本发明涉及用于确定化妆产品中是否存在毒物的方法。具体而言，本发明涉及在试验中使用硬骨鱼胚胎以确定化妆产品中毒物的存在的方法。
背景技术：
随着现代化及全球化的兴起，消费产品(诸如化妆品)在到达消费者前，会经历许多其中具有潜在有毒化学品进入这些产品的制程。美国环境保护署(usenvironmentalprotectionagency)追踪或管制100,000种以上化学品(物质登记服务数据简报(substanceregistryservicesfactsheet)，可在ofmpub.epa.gov/sor_internet/registry/substreg/educationalresources获得)，且许多这些化学品的毒性(特别是这些化学品与其他化学品组合时的总生物毒性)尚未被很好地研究。鉴于会进入化妆产品中的潜在有毒化学品及化学品组合的庞大数量，确保化妆产品的安全性对现代测试工业是巨大挑战。
迄今为止，化妆产品的毒性测试仍很大程度上是依赖于化学特异性测试、尤其化学分析。例如，一回顾文献与本技艺的整体状态相关，且其关于测定化妆产品中经许可的成分的萃取及层析技术的技术知识(analyticachimicaacta915,(2016)pp.1-26)。虽然化学特异性测试是灵敏及精确的，但其无法检测不意欲特定测试的未知毒物；此使得未预期的毒物未能被检测到。即使在其中样品的化学组成详细已知的情形下，由于缺少关于化学混合物的效应的知识，其有效毒性不一定能可靠地预测。实务经验与研究已显示，化学特异性量测仅有约20％的机会鉴别出未知样品的真实毒性，此意味着高达80％的毒物未能被鉴别出来。
因此，需要用于确定化妆产品中是否存在毒物的新颖方法。例如，一文献提供吡啶硫酮锌(zincpyrithione，zpt)的早期生命阶段的试验，以及将包含或不包含zpt的商品化的洗发精于斑马鱼及日本青鳉(medaka)进行试验(environmentalresearchsectiona81,81-83,1999)。美国第2013/152222号专利公开案与转基因鱼及其用途相关，特别是侦测雌激素(estrogenic)及抗雌激素(anti-estrogenic)化合物、监控环境中类雌激素的活性及阐述肝脏再生的用途。然而，仍有需要发展侦测样品中毒物的生物试验。
技术实现要素：
本揭示内容提供确定化妆产品中是否存在毒物的方法，其包含使硬骨鱼胚胎与化妆产品的样品或来自化妆产品的样品的提取物接触并确定所述样品或所述提取物是否对胚胎产生毒性效应，其中对胚胎的毒性效应可指示在化妆产品中存在毒物。可使用本揭示内容的方法测试的例示性化妆产品阐述于章节4.2中。在一些实施例中，提取物包含有机溶剂提取物(例如，甲醇提取物)。在其他实施例中，提取物包含有机及无机溶剂提取物(例如，甲醇及水提取物)。制备来自用于毒性测试的化妆产品的提取物的方法阐述于下文的章节4.3及4.4及编号的实施例9至21中。
在一些实施例中，本揭示内容的测试方法包含确定样品或提取物是否对硬骨鱼胚胎产生毒性效应，例如急性效应(例如，畸形或死亡)或特定效应(例如，雌激素活性干扰)。在一些实施例中，测试方法包含使硬骨鱼胚胎与有机溶剂提取物或有机及无机溶剂提取物接触，所述有机溶剂提取物或有机及无机溶剂提取物通过或是通过如下文的章节4.3、章节4.4或编号的实施例9至21的一者中所述的制程可获得。确定化妆产品中是否存在毒物的例示性方法阐述于下文的章节4.5及编号的实施例1至64中。在一些实施例中，硬骨鱼是青鳉或斑马鱼胚胎(如章节4.5.1-4.5.2中所述)，且在一些实施例中可是转基因的。可使用本揭示内容的方法确定的急性及特定毒性效应分别阐述于章节4.5.3及4.5.4中。例示性急性毒性效应包括死亡及畸形，且例示性特定毒性效应包括雌激素活性干扰、雄激素活性干扰、异型生物质效应、心脏毒性效应及肝毒性效应。
本揭示内容提供的样品测试方法可用于(例如)评估化妆产品的样品或来自化妆产品的提取物的总生物毒性效应。本揭示内容的方法可以高通量方式用于测试大量样品，提供(例如)确定大量化妆产品的生物安全性的方法。
具体实施方式
4.1.概述
本发明提供一种测定化妆产品样品中的毒性概况的生物分析方法。与检测特定毒物的化学方法的显着不同在于本发明的生物分析得到样品的整体毒物概况，其可作为样品毒性的指标。相对于化学分析，在用于本发明方法的前处理过程中，并无任何毒性物质添加于样品中，且用于本方法的试剂不会与样品反应并改变样品的毒性。因此，本发明提供一种测定化妆产品中整体毒性的方法。
在一方面，本发明提供一种测定化妆产品中整体毒性的方法，其包含：
(a)将溶剂与化妆品产品结合以得到具整体毒性的溶剂提取物；
(b)将硬骨鱼胚胎与a)的溶剂提取物接触；及
(c)测定所述提取物是否对所述胚胎具毒性作用；
其中对所述胚胎具毒性作用显示化妆产品的整体毒性。
本揭示内容提供确定化妆产品中是否存在毒物的方法。方法包含使硬骨鱼胚胎与化妆产品的样品或来自化妆产品的样品的提取物接触并确定所述样品或提取物是否对胚胎产生毒性效应，其中对胚胎的毒性效应指示化妆产品中存在毒物。有利地，本揭示内容的方法可用于监测化妆品的总生物毒性，相比下，化学特异性测试通常仅检测一种类型的毒物或一组毒物的存在。可使用本揭示内容的方法测试的例示性化妆产品阐述于章节4.2中。用于制备来自化妆产品的样品的提取物的制程详细阐述于章节4.3及4.4中，且确定化妆产品样品或化妆产品提取物中是否存在毒物的方法阐述于章节4.5中。
4.2.化妆产品
化妆产品可为意欲与人类或动物身体的各个外部部分(表皮、毛发系统、指甲、唇及外生殖器)或与牙齿及口腔的黏膜接触以便唯一地或主要来使其清洁、使其具香气、改变其外观及/或消除身体气味及/或保护其或使其保持处于良好状态的任何物质或混合物。在一些实施例中，化妆产品是意欲施用至人体的产品。
化妆产品的例示性类别包括但不限于用于皮肤(例如，手、脸、脚等)的霜剂、乳液、洗剂、凝胶及油；面膜；粉底(例如，液体、膏状物、粉末)；化妆粉、浴后粉、卫生粉等；香皂、除臭皂等；香水、化妆水及古龙水(eaudecologne)；洗浴混合物(例如，盐、泡沫、油、凝胶等)；脱毛剂；除臭剂及止汗剂；护发产品(例如，染发剂及漂色剂、用于烫发、顺发及固定的产品、定型产品、清洁产品(例如，洗剂、粉、洗发精)、调理产品(例如，洗剂、霜剂、油)、美发产品(例如，洗剂、发胶、润发油))；剃须产品(例如，霜剂、泡沫、洗剂等)；用于化妆及自脸部及眼部卸妆的产品(例如，卸妆剂)；意欲施加至唇的产品；用于护理牙齿及口腔的产品；用于指甲护理及化妆的产品；用于外部私处卫生的产品；日光浴产品；用于无阳光晒黑的产品；皮肤增白产品；及抗皱产品。
例示性化妆品包括面膜、香水、止汗剂、除臭剂、牙膏、洗发精、精油、卸妆剂、清洁产品、染发剂、粉底、遮瑕膏、防晒剂、保湿剂、抗皱霜、眼影膏、眼线膏、睫毛膏、腮红、唇膏、唇彩、指甲油、精华液、眼霜、晚霜、日霜、bb霜、夜用凝露、日用凝露、护手霜、颈霜、抗老化霜、沐浴乳、洗发精及护发素。在一些实施例中，化妆品是粉底。在一些实施例中，化妆品是遮瑕膏。在一些实施例中，化妆品是防晒剂。在一些实施例中，化妆品是保湿剂。在一些实施例中，化妆品是抗皱霜。在一些实施例中，化妆品是眼影膏。在一些实施例中，化妆品是眼线膏。在一些实施例中，化妆品是睫毛膏。在一些实施例中，化妆品是腮红。在一些实施例中，化妆品是唇膏。在一些实施例中，化妆品是唇彩。在一些实施例中，化妆品是指甲油。在一些实施例中，化妆品是精华液。在一些实施例中，化妆品是眼霜。在一些实施例中，化妆品是晚霜。在一些实施例中，化妆品是日霜。在一些实施例中，化妆品是bb霜。在一些实施例中，化妆品是夜用凝露。在一些实施例中，化妆品是日用凝露。在一些实施例中，化妆品是护手霜。在一些实施例中，化妆品是颈霜。在一些实施例中，化妆品是抗老化霜。在一些实施例中，化妆品是沐浴乳。在一些实施例中，化妆品是卸妆剂。在一些实施例中，化妆品是染发剂。在一些实施例中，化妆品是洗发精。在一些实施例中，化妆品是护发素。
