本发明涉及一种木犀草素的体外抗炎的方法，具体地说是以一种木犀草素的体外抗炎的方法。
背景技术：
目前公知的木犀草素(luteolin)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物中，研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放和核因子κb（nfκb）介导的基因表达有关。
技术实现要素：
材料与方法；药品及试剂木犀草素（纯度＞98%）和前列腺素e2酶免疫分析试剂盒（pge2eiakit）均为美国cayman公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二甲基亚砜（dmso）、焦碳酸乙二酯（depc）等为sigma公司产品；rpmi1640为gibco公司产品；超级小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；总rna提取试剂（trizol）为invitrogen公司产品；逆转录聚合酶链反应（rtpcr）一步法试剂盒为宝生物（大连）工程有限公司产品；100bpdnamarker、n,n,n,n四甲基乙二胺（temed）、6倍上样缓冲液均为华美生物工程公司产品；增强化学发光（ecl）试剂、抑酞酶（aprotinin）均购于上海华舜生物工程有限公司；βactin山羊igg多克隆抗体、nfκb小鼠igg单克隆抗体和cox2山羊igg多克隆抗体均为北京中山公司产品；聚偏(二)氟乙烯（pvdf）膜为美国pallgelman公司产品；nfκb寡核苷酸链为上海生物工程公司产品；γ32p标记三磷酸腺苷（［γ32p］atp）为北京亚辉生物工程公司产品；t4噬菌体多核苷酸激酶为promega公司产品。
方法；细胞培养raw2647细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)购自上海细胞研究所，在37℃、体积分数为5%co2条件下，用含体积分数为10%小牛血清、青霉素(1×105u/l)及链霉素(100mg/l)的rpmi1640培养液传代培养。2pge2含量测定将对数生长期的raw2647细胞接种于6孔培养板中，设空白对照组，脂多糖（lps）处理组（模型组），5、15、45μmol/l木犀草素处理组（中药低、中、高剂量组）；药物加入30min后再加入终浓度为1μg/ml的lps，继续培养12h；收集细胞培养液，以pge2eiakit测定其中的pge2浓度，每组重复3次。电泳迁移率变动分析(emsa)细胞培养及分组同。细胞核蛋白的提取：细胞以冷磷酸盐缓冲液（pbs）洗涤2次后加入100μl缓冲液a［10mmol/ln2羟基哌嗪n2乙磺酸（hepes）-koh、15mmol/lmgcl2、10mmol/lkcl、1mmol/l苯甲基磺酰氟（pmsf）、10mg/lleupeptin、35mg/l抑酞酶（aprotinin）、1mmol/l二硫苏糖醇（dtt）］，冰上放置15min，再加体积分数为10%壬基酚聚氧乙烯醚（np40）10μl，振荡混匀；然后10000g、4℃、离心10min；于沉淀中加100μl缓冲液b［20mmol/lhepeskoh、27mol/l甘油（glycerol）、420mmol/lnacl、15mmol/lmgcl2、1mmol/lpmsf、1mg/lleupeptin、10mg/laprotinin、1mmol/ldtt］，冰浴30min，离心取上清液，考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度后，－70℃保存。取10μg核蛋白与放射性核素标记的dna探针在室温进行结合反应30min，总体积为10μl。dna蛋白复合物经40g/l的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压110v，电泳60min。真空负压加热干燥凝胶后，－70℃放射自显影，显影后扫描至计算机。用bandscan43图像分析软件进行光密度积分值分析。每个图像均重复分析3次，取平均值。rtpcr测raw2647细胞中cox2mrna的表达raw2647细胞分组及处理同。收集细胞，用trizol试剂提取细胞的总rna，按一步法试剂盒步骤进行rtpcr。cox2引物为：cox2的反应条件为：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸10min。pcr产物以15g/l琼脂糖凝胶电泳，docgel1000成像系统观察结果并拍照。同时进行光密度积分值分析，以cox2pcr产物与内参照βactinpcr产物的光密度积分值之比作为cox2mrna的相对含量值。westernblot测raw2647细胞中cox2和nfκb蛋白的表达细胞处理同，细胞裂解液裂解细胞后提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。每组各取50μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行100g/l十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)；电转移至pvdf膜；用含50g/l脱脂奶粉的tris缓冲盐溶液(tbs，ph80)封闭2h；分别加入适量cox2、nfκb和βactin多克隆抗体，摇床上室温反应2h；洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2h；洗膜后作ecl化学发光，x片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件bandscan43进行光密度积分值分析，以目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。处理采用spss110统计软件进行。
结果：木犀草素能显著性抑制lps诱导的raw2647细胞pge2的生成，降低nfκb的dna结合活性；下调lps诱导的raw2647细胞cox2mrna、nfκb和cox2蛋白的表达。
发明目的：木犀草素(luteolin)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物中，研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放和核因子κb（nfκb）介导的基因表达有关。本文观察了木犀草素对脂多糖(lps)诱导的raw2647细胞nfκb表达、dna结合活性以及对环氧合酶2(cox2)表达的影响，以进一步探讨木犀草素抗炎的作用机理。
技术方案：以raw2647细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，分别设空白对照组，脂多糖(lps)处理组(模型组)，5、15、45μmol/l木犀草素处理组(中药低、中、高剂量组)；加入药物30min后再加入终浓度为1μg/ml的lps继续培养12h，分别采用酶免疫测定法（eia）检测木犀草素对raw2647细胞前列腺素e２(pge2）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(emsa)检测nfκb的dna结合活性；逆转录聚合酶链反应（rtpcr）测定raw2647细胞中cox2mrna的水平；westernblot法测定raw2647细胞中nfκb和cox2蛋白的表达。
发明有益效果：木犀草素的抗炎作用可能与其能抑制核内nfκb的表达和dna结合活性从而下调cox2的表达有关。
最佳实施方式：运用药物治疗。