的非糖肽，或以合成的标准非糖肽做标准曲线，实现糖蛋白的绝对/相对定量；

采用本发明方法用于血清中的5个糖蛋白定量分析，结果显示了采用本发明方法分别对血清中的5个糖蛋白进行定量分析(如图3所示，其中依次为a图，蛋白p01781，b图，蛋白p00738，c图，蛋白p12259，d图，蛋白p04004，e图，蛋白p02771，f图，5个蛋白在正常人血清和肝癌病人血清的定量结果)，具体优化参数如表1所示(5个蛋白的标准曲线的r²均在0.989以上，cv均小于0.2)。

实验显示，本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现糖基化的单个蛋白质/糖蛋白质组的快速、精准定量。

表1：绝对定量蛋白信息

虽然本发明已以较佳之实施方式详述如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技术者，在不脱离本发明之精神和范围内，可作些许更动和润饰，本发明之保护范围当视所附之权利要求范围所界定。