可使用本揭示内容的方法测试的化妆产品的样品包括全部化妆产品(例如，一管面霜的全部内容物)或其一部分。术语「样品」亦包括已稀释于溶剂中的化妆产品样品(例如，稀释于水或硬骨鱼培养基中的水可混溶化妆品的样品)。
4.3.化妆产品提取物
可用于本揭示内容的毒性测试方法中的提取物可自化妆产品(例如先前阐述于章节4.2中的那些)的样品加以制备。可用于本揭示内容的毒性测试方法中的提取物较佳是有机溶剂提取物或有机及无机溶剂提取物。术语「有机溶剂」当与术语「有机溶剂提取物」结合使用时是指用于自化妆产品的样品提取化合物的特定有机溶剂或有机溶剂的混合物，且不一定是指其中提取物可在任何给定时间溶解的溶剂。举例而言，通过使用甲醇自样品提取化合物而制备的提取物仍是甲醇提取物，即使在其中在提取的后提取物经处理去除甲醇的情形下亦是如此。因此，举例而言，已经干燥去除甲醇并随后再溶解或重新悬浮于另一溶剂(例如二甲基亚砜)中的甲醇提取物仍是甲醇提取物，即使处于其现有状态的提取物含有除甲醇的外的另一溶剂。同样地，术语「有机溶剂」及「无机溶剂」当与术语「有机溶剂及无机溶剂的提取物」结合使用时是指用于自化妆产品的样品提取化合物的有机及无机溶剂。
可用于制造有机溶剂提取物的有机溶剂包括甲醇、二甲基亚砜(dmso)、乙腈、丙酮、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、氯仿、己烷及其混合物。较佳有机溶剂包括能够溶解极性及非极性有机分子的有机溶剂，例如甲醇及dmso。例示性无机溶剂是水。在一些实施例中，使用甲醇来制造有机溶剂提取物。在其他实施例中，使用dmso来制造有机溶剂提取物。在其他实施例中，使用甲醇与dmso的混合物来制造有机溶剂提取物。在一些实施例中，使用甲醇与水的混合物来制造有机及无机溶剂提取物。在一些实施例中，使用dmso与水的混合物来制造有机及无机溶剂提取物。
有机溶剂提取物通过包含以下的制程可获得：将化妆产品的样品与有机溶剂(例如，甲醇)组合以形成混合物、混合所述混合物、自所述混合物分离含有有机溶剂的相并回收提取物。有机溶剂的体积可基于样品的量及/或性质(例如，样品的稠度)来选择或改变。与样品组合以形成混合物的有机溶剂的体积(例如)约1.5倍至约10倍样品重量或体积。亦即，当所述样品为液体时，所述溶剂的体积为样品体积的约1.5至约10倍；当所述样品为固体或半固体时，所述溶剂的体积为样品重量的约1.5至约10倍(例如，约1.5至约8倍、约2倍至约5倍、约1.5倍至约3倍、约2倍至约4倍或约2倍至约4倍样品重量或体积)。在一些实施例中，有机溶剂(例如，甲醇)的体积是至少3倍样品重量或体积。与较低的有机溶剂对样品比率对比，较高的有机溶剂对样品比率在一些情形下可容许较高量的毒物提取；然而，较高的有机溶剂对样品比率产生更稀的提取物，端视于提取物的稀释程度，其可需要在毒性试验中测试提取物的前浓缩。
将混合物混合可通过(例如)摇动混合物、涡旋(vortex)混合物、音波处理混合物或其组合来进行。在一些实施例中，混合包含涡旋及音波处理混合物。
自混合物分离含有有机溶剂的相包含使混合物离心以自所述混合物分离含有有机溶剂的相。或者，可在重力下分离各相，但与使用离心分离混合物相比，在重力下分离混合物可需要更长时间完成。对于含有不完全可溶或不溶于有机溶剂的固体颗粒(例如，闪光剂或矿物颗粒)的化妆品而言，可使用过滤以自混合物分离含有有机溶剂的相(例如，使用重力、离心或真空过滤)。
在分离后，有机溶剂提取物可通过(例如)以下回收：通过吸管从其他相吸移含有有机溶剂的相、倾析所分离的相或使用分液漏斗分离各相(例如，当非使用离心分离各相时)。
用于获得有机溶剂提取物的制程可包括使用一或多种盐及/或糖以助于将毒物自化妆产品的样品提取至有机溶剂。举例而言，形成混合物可包含将化妆产品的样品与有机溶剂及与以下组合：(i)盐(例如，氯化钠、硫酸镁、氯化钙、氯化镁、乙酸钠、乙酸铵、无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水氯化钙、无水硫酸钙、或其组合)、及/或(ii)糖(例如，单醣及/或二醣，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、麦芽糖、蔗糖及其混合物)。在一些实施例中，盐是氯化钠。在一些实施例中，糖是蔗糖。使用无水盐有助于吸收可存在于混合物中的水且可用来提供脱水有机溶剂提取物。在本揭示内容的上下文中，且除非上下文另有要求，否则未明确鉴别为呈水合或无水形式的盐涵盖盐的水合及无水形式两者。举例而言，「氯化钙」涵盖氯化钙的无水及水合形式(即，cacl2(h2o)x，其中x＝0、1、2、4或6)。亦可将盐及/或糖添加至化妆产品的样品与有机溶剂的预形成的混合物，例如直至混合物经盐及/或糖饱和为止(例如，如通过在混合物内观察到不溶解的盐或糖晶体所指示)。然后，可自混合物分离含有有机溶剂的相并回收有机溶剂提取物，例如如先前段落中所述。
用于获得有机溶剂提取物的制程亦可包括脱水步骤及/或去脂步骤。脱水步骤可包含将有机溶剂提取物与一或多种无水盐(例如，先前段落中所述的无水盐的一或多者)组合，视情况将混合物混合并然后自所述混合物分离含有有机溶剂的相。去脂步骤可包含用非极性溶剂将有机溶剂提取物洗涤至少一次(例如，一次、两次或三次)。举例而言，可使用c5-c8烷烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷或正辛烷)。在一些实施例中，用于去脂的溶剂包含己烷。如本文中所用，「己烷」是指正己烷。作为对如上文所述的进行有机溶剂提取然后用非极性溶剂洗涤的备选方案，可通过使用己烷作为溶剂以自化妆产品提取化合物并然后使用极性有机溶剂(例如乙腈)使己烷提取物经受溶剂提取来获得去脂的有机溶剂提取物。
在一些实施例中，当有机溶剂是甲醇或dmso时，则不进行前两段中所述的步骤(即，在制程中不使用盐及/或糖，且不进行此段中所述的脱水及去脂步骤)。在一些实施例中，当有机溶剂是乙腈、丙酮、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、氯仿、己烷及其混合物时，则进行前两段中所述的一些或所有步骤。包括前两段中所述步骤的例示性提取方案阐述于下文的章节4.4中。
所回收的有机溶剂提取物(例如，根据先前段落中任一段所述的制程所制备)可经进一步处理，例如，浓缩提取物、自提取物去除一些或全部有机溶剂或将提取物稀释于适用于毒性试验的溶剂中。可通过(例如)在氮流下或使用旋转蒸发器部分干燥提取物浓缩有机溶剂提取物。可通过(例如)在氮流下或使用旋转蒸发器干燥提取物将有机溶剂提取物完全干燥来去除有机溶剂。在干燥后，可然后将有机溶剂提取物再溶解或悬浮于第二有机溶剂中。在一些实施例中，第二有机溶剂是适用于如章节4.5中所述的毒性试验的溶剂。例示性第二有机溶剂包括甲醇、二甲基亚砜及其混合物。
当提取中使用的有机溶剂适用于毒性试验时，则不必干燥提取物并将提取物再溶解或悬浮于另一溶剂中。相反，提取物可(例如)经浓缩并然后稀释于另一溶剂中、不经浓缩即稀释于另一溶剂中或不经浓缩或稀释即直接用于试验。在一些实施例中，提取物在用于毒性试验前既未经干燥亦未经浓缩。举例而言，使用甲醇作为有机溶剂制得的有机溶剂提取物可直接用于毒性试验或可在用于试验前经稀释，而在稀释前未经浓缩。在用于毒性试验前可用于稀释有机溶剂提取物的溶剂包括水及硬骨鱼培养基。
