用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法与流程

本发明属于生物试剂制备领域，特别涉及一种用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法。

背景技术：

孢子丝菌病是由孢子丝菌复合体中的一种真菌感染所致慢性化脓性肉芽肿性的疾病，可以引起皮肤、皮下组织及附近淋巴系统的亚急性或慢性感染,另外也可引起黏膜、骨骼甚或系统性病变。

孢子丝菌复合体包括：申克氏孢子丝菌，白色孢子丝菌、巴西孢子丝菌、球形孢子丝菌、卢里孢子丝菌和墨西哥孢子丝菌。

孢子丝菌为双相型真菌，在24℃为菌丝相，在37℃培养或者在感染的人体组织时为酵母相。当孢子丝菌侵入人体组织时，孢子丝菌细胞壁成分作为粘附素和免疫诱导剂，会诱导刺激机体产生抗体。有文献表明，孢子丝菌酵母细胞的细胞壁上有一个大约70kda糖蛋白(gp70)，有规律地沿着真菌细胞壁分布，介导粘附到细胞外，这是孢子丝菌特有的，在其它的致病性和非致病性真菌尚未被检测到，因此可利用此蛋白(gp70)作为抗原标志物，通过检测血清中gp70的抗体，进而鉴定孢子丝菌病。目前临床诊断方式：结合临床表现、真菌培养和组织病理检查可明确诊断。其中，真菌培养是孢子丝菌病诊断的金标准。但是这两种方法存在耗时长、操作繁琐、技术要求高等缺点，不利于快速诊断筛查，不适合在基层医疗机构的检测应用。

凝集反应是一种基于免疫学的反应，过程为颗粒性抗原(完整的病原微生物或细胞等)与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块，可进行结果判读。但是直接凝集反应中的颗粒型抗原，常规使用的是新鲜细胞或者细菌，不宜长期保存，以及操作繁琐等缺陷。

技术实现要素：

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，该血清凝集剂基于凝集反应原理，利用固定化处理的完整的孢子丝菌作为颗粒性抗原(该颗粒性抗原同时具备颜色指示作用)，可与待检样品(血清、血浆)中的孢子丝菌特异抗原标志物的抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应可以判定待检样品中是否存在孢子丝菌抗体，从而进一步可初步判断患者是否被孢子丝菌感染。

为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

一种用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，其包括：

1)培养孢子丝菌酵母相；

2)取出培养的孢子丝菌酵母相，用pbs缓冲液离心洗涤，去除上清；

3)向洗涤后的孢子丝菌酵母相中加入-20℃预冷的预固化液，混匀，置于4℃中反应0.5-2小时；随后在4℃下离心，去除上清，加入2-4％多聚甲醛，震荡混匀后，在4℃下固定保存过夜；

4)加入0.1-0.5％tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5-1％bsa(牛血清白蛋白)、5-10％的蛋白保护剂和0.02-0.05％的proclin300，混匀；

5)加入染色剂，反应10-20min后，离心去上清，以pbs缓冲液稀释，获得血清凝集剂；

其中，所述预固化液中至少包括有乙二醇和甘油磷酸酯。

优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，其中，所述预固化液中还包括有乙醇。

优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，其中，所述乙二醇和甘油磷酸酯的质量比为10-15∶2-3。

优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，其中，所述乙二醇、甘油磷酸酯和乙醇的质量比为10-15∶2-3∶100。

优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，其中，所述蛋白保护剂包括有甘油和氯化钾。

优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，其中，所述蛋白保护剂中，甘油和氯化钾的质量比为100∶5-8。

一种如上述方案中任一项所述的制备方法所制得的血清凝集剂。

本发明的有益效果是：

1、本案对孢子丝菌进行固化处理，使其能长期保存，同时保护其表面细胞壁抗原的活性。

2、本案将固化孢子丝菌通过染色液处理，附着有明显的颜色，制备成固化孢子丝菌指示株，具有颜色指示作用，可更清晰、更便于凝集结果的观测。

3、本案无需仪器、成本低、快速、操作简便、结果直观，尤其适合基层医疗机构的检测应用，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为血清凝集剂的显微镜图(美蓝染色40×)。

图2为血清凝集剂与不同浓度抗体的凝集图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

本案列出一实施例的用于检测孢子丝菌病的血清凝集剂的制备方法，包括：

固化孢子丝菌制备；

收集菌体：培养孢子丝菌酵母相，收集固体平板上培养的孢子丝菌酵母相，用pbs缓冲液(磷酸缓冲液)离心洗涤三次，1000-1500rpm，5min，4℃。去除上清。

固化处理：将菌体沉淀中加入-20℃预冷的预固化液进行预固化，缓慢震荡并混匀，菌体浓度可优选稀释至5-10％，置于4℃冰箱中作用30min-2小时。然后，1000-1500rpm，5min，4℃离心，去除上清，向沉淀中加入10倍体积2-4％多聚甲醛，轻轻震荡混匀后，4℃固定保存过夜。预固化液中包括有乙二醇、甘油磷酸酯和乙醇，乙二醇、甘油磷酸酯和乙醇的质量比优选为10-15∶2-3∶100。