有机及无机溶剂提取物可类似于有机溶剂提取物来制备，唯使用有机及无机溶剂的组合而非有机溶剂来制备提取物。在一些实施例中，有机及无机溶剂是以3:7至7:3(例如，3:7至7:3、4:6至6:4或1:1)的比率使用。在一些实施例中，比率是4:6或6:4。在一些实施例中，有机溶剂是甲醇且无机溶剂是水。在一些实施例中，甲醇对水的比率是3:7、4:6、1:1、6:4或7:3。在一些实施例中，甲醇对水的比率是4:6。在其他实施例中，甲醇对水的比率是6:4。
有机及无机溶剂提取物通过包含以下的制程可获得：将化妆产品的样品、有机溶剂(例如，甲醇)及无机溶剂(例如，水)组合以形成混合物、混合所述混合物、自所述混合物分离含有有机溶剂及无机溶剂的相并回收提取物。有机溶剂与无机溶剂的总体积(即，总溶剂体积)可基于样品的量及/或性质(例如，样品的稠度)来选择或改变。总溶剂体积是(例如)约1.5倍至约10倍样品重量或体积(例如，约1.5倍至约8倍、约2倍至约5倍、约1.5倍至约3倍、约2倍至约4倍或约2倍至约4倍样品重量或体积)。在一些实施例中，总溶剂体积是样品重量的至少3倍。
混合可通过(例如)以下来进行：摇动混合物、涡旋混合物、音波处理混合物或其组合。在一些实施例中，混合包含涡旋并音波处理混合物。
自混合物分离含有有机溶剂及无机溶剂的相包含使混合物离心以自所述混合物分离含有有机溶剂及无机溶剂的相。或者，可在重力下分离各相，但与使用离心分离混合物相比，在重力下分离混合物需要更长时间完成。对于含有固体颗粒且不完全溶解或不溶于有机溶剂与无机溶剂混合物中的化妆品而言，可使用过滤自混合物分离含有有机溶剂及无机溶剂的相(例如，使用重力、离心或真空过滤)。
在分离后，有机或无机溶剂提取物可通过(例如)以下回收：通过吸管从其他相吸移含有有机及无机溶剂的相、倾析所分离的相，或使用分液漏斗分离各相(例如，当非使用离心作用分离各相时)。
所回收的有机及无机溶剂提取物可经进一步处理，例如浓缩提取物、自提取物去除一些或所有有机及无机溶剂，或将提取物稀释于适用于毒性试验的溶剂中。可通过(例如)在氮流下或使用旋转蒸发器部分干燥提取物，以浓缩有机及无机溶剂提取物。可通过(例如)在氮流下或使用旋转蒸发器干燥提取物，将有机及无机溶剂提取物完全干燥以去除有机及无机溶剂。干燥后，然后将有机及无机溶剂提取物再溶解或悬浮于第二有机溶剂中。在一些实施例中，第二有机溶剂是适用于如章节4.5中所述的毒性试验的溶剂。例示性第二有机溶剂包括甲醇、二甲基亚砜及其混合物。
当提取中所使用的有机及无机溶剂二者均适用于毒性试验时，则不必干燥提取物并将提取物再溶解或悬浮于另一溶剂中。相反，提取物可(例如)经浓缩并然后稀释于另一溶剂中、不经浓缩即稀释于另一溶剂中或不经浓缩或稀释即直接用于试验。在一些实施例中，提取物在用于毒性试验前既未经干燥亦未经浓缩。举例而言，使用甲醇作为有机溶剂及水作为无机溶剂制得的有机及无机溶剂提取物可直接用于毒性试验或可稀释后用于试验，而在稀释前不经浓缩。在用于毒性试验前可用于稀释有机及无机溶剂提取物的溶剂包括水及硬骨鱼细胞培养基。
4.4.例示性提取方案
以下方案是可用于自化妆产品(例如自非水可混溶的化妆产品)制备甲醇提取物的例示性方案。
1)将化妆产品的样品与一定量的甲醇组合以形成混合物；
2)视情况通过涡旋及音波处理所述混合物，使所述混合物混合；
3)使所述混合物离心；及
4)自所述混合物分离上清液，藉此获得甲醇提取物。
通过上文所述方案获得的甲醇提取物可直接用于毒性试验或可在无浓缩或溶剂去除步骤的情形下用溶剂(例如水或硬骨鱼培养基)稀释。
以下方案是用于自化妆产品(例如自非水可混溶的化妆产品)制备甲醇与水提取物的例示性方案。
1)将化妆品的样品与一定量的甲醇与一定量的水组合以形成混合物；
2)视情况通过涡旋并音波处理所述混合物使所述混合物混合；
3)使所述混合物离心；及
4)自所述混合物分离上清液，藉此获得甲醇与水的提取物。
通过上文所述方案获得的甲醇提取物可直接用于毒性试验或可在无浓缩或溶剂去除步骤的情形下用溶剂(例如水或硬骨鱼培养基)稀释。
以下方案是用于自化妆产品(例如自非水可混溶的化妆产品)制备乙腈提取物的例示性方案。
1)将化妆产品的样品与一定量的乙腈组合以形成混合物，并视情况混合所述混合物；
2)添加氯化钠至所述混合物直至饱和为止，并视情况混合所述混合物；
3)自所述混合物分离含有乙腈的相(例如，通过离心)，以获得乙腈提取物；
4)添加无水硫酸钠至所述乙腈提取物直至饱和为止，以形成第二混合物，并视情况混合所述第二混合物；
5)自所述第二混合物分离含有乙腈的相(例如，通过离心)，以获得脱水的乙腈提取物；
6)用己烷洗涤所述脱水的乙腈提取物，并视情况重复一次以获得脱水及去脂的乙腈提取物；及
7)自所述脱水及去脂的乙腈提取物去除乙腈并将所述脱水及去脂的乙腈提取物再溶解于甲醇中。
4.5.测试毒性效应
硬骨鱼胚胎是用以筛选/鉴别测试样品的生物效应(例如，毒性效应)的有效活体内模型系统，且使用鱼(例如，斑马鱼及青鳉鱼)胚胎鉴别的不良效应可预测对于人类的不良效应。根据欧洲法规，鱼胚胎未定义为受保护的动物而可用作动物备选(指令2010/63/eu；halder等人,2010,integratedenvironmentalassessmentmanagement.6:484-491)。
本揭示内容的筛选试验需要使硬骨鱼胚胎与化妆产品的样品或来自化妆产品的样品的提取物接触并确定所述提取物是否对胚胎产生毒性效应。举例而言，若化妆品是水可混溶的，则化妆产品的样品可不经提取即用于毒性试验中。在一些实施例中，水可混溶的化妆品是稀释于(例如)水或硬骨鱼培养基中，并然后用于筛选试验中(例如，稀释10至200倍)。对于非水可混溶的化妆品而言，较佳使用有机溶剂(例如，甲醇)或有机及无机溶剂(例如，甲醇及水)提取物。
可用于本揭示内容的筛选试验中的硬骨鱼胚胎可为各种淡水、微咸水或咸水(海水)鱼物种，包括(但不限于)以下属的鱼：青鳉属(oryzias)、斑马鱼属(danio)及胖头鱥属(pimephales)。青鳉属中的鱼属怪颌鳉科(adrianichthyidae)且包括(例如)黑点青鳉(oryziasmelastigma，别名恒河青鳉(oryziasdancena)(海洋或微咸水青鳉)、青鳉鱼(oryziaslatipes)(日本青鳉(japanesemedaka))、西里伯斯青鳉(oryziascelebensis)、花斑青鳉(oryziasmarmoratus)、印度尼西亚青鳉(oryziasmatanensis)、黑青鳉(oryziasnigrimas)(黑色直颌青鳉(blackbuntingi))、直颌青鳉(oryziasorthognathus，buntingi)及深青鳉(oryziasprofundicola)。斑马鱼属中的鱼属鲤科(cyprinidaefamily)且包括(例如)斑马丹尼鱼(daniorerio)(斑马鱼)、闪电斑马鱼(danioalbolineatus)、珍珠斑马鱼(danioabolineatus)、虹带斑马鱼(daniochoprae)、长须斑马鱼(daniodangila)、蓝带斑马鱼(danioerythromicron)、缅甸斑马鱼(daniofeegradei)、克氏斑马鱼(daniokerri)、网纹斑马鱼(daniokyathit)、银河斑马鱼(daniomargaritatus)、粗管小竹斑马鱼(daniomeghalayensis)、黑带斑马鱼(danionigrofasciatus)及玫瑰斑马鱼(danioroseus)。胖头鱥属中的鱼属鲤科且包括钝吻胖头鱥(pimephalesnotatus，钝吻鲤科小鱼(bluntnoseminnow))、肥头鲦鱼(pimephalespromelas，黑头呆鱼(fatheadminnow))、娇胖头鱥(pimephalestenellus，苗条鲤科小鱼(slimminnow))及凝胖头鱥(pimephalesvigilax，大头鲤科小鱼(bullheadminnow))。在特定实施例中，鱼胚胎是日本或微咸水青鳉鱼、斑马鱼或黑头呆鱼胚胎。微咸水青鳉鱼及斑马鱼的具体优点分别阐述于章节4.5.1及4.5.2中。
毒性效应可为急性毒性效应(如章节4.5.3中所述)或特定毒性效应(如章节4.5.4中所述)。
鱼胚胎可为转基因或非转基因的。非转基因鱼可用于(例如)检测化妆产品的样品或来自化妆产品的提取物中的急性毒性效应(例如，毒性)，如章节4.5.3中所述。转基因鱼胚胎在筛选特定效应时尤其有用，例如，用于检测化妆产品的样品或来自化妆产品的提取物中的雌激素化合物及抗雌激素化合物，如下文章节4.5.4.1中所述。
筛选试验可以高通量或半高通量方式进行，例如，在多孔板(例如，24、96或384孔板)中，及/或具有阳性及/或阴性对照(例如，仅作为阴性对照的介质及已知在特定试验中作为阳性对照产生毒性效应的试剂)。可以一式两份或一式三份测试试验中的每一样品或提取物。可使用每一样品或每一提取物的多个稀释物来进行试验。
4.5.1.青鳉鱼
微咸水青鳉鱼(黑点青鳉)原产于巴基斯坦、印度、缅甸及泰国的沿海水域及淡水(naruse,1996,fishbiol.l.medaka8:1-9)，并可在0千分率(ppt)至高达35ppt的范围内不同盐度的水中繁荣生长。另外，此微咸水青鳉鱼对于转基因研发具有许多优点，包括：(1)尺寸较小(成鱼2-3cm)；(2)世代时间相对较短(2-3个月)；(3)双型性别(例如，雌性的臀鳍具有平坦的远程表面，而雄性臀鳍的远程表面由于分开的较长鳍条而凸起)；(4)高多产的繁殖能力；(5)半透明的卵及仔鱼(直至受精后15天)，此有助于dna显微注射针的定位及内部器官的观察；及(6)可适应用于产生其他青鳉物种(例如，青鳉鱼)的转基因鱼的各种转基因技术。
鉴于微咸水青鳉鱼繁殖的高度多产能力，可全年诱导此鱼的产卵，且每一对雌性及雄性鱼在室内维持的条件下(例如，28±1℃及14小时-光/8小时-黑暗的恒定光循环，并饲以市售无激素片状食品及盐水虾(丰年虾(artemiasalina))每天可产20-30个卵多达若干个月。卵通常在28±1℃下11至15天内孵化。
黑点青鳉及青鳉鱼的两个青鳉物种具有较高的形态学、生理学及基因体相似性，且虽然青鳉鱼首先用于产生转基因鱼，但转基因技术易于适于微咸水青鳉黑点青鳉(chen等人，2008,ectoxicol.environ.saf71:200-208；chen等人，2009,comp.biochem.physiol.c.toxicol.pharmacol.149:647-655)。
可将青鳉培育至透明状的(例如，参见美国专利第6,737,559号)，此进一步有助于筛选试验、尤其涉及检测报导基因表现或活性程度的那些。
4.5.2.斑马鱼
研究已显示，斑马鱼是预测人类药物的毒性的良好模型。在斑马鱼与哺乳动物物种之间存在紧密的生理及遗传相似性，且研究者已使用大量药理学相关的化合物对斑马鱼毒性终点进行了系统性评估。
作为实验工具，斑马鱼具有一系列的优点，例如光学透明性、高繁殖力及快速外部发育。基因及蛋白质表现中形态学及调节的变化可藉助使用荧光蛋白容易地进行试验。相对较小的身体尺寸可以使多只斑马鱼装入多孔板中，此使得实验扩增时是个容易的过渡时期。此外，使得斑马鱼成为用于筛选试验的有吸引力的工具的其他原因有：与鱼饲养相关联的相对较便宜的成本，综合与斑马鱼可达成的后代的频率。
4.5.3.急性毒性效应
可量测本揭示内容的化妆产品的样品及化妆产品提取物的急性有毒效应，例如在整个生物体层面上的死亡及畸形。
以斑马鱼为例，斑马鱼胚胎毒性测试是基于静态或半静态系统中新近受精卵的48小时暴露。诸如卵与胚胎的凝固、未能发育体节、缺少心跳以及尾部与卵黄不分离的各种终点是毒性的指示。这些终点可在(例如)24、48、72及96小时之后记录，并用于计算化妆产品的样品或化妆产品提取物的lc50值。类似终点可在日本青鳉鱼及黑头呆鱼中量测(参见braunbeck及lammer，2006，backgroundpaperonfishembryotoxicityassays，可自www.oecd.org/chemicalsafety/testing/36817242.pdf获得)。
4.5.4.特定毒性效应
亦可针对特定效应(即，对特定组织、器官或激素系统的效应)对本揭示内容的化妆产品的样品及化妆产品提取物进行试验。尤其感兴趣的试验包括针对心脏毒性、耳毒性、癫痫易感性、内分泌干扰、胃肠道运动性、肝毒性、皮肤色素沉着改变、肌肉毒性、胰脏毒性、诱癌作用、神经毒性及肾脏毒性的那些(例如，参见sarvaiya等人，2014，veterinaryclinicalscience2(3):31-38,petersonandmacrae,2011,annu.rev.pharmacol.toxicol.52:433-53,eimonandrubenstein,2009,expertopin.drugmetab.toxicol.5(4):393-401，及其中引用的关于试验细节的参考文献)。
在某些态样中，可通过检测由于硬骨鱼胚胎暴露于化妆产品样品或化妆产品提取物所致的基因表现的改变来量测特定毒性效应。为便于观察基因表现的改变，可使用其中将感兴趣的调节序列(例如，诱导型启动子)可操作地连接至报导基因序列的转基因硬骨鱼胚胎。调节序列可来自正研究的鱼物种或不同的鱼物种，只要其在所试验的鱼物种中表现适当即可。可检测及/或量测在化妆产品样品或化妆产品提取物暴露后报导基因与(阴性及/或阳性)对照相比表现的改变。
适宜报导基因序列对于熟习此项技术者将显而易见。举例而言，适宜报导蛋白包括可通过组织化学方法检测的荧光蛋白及酶。报导基因序列可引入至含有适当外源性调节组件(例如，启动子及3’未转译区，例如如美国专利第9,043,995号中所述)的构筑体中的硬骨鱼基因体中，或可敲入至内源性遗传位点(例如使用kimura等人，2014,scientificreports4:6545,doi:10.1038中所述的方法)中。
荧光蛋白为此项技术所熟知。荧光蛋白的实例包括(但不限于)绿色荧光蛋白(gfp)、增强的绿色荧光蛋白(egfp)、红色荧光蛋白(cfp及红色fp，rfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、黄色荧光蛋白(yfp)及这些蛋白质的荧光变体。异源荧光基因(术语基因在此上下文中是指任何编码序列，具有或不具有控制序列)可是(例如)编码dsred2、zsgreen1及zsyellow1的基因。异源荧光基因可编码任何天然或变体标记蛋白，包括绿色荧光蛋白(gfp)、增强的绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强的黄色荧光蛋白(eyfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强的蓝色荧光蛋白(ebfp)、青色荧光蛋白(cfp)及增强的青色荧光蛋白(ecfp)。