预固化的目的是：造成组织间质成分减少，便于后续染色。预固化液中乙醇属于非交联性固定剂，蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解。乙二醇主要用于提高细胞在低温下的脱水速率。甘油磷酸酯主要用于增加细胞膜结构的通透性。乙二醇、甘油磷酸酯和乙醇三者共同作用，用于改善染色液的染色效果，以提高目视判断的准确率。

多聚甲醛属于交联性固定剂，可稳定结构，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。多聚甲醛通过细胞壁蛋白质变性交联，达到固定作用。

长期保存：在上一步的2-4％多聚甲醛中，加入0.1-0.5wt％tritonx-100(维持细胞膜流动性，便于后续菌体染色)，0.5-1wt％bsa，5-10％的蛋白保护剂，0.02-0.05wt％的proclin300(抗菌防腐)，作为长期保存溶液。可选的保存浓度：10-20％。蛋白保护剂包括有甘油和氯化钾，甘油和氯化钾的质量比优选为100∶5-8。氯化钾用于增加血清凝集剂与相应抗体的凝集速率。

固化孢子丝菌指示株制备；

取1ml10％固化孢子丝菌，无需离心，直接加入等体积染色液(常规染色液即可，例如美蓝染色液等)，混匀，作用10-20min。1000-1500rpm，5min，离心，去上清。加入pbs缓冲液。洗涤离心一次，去上清，用pbs将固化孢子丝菌指示株稀释为2-5％待用，从而制得血清凝集剂(如图1所示)。

样品检测；

1.取同一待检血清，用生理盐水倍比稀释(1:20、1:80、1:320、1:1280)，分别吸取50μl，置于u型反应板。

2.取制备好的5％浓度的固化孢子丝菌指示株(缓冲液置换为0.9％生理盐水)，每孔加入50μl。

3.充分振摇混匀后，置于37℃温箱0.5h或45℃温箱10min，孵育。

结果观测

观察原则：轻轻取出u型反应板，观察孔内的上清液浊度和底部凝集物，注意观察凝集物的松软程度、大小、均匀度等性状，最后按液体的清浊、凝块的性状记录结果。

判定标准：

"-"液体均匀混浊，管底无凝集物，不凝集。

"+"液体透明度较差，管底有少量凝集物，为25％凝集。

"++"液体中等混浊，管底有中等量的伞状沉淀，50％菌体凝集。

"+++"液体几乎透明，管底有明显伞状沉淀，75％菌体凝集。

"++++"液体完全透明，管底出现大片的伞状沉淀，100％菌体凝集。

本实施例的凝集反应结果如图2所示，倍比稀释为1:20、1:80、1:320、1:1280分别对应图2中的“++++强凝集”、“++明显凝集”、“+弱凝集”和“-无凝集”。稀释倍数低，待检血清中的抗体浓度高；稀释倍数高，抗体浓度低；图2说明本技术方案是可以用于凝集测试的。

对比例1

以实施例1中倍比稀释为1:20的为基准，将预固化液中的乙二醇删去，甘油磷酸酯和乙醇的质量比为2-3∶100，其余条件与实施例1相同。

凝集反应结果为“++明显凝集”，说明失去了乙二醇在低温下的脱水效果，使得菌体的固化效果下降，从而影响最终的凝集反应结果。

对比例2

将倍比稀释分别调整为1:1和1:5，其余条件与对比例1相同。

凝集反应结果分别对应为“++++强凝集”和“++明显凝集”，说明在使用不含乙二醇的预固化液后，需大幅提高待测抗体的浓度，降低了血清凝集剂的检测限。

对比例3

以实施例1中倍比稀释为1:20的为基准，将预固化液中的甘油磷酸酯删去，乙二醇和乙醇的质量比为10-15∶100，其余条件与实施例1相同。

凝集反应结果为“++明显凝集”，说明失去了甘油磷酸酯对细胞膜结构通透性的改进，使得最终菌体的固化效果下降，进而影响最终的凝集反应结果。

对比例4

将倍比稀释分别调整为1:1和1:5，其余条件与对比例3相同。

凝集反应结果分别对应为“++明显凝集”和“++明显凝集”，说明在使用不含甘油磷酸酯的预固化液后，即使提高待测抗体的浓度，也无法明显改进最终的凝集反应结果。

对比例5

以实施例1中倍比稀释为1:20的为基准，将蛋白保护剂中的氯化钾删去，其余条件与实施例1相同。

凝集反应结果为“++明显凝集”，说明血清凝集剂在一定时间内未完全与待测抗体发生凝集。

对比例6

将倍比稀释分别调整为1:1和1:5，其余条件与对比例5相同。

凝集反应结果分别对应为“++明显凝集”和“++明显凝集”，说明待测抗体浓度的提升对凝集速率的影响不明显。

对比例7

将样品检测步骤中的孵育时间调整为“置于37℃温箱2h或45℃温箱1h”，其余条件与对比例5相同。

凝集反应结果为“++++强凝集”，说明如若使用不含氯化钾的蛋白保护剂，则需要更长的凝集时间才能全部完成凝集反应，由此表明氯化钾能够提高血清凝集剂与相应抗体的凝集速率。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。