可通过组织化学方法检测的酶亦为此项技术所熟知。酶的实例包括(但不限于)荧光素酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰基转移酶及乙醇去氢酶。根据特定实施例，酶是荧光素酶。术语「荧光素酶」意欲表示在称为荧光素的受质存在下催化或起始生物发光反应的所有蛋白质。荧光素酶可来自产生生物发光的任何生物体或系统(例如，参见美国专利第6,152,358号)。举例而言，荧光素酶可来自海紫罗兰科(renilla)(美国专利第5,418,155号及第5,292,658号)、来自东部萤火虫(photinuspyralis)或来自源氏萤火虫(luciolacruciata)(美国专利第4,968,613号)。
直接(例如，通过量测报导基因mrna的量)或间接(例如，通过量测报导蛋白的量及/或活性)检测蛋白质报导基因的技术是习用的。许多这些方法及分析技术可在诸如以下的参考文献中找到：currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubel等人编辑(greenepublishingassociates,inc.与johnwiley&sons,inc.的合资企业)，enzymeimmunoassay，maggio编辑(crcpress,bocaraton,1980)；laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology，t.s.work及e.work编辑(elseviersciencepublishersb.v.,amsterdam,1985)；principlesandpracticeofimmunoassays，price及newman编辑(stocktonpress,ny,1991)；及诸如此类。
在特定实施例中，量测报导基因表现产物(例如，蛋白质)的量及/或活性。荧光标记物(例如egfp)可通过检测其在细胞(例如，在微咸水青鳉鱼或斑马鱼胚胎中)中的荧光进行检测。举例而言，可在荧光显微镜下观察荧光，且若期望，可进行定量。可直接检测而不需要添加外源因子的报导基因(例如egfp)对于检测或评价鱼胚胎发育期间的基因表现是较佳的。经工程化在感兴趣的启动子控制下表现荧光报导基因的转基因鱼胚胎可提供用于分析空间及时间表现模式的快速实时活体内系统。
4.5.4.1.内分泌干扰物试验
内分泌干扰物是在某些剂量下可干扰哺乳动物中内分泌(或激素)系统的化学品。这些干扰会造成癌性肿瘤、出生缺陷及其他发育病症。特定而言，内分泌干扰物与以下的发生相关：学习障碍、严重注意力缺失症、认知及脑发育问题；身体的变形；乳癌、前列腺癌、甲状腺及其他癌症(参见gore等人，2015,endocrinereviews36(6):593-602.doi:10.1210/er.2015-1093)。内分泌干扰物的一个熟知的实例是双酚a，一种常见于塑料瓶、塑料食品容器、牙科材料及金属的食品与婴儿配方罐的衬里中的化学品。双酚a与糖尿病、乳癌及前列腺癌、精子数减少、生殖问题、早期青春期、肥胖症及神经学问题的升高率相关。
内分泌干扰物可在具有标记蛋白的编码序列的转基因硬骨鱼胚胎中进行评估，所述标记蛋白可操作地连接至对多种内分泌系统的干扰物敏感的启动子。由于在不同内分泌系统中运行的若干种激素共享共同亚单位，故使用来自共同亚单位中的一者的启动子容许同时研究多个激素系统。此一亚单位的一个实例是醣蛋白亚单位α(gsuα)，其编码激滤泡素β、黄体促素β及促甲状腺激素(tsh)β的共享α亚单位。斑马鱼的gsuα启动子是可操作地连接至标记蛋白的编码序列并用于检测内分泌干扰化学品的启动子的实例(cheng等人，2014,toxicologyandappliedpharmacology278:78-84)，且可用于筛选如本文中所述的化妆产品中内分泌干扰化学品的存在。
许多内分泌干扰物具有雌激素、增强雌激素或抗雌激素的性质。为评估本揭示内容的化妆产品样品及化妆产品提取物的雌激素、增强雌激素及抗雌激素性质，化妆产品样品或化妆产品提取物可在具有可操作地连接至标记蛋白的编码序列的雌激素反应启动子的硬骨鱼胚胎中进行试验。在一些实施例中，雌激素反应启动子是来自青鳉鱼(例如，黑点青鳉及青鳉鱼)的绒毛膜促性激素基因，例如绒毛膜促性激素h或绒毛膜促性激素l。绒毛膜促性激素h及l是硬骨鱼的卵包膜(绒毛膜)的内层亚单位的前体蛋白质，且绒毛膜促性激素h及绒毛膜促性激素l二者的基因表现对雌激素物质有反应(例如，参见yamaguchi等人，2015,jappltoxicol.35(7):752-8).在一些实施例中，绒毛膜促性激素h启动子用来试验化妆产品样品或化妆产品提取物的雌激素干扰物活性。已显示，绒毛膜促性激素h启动子对于监测海洋环境中的雌激素化学品是高度敏感的生物标记(chen等人，2008,ecotoxicolenvironsaf.71(1):200-8).适用于试验化妆产品样品及化妆产品提取物的雌激素活性的绒毛膜促性激素h启动子构筑体的实例揭示于美国专利第9,043,995号中。在其他实施例中，使用绒毛膜促性激素l启动子。在其他实施例中，雌激素反应启动子是脑芳香酶b启动子(在斑马鱼中称为cyp19a1b启动子)。斑马鱼cyp19a1b基因展现对雌激素的强烈敏感性，且是雌激素模拟物的敏感性靶标，并已成功地可操作地连接至转基因鱼中的标记基因(例如gfp)(例如，参见brion等人，2012,plosone7(5):e36069.doi:10.1371/journal.pone.0036069)。在另一实施例中，雌激素敏感性启动子是卵黄蛋白原启动子(例如如schreurs等人，2004,environmen.sci.technol.34:4439-44中所述)。
其他内分泌干扰物具有雄激素、增强雄激素或抗雄激素性质。化妆产品样品及化妆产品提取物的雄激素、增强雄激素及抗雄激素性质可在具有可操作地连接至标记蛋白的编码序列的雄激素反应启动子的硬骨鱼胚胎中进行评估。在一些实施例中，雄激素反应性启动子是三刺鱼(g.aculeatus)spiggin启动子，其对雄激素有反应但对尤其雌激素及糖皮质激素不展现活性(例如，参见sebillot等人，2014,environ.sci.technol.48:10919-28)。
然而其他内分泌干扰物具有甲状腺干扰性质，例如，其干扰下丘脑-垂体-甲状腺(hpt)轴。化妆产品样品及化妆产品提取物的甲状腺/hpt干扰性质可在具有可操作地连接至标记蛋白的编码序列的甲状腺激素(th)反应启动子的硬骨鱼胚胎中进行评估。在一些实施例中，甲状腺反应启动子是促甲状腺激素亚单位β(tshβ)启动子，与其他亚单位相比，其对于tsh是唯一的。促甲状腺激素是涉及th及促甲状腺激素释放激素(trh)的反馈回路的一部分。特定而言，当存在低含量的th时，下丘脑分泌trh以刺激垂体释放tsh，此进而刺激甲状腺分泌th，且相反的反馈回路在存在高含量的th时发生。tshβ启动子对于hpt轴是可用的生物标记物。可使用的tshβ启动子的实例是斑马鱼tshβ启动子(例如，参见ji等人，2012,toxicologyandappliedpharmacology262:149-155)。
4.5.4.2.异型生物质试验
异型生物质是存在于生物体内的外来化学物质。异型生物质可分组为抗氧化剂、致癌物、药物、环境污染物、食品添加剂、烃及农药。污染物(例如戴奥辛及多氯联苯)被视为异型生物质。身体会通过异型生物质代谢作用将异型生物质去除。此是由去活化及排泄异型生物质组成，且是藉助通过肝微粒体细胞色素p450酶系统所催化的反应主要发生在肝脏中。
为评估本揭示内容的化妆产品样品及化妆产品提取物的异型生物质性质，化妆产品样品及化妆产品提取物可在具有可操作地连接至标记蛋白的编码序列的异型生物质反应启动子的硬骨鱼胚胎中进行试验。在一些实施例中，启动子是细胞色素p450启动子，例如，斑马鱼p4501a(cyp1a)启动子(例如boon及gong，2013,plosone8(5):e64334中所阐述)。
本揭示内容的化妆品样品及化妆品提取物的异型生物质性质亦可利用使用7-乙氧基试卤灵(7-ethoxyresorufin)作为受质的活体内乙氧基试卤灵-o-脱乙基酶(erod)活性试验进行评估，例如如liu等人，2014,environmentaltoxicology31(2):201-10中所阐述。
4.5.4.3.肝毒性试验
斑马鱼一直作为药物诱导的肝毒性模型进行研究。斑马鱼在受精后的若干天的透明度使得能够对包括肝脏的内部器官进行活体内视觉观察。斑马鱼在48小时受精后(hpf)完成原发性肝脏形态发生。当暴露于肝毒物时，可目视评估肝脏形态学的变化(hill等人，2012,drugmetabolismreviews44(1):127-140)。研究者已开发出可研究用以评估肝毒性的各种终点：肝脏变性、肝脏大小及形状的变化及卵黄囊滞留(参见he等人，2013,journalofpharmacologicalandtoxicologicalmethods67:25-32)。这些参数可在斑马鱼中进行试验以评估本揭示内容的化妆产品样品或化妆产品提取物的肝毒性，且类似参数可用于对化妆产品样品或化妆产品提取物在不同鱼(例如青鳉)中的肝毒性进行试验。
4.5.4.4.心脏毒性试验
硬骨鱼胚胎提供研究心脏毒性的理想模型系统，此乃因其透明度及无覆盖的心脏使得其可容易地观察。以斑马鱼为例，心脏是由心室及心房组成，且这些发育迅速。在受精后24小时(hpf)观察心管及心跳，且然后在72hpf前完成管循环、腔室形成及血液循环。
可通过评估诸如以下的参数试验化妆产品样品及化妆产品提取物的心脏毒性：硬骨鱼胚胎的心率、节律性(例如，房室传导阻断(av阻断)、心律不整)；循环及形态学(例如，心包水肿；出血、心室肿胀)。
心脏特异性启动子bmp4可用于驱动容许观察心脏形态的标记基因的表现。红血球特异性启动子gata1可用于驱动标记基因的表现，此容许观察血液循环速率(参见wu等人，2013,toxicol.sci.136(2):402-412，及其中引用的参考文献)。
这些参数可在斑马鱼或青鳉中进行试验以评估本揭示内容的化妆产品样品或化妆产品提取物的心脏毒性。
5.实例
5.1.实例1：bb霜提取物制备
提取由品牌a、b及c制造的三种spf50的bb霜并测试急性毒性及雌激素活性。将bb霜以3倍体积的甲醇萃取。每一样品经涡旋、超音波及离心。收集上清液并保存于-20℃直到进行测试。
5.2.实例2：bb霜提取物的急性毒性测试
使用斑马鱼(斑马丹尼鱼)ab品系胚胎测试如实例1中所述制备的提取物的急性毒性。将bb霜提取物稀释至斑马鱼胚胎培养基(含有294.0mg/l的脱水氯化钙、123.3mg/l的七水合硫酸镁、63.0mg/l碳酸氢钠及5.5mg/l的氯化钾的去离子水)中，浓度为0.85μl/ml、1.88μl/ml、4.13μl/ml、9.09μl/ml及20.00μl/ml。将4-128个细胞阶段的斑马鱼ab品系胚胎以1个胚胎/孔暴露于96孔板中的提取物稀释物。每一浓度用20个胚胎测试。包括斑马鱼胚胎培养基及3.7mg/l二氯苯胺分别作为阴性及阳性对照。在26℃下暴露48小时后，在立体显微镜下观察斑马鱼胚胎并将凝固、尾部未分离且不具有心跳的鱼胚胎标记为死亡的。计算每一浓度的死亡率作为急性毒性终点。阴性对照的死亡率为5％，且阳性对照的死亡率为60％。表1显示急性毒性测试结果。在三种bb霜提取物中，对于斑马鱼胚胎，品牌c毒性最高且品牌b毒性最低。
5.3.实例3：bb霜提取物的雌激素活性
使用如美国专利第9,043,995号的实例1中所述产生的绒毛膜促性激素h-egfp转基因青鳉(黑点青鳉)游走期胚胎测试如实例1中所述制备的提取物的雌激素活性。将bb霜提取物稀释至青鳉(黑点青鳉)胚胎培养基(速溶海洋盐溶解于去离子水中，使盐度为0.2％)中，浓度为1.0μl/ml。17β-雌二醇亦以1.0μg/l、2.0μg/l、5.0μg/l及10.0μg/l作为阳性对照进行测试。培养基作为阴性对照进行测试。每一浓度含有3个重复，其中每一重复含有8个游走期胚胎。在26℃下暴露24小时后，在绿色荧光显微镜下观察游走期胚胎并使用相同成像设置自腹侧成像。阴性对照及来自品牌b的样品的提取物在游走期胚胎肝脏中未诱导出可观察的绿色荧光。来自品牌a及品牌c的样品的提取物在游走期胚胎肝脏中诱导出可观察的绿色荧光。
5.4.实例4：防晒霜试验
提取品牌a、b及c的spf50的防晒霜并测试急性毒性及雌激素活性。将防晒霜与甲醇混合(w/v＝1:3)。经涡旋及超音波后，将样品离心从而分相。将上清液分离并保存于-20℃直到进行测试。
所述防晒霜样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述防晒霜中是否存在毒物是可被鉴别的。下表2及表3显示这些防晒霜的急性毒性及雌激素活性数据。
5.5.实例5：纸面膜试验
挤压品牌a、b及c的纸面膜以得到用于急性毒性及雌激素活性测试的溶液；或将其与甲醇混合(w/v＝1:3)，经涡旋、超音波及离心后得到用于测试的上清液。
所述纸面膜样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示这些纸面膜中是否存在毒物是可被鉴别的。下表4及表5显示这些纸面膜的急性毒性及雌激素活性数据。
5.6.实例6：婴儿霜试验
提取品牌a、b及c的婴儿霜并测试急性毒性及雌激素活性。将婴儿霜与甲醇混合(w/v＝1:3)。经涡旋及超音波后，将样品离心从而分相。将上清液分离并保存于-20℃直到进行测试。
所述婴儿霜样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示这些婴儿霜中是否存在毒物是可被鉴别的。下表6及表7显示这些婴儿霜的急性毒性及雌激素活性数据。
5.7.实例7：婴儿油试验
提取品牌a、b及c的婴儿油并测试急性毒性及雌激素活性。将婴儿油与甲醇混合(w/v＝1:3)。经涡旋及超音波后，将样品离心从而分相。将上清液分离并保存于-20℃直到进行测试。
所述婴儿油样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示这些婴儿油中是否存在毒物是可被鉴别的。下表8及表9显示这些婴儿油的急性毒性及雌激素活性数据。
5.8.实例8：止汗剂试验
通过与甲醇混合(w/v＝1:3)，并经涡旋、超音波及离心提取品牌a、b及c的止汗剂，从而取得用于测试的上清液；或样品于稀释至鱼培养基进行测试前不进行前处理。
所述止汗剂样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示这些止汗剂中是否存在毒物是可被鉴别的。下表10及表11显示这些止汗剂的急性毒性及雌激素活性数据。
5.9.实例9：口红试验
萃取品牌a、b及c的口红从而进行急性毒性及雌激素活性测试。将口红与甲醇混合(w/v＝1:3)。经涡旋及超音波后，将样品离心从而分相。将上清液分离并保存于-20℃直到进行测试。
所述口红样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述口红中是否存在毒物是可被鉴别的。下表12及表13显示这些口红的急性毒性及雌激素活性数据。
5.10.实例10：婴儿软膏试验
萃取品牌a、b及c的婴儿软膏从而进行急性毒性及雌激素活性测试。将软膏与甲醇混合(w/v＝1:3)。经涡旋及超音波后，将样品离心从而分相。将上清液分离并保存于-20℃直到进行测试。
所述软膏样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述软膏中是否存在毒物是可被鉴别的。下表14及表15显示这些软膏的急性毒性及雌激素活性数据。
5.11.实例11：凝露试验
通过与甲醇混合(w/v＝1:3)，并经涡旋及超音波来提取品牌a、b及c的凝露，并经离心取得用于测试的上清液；或样品于稀释至鱼培养基进行测试前不进行前处理。
所述凝露样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述凝露中是否存在毒物是可被鉴别的。下表16及表17显示这些凝露的急性毒性及雌激素活性数据。
5.12.实例12：卸妆剂试验
通过与甲醇混合(w/v＝1:3)，并经涡旋、超音波及离心来提取品牌a(液体类)、b(油类)及c(粉类)的卸妆剂，从而取得用于测试的上清液。
所述卸妆剂样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述卸妆剂中是否存在毒物是可被鉴别的。下表18及表19显示这些卸妆剂的急性毒性及雌激素活性数据。
5.13.实例13：精油试验
通过与甲醇混合(w/v＝1:3)，并经涡旋、超音波及离心来提取品牌a、b及c的精油，从而取得用于测试的上清液。
所述精油样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述精油中是否存在毒物是可被鉴别的。下表20及表21显示这些精油的急性毒性及雌激素活性数据。
5.14.实例14：精华液试验
通过与甲醇混合(w/v＝1:3)，并经涡旋、超音波及离心来提取品牌a、b及c的精华液，从而取得用于测试的上清液。
所述精华液样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述精华液中是否存在毒物是可被鉴别的。下表22及表23显示这些精华液的急性毒性及雌激素活性数据。
5.15.实例15：香水试验
通过与甲醇混合(w/v＝1:3)，并经涡旋、超音波及离心来提取品牌a、b及c的香水，从而取得用于测试的上清液。
所述香水样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述香水中是否存在毒物是可被鉴别的。下表24及表25显示这些香水的急性毒性及雌激素活性数据。
5.16.实例16：洗发精试验
萃取品牌a、b及c的洗发精从而进行急性毒性及雌激素活性测试。将洗发精与甲醇混合(w/v＝1:3)。经涡旋及超音波后，将样品离心从而分相。将上清液分离并保存于-20℃直到进行测试。
所述洗发精样品的急性毒性及雌激素活性的测试是依照描述于前述5.2节(实例2)及5.3节(实例3)中的方法来进行的。结果显示所述洗发精中是否存在毒物是可被鉴别的。下表26及表27显示这些洗发精的急性毒性及雌激素活性数据。
6.特定实施例
本揭示内容通过以下特定实施例例示。
1.一种测定化妆产品中整体毒物的方法，其包含：
(a)将溶剂与化妆品产品结合以得到具整体毒性的溶剂提取物；
(b)将硬骨鱼胚胎与a)的溶剂提取物接触；及
(c)测定所述提取物是否对所述胚胎具毒性作用；
其中对所述胚胎具毒性作用显示化妆产品的整体毒性。
2.如实施例1的方法，其中所述化妆产品是面膜、香水、止汗剂、除臭剂、牙膏、洗发精、精油、卸妆剂、清洁产品、染发剂、粉底、遮瑕膏、防晒剂、保湿剂、抗皱霜、眼影膏、眼线膏、睫毛膏、腮红、唇膏、唇彩、指甲油、精华液、眼霜、晚霜、日霜、bb霜、夜用凝露、日用凝露、护手霜、颈霜或抗老化霜。
3.如实施例1或实施例2的方法，其中所述化妆产品是水可混溶的化妆产品。
4.如实施例1或实施例2的方法，其中所述化妆产品是水不可混溶性化妆产品。
5.如实施例1至4中任一实施例的方法，其中步骤(a)包含使所述胚胎与来自所述化妆产品的样品的提取物接触。
6.如实施例5方法，其中所述提取物是有机溶剂提取物，视情况其中所述有机溶剂包含甲醇、二甲基亚砜(dmso)、乙腈、丙酮、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、氯仿、己烷或其混合物。
7.如实施例6的方法，其中所述有机溶剂能够溶解极性及非极性有机化合物，视情况其中所述有机溶剂包含甲醇、dmso或其组合。
8.如实施例7的方法，其中所述有机溶剂是甲醇。
9.如实施例5至8中任一实施例的方法，其中所述提取物通过包含以下的制程可获得：将所述化妆产品的样品与所述有机溶剂组合以形成混合物，混合所述混合物，自所述混合物分离含有所述有机溶剂的相并回收所述提取物，且其中所述制程视情况进一步包含：
(a)将所述混合物与第一盐及/或糖组合至所述混合物，然后自所述混合物分离含有所述有机溶剂的相，视情况其中所述盐包含氯化钠、硫酸镁、氯化钙、氯化镁、乙酸钠、乙酸铵、无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水氯化钙、无水硫酸钙或其组合，且视情况其中所述糖包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、麦芽糖、蔗糖或其组合；
(b)使所述含有所述有机溶剂的相与第二盐组合以形成第二混合物，视情况混合所述第二混合物，并自所述第二混合物分离含有所述有机溶剂的相，视情况其中所述第二盐是选自无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水氯化钙、无水硫酸钙或其组合；
(c)用非极性溶剂、视情况己烷将所述有机溶剂提取物洗涤至少一次、视情况两次；
(d)(a)至(c)的任何组合；或
(e)无(a)至(c)，例如，当有机溶剂包含甲醇及/或dmso时。
10.如实施例9的方法，其中分离含有所述有机溶剂的相包含使所述混合物离心。
11.如实施例10的方法，其中所述提取物是上清液或其浓缩形式。
12.如实施例9至12中任一实施例的方法，其中所述混合包含涡旋及/或音波处理所述混合物。
13.如实施例5的方法，其中所述提取物是有机及无机溶剂提取物，视情况其中所述有机溶剂包含甲醇、dmso或其组合。
14.如实施例13的方法，其中所述有机溶剂能够溶解极性及非极性有机化合物，视情况其中所述有机溶剂包含甲醇、dmso或其组合。
15.如实施例14的方法，其中所述有机溶剂是甲醇。
16.如实施例13至15中任一实施例的方法，其中所述无机溶剂是水。
17.如实施例13至16中任一实施例的方法，其中提取物通过包含以下的制程可获得：将所述化妆产品的样品与这些有机及无机溶剂组合以形成混合物、混合所述混合物、自所述混合物分离含有所述有机溶剂的相并回收所述提取物。
18.如实施例17的方法，其中分离含有所述有机溶剂的相包含使所述混合物离心。
19.如实施例18的方法，其中所述提取物是上清液或其浓缩形式。
20.如实施例17至19中任一实施例的方法，其中所述混合包含涡旋及/或音波处理所述混合物。
21.如实施例17至20中任一实施例的方法，其中所述有机及无机溶剂是以3:7至7:3的比率使用，视情况其中所述比率是4:6或6:4。
22.如实施例5至21中任一实施例的方法，其在步骤(a)前进一步包含自所述化妆产品的所述样品制备所述提取物。
23.如实施例22的方法，其中所述提取物是通过包含如实施例9至22中任一实施例中所述的这些步骤的制程制备。
24.如实施例23的方法，其中所述提取物是通过产生如实施例6至23中任一实施例所鉴别的提取物的类型的制程制备，例如就实施例6而言，所述制程包含用有机溶剂制备所述提取物，且就实施例7而言，所述制程包含用能够溶解极性及非极性有机化合物的溶剂制备所述提取物等等。
25.如实施例24的方法，其中所述方法包含如实施例9至21中任一实施例所例示的这些步骤。
26.如实施例1至4中任一实施例的方法，其中所述化妆品是水可混溶的液体化妆产品且其中步骤(a)包含使硬骨鱼胚胎与所述化妆产品的样品接触。
27.如实施例1至26中任一实施例的方法，其中所述硬骨鱼胚胎是游走期胚胎。
28.如实施例1至27中任一实施例的方法，其中所述硬骨鱼胚胎是青鳉胚胎、斑马鱼胚胎或黑头呆鱼胚胎。
29.如实施例28的方法，其中所述硬骨鱼胚胎是转基因青鳉胚胎或转基因斑马鱼胚胎。
30.如实施例1至29中任一实施例的方法，其中所述毒性效应包含急性效应。
31.如实施例30的方法，其中所述急性效应包含死亡、畸形或其组合。
32.如实施例1至29中任一实施例的方法，其中所述毒性效应包含特定效应。
33.如实施例32的方法，其中所述特定效应是内分泌活性干扰。
34.如实施例33的方法，其中所述内分泌活性干扰是雌激素活性干扰、雄激素活性干扰或甲状腺活性干扰。
35.如实施例33或实施例34的方法，其中所述硬骨鱼胚胎是转基因硬骨鱼胚胎，其包含可操作地连接至标记基因的醣蛋白亚单位α(gsuα)启动子，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测所述标记基因的表现的变化。
36.如实施例34的方法，其中所述内分泌活性干扰是雌激素活性干扰且其中所述硬骨鱼胚胎是转基因硬骨鱼胚胎，其包含可操作地连接至标记基因的雌激素敏感性启动子，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测所述标记基因的表现的变化。
37.如实施例36的方法，其中所述雌激素敏感性启动子是芳香酶b启动子，且视情况其中所述硬骨鱼胚胎是斑马鱼胚胎或青鳉胚胎。
38.如实施例36的方法，其中所述雌激素敏感性启动子是绒毛膜促性激素启动子，所述绒毛膜促性激素启动子视情况为绒毛膜促性激素h启动子或绒毛膜促性激素l启动子，且视情况其中所述硬骨鱼胚胎是斑马鱼胚胎或青鳉胚胎。
39.如实施例36的方法，其中所述雌激素敏感性启动子是卵黄蛋白原启动子，且视情况其中所述硬骨鱼胚胎是斑马鱼胚胎或青鳉胚胎。
40.如实施例34的方法，其中所述内分泌活性干扰是雄激素活性干扰，其中所述硬骨鱼胚胎是转基因硬骨鱼胚胎，其包含可操作地连接至标记基因的雄激素敏感性启动子，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测所述标记基因的表现的变化。
41.如实施例40的方法，其中所述雄激素敏感性启动子是spiggin启动子，且其中所述硬骨鱼胚胎视情况为青鳉胚胎或斑马鱼胚胎。
42.如实施例34的方法，其中所述内分泌活性干扰是甲状腺活性干扰，其中所述硬骨鱼胚胎是转基因硬骨鱼胚胎，其包含可操作地连接至标记基因的甲状腺激素(th)敏感性启动子，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测所述标记基因的表现的变化。
43.如实施例42的方法，其中所述th敏感性启动子是促甲状腺激素亚单位β(tshβ)启动子，且其中所述硬骨鱼胚胎视情况为青鳉胚胎或斑马鱼胚胎。
44.如实施例32的方法，其中所述特定效应是异型生物质效应，其中所述硬骨鱼胚胎是转基因硬骨鱼胚胎，其包含可操作地连接至标记基因的异型生物质敏感性启动子，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测所述标记基因的表现的变化。
45.如实施例44的方法，其中所述异型生物质敏感性启动子是p4501a启动子，且其中所述硬骨鱼胚胎视情况为青鳉胚胎或斑马鱼胚胎。
46.如实施例32的方法，其中所述特定效应是异型生物质效应，且其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测乙氧基试卤灵-o-脱乙基酶(erod)活性的变化。
47.如实施例32的方法，其中所述特定效应是心脏毒性效应，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测心脏发育及/或血液循环速率的改变。
48.如实施例47的方法，其中所述胚胎具有可操作地连接至标记基因的bmp4启动子，且其中检测或量测心脏发育的改变包含监测标记基因表现。
49.如实施例47的方法，其中所述胚胎具有可操作地连接至标记基因的gata1启动子，且其中检测或量测血液循环速率的改变包含监测标记基因表现。
50.如实施例32的方法，其中所述特定效应是肝毒性效应，且视情况其中确定所述样品或所述提取物是否对所述胚胎产生毒性效应包含检测或量测肝脏发育的变化。
51.如实施例35至45、48及49中任一实施例的方法，其中所述启动子对于所述硬骨鱼胚胎是天然的。
52.如实施例35至45、48及49中任一实施例的方法，其中所述启动子对于所述硬骨鱼胚胎并非天然的。
53.如实施例52的方法，其中所述硬骨鱼胚胎是斑马鱼胚胎且所述启动子对于青鳉鱼是天然的。
54.如实施例53的方法，其中所述启动子对于黑点青鳉或青鳉鱼是天然的。
55.如实施例52的方法，其中所述硬骨鱼胚胎是青鳉胚胎，且所述启动子对于斑马鱼是天然的。
56.如实施例55的方法，其中所述青鳉胚胎是黑点青鳉胚胎或青鳉鱼胚胎。
57.如实施例36至45、48、49或51至56中任一实施例的方法，其中所述标记基因编码荧光蛋白。
58.如实施例57的方法，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)、青色荧光蛋白(cfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(dsrfp)、荧光素酶(luc)、氯霉素乙酰基转移酶(cat)、13-半乳糖苷酶(lacz)或β-葡萄糖醛酸苷酶(gus)。
59.如实施例36至45、48、49或51至56中任一实施例的方法，其中标记基因编码在比色试验中可检测的酶。
60.如实施例59的方法，其中所述酶是荧光素酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰基转移酶或乙醇去氢酶。
61.如实施例1至60中任一实施例的方法，其是在多孔板、视情况24孔板、96孔板或384孔板中进行。
62.如实施例1至61中任一实施例的方法，其中试验一个以上的化妆产品样品。
63.如实施例62的方法，其中每一样品是以一式两份或一式三份进行试验。
64.如实施例1至63中任一实施例的方法，其包含试验化妆产品样品或提取物的多个稀释物。
尽管已说明并阐述各个特定实施例，但应了解，可在不背离本揭示内容的精神及范围下做出各种改变。
7.参考文献引用
本申请案中所引用的所有出版物、专利、专利申请案及其他文件均出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，其并入程度如同出于所有目的将每一个别出版物、专利、专利申请案或其他文件个别地指明以引用的方式并入一般。在本文中所并入的参考文献的一或多者的教示与本揭示内容之间存在不一致的情形下，意欲指本说明书的教示。