利用生物效价检测与HPLC快速检测多抗霉素B的方法与流程

本发明涉及一种药物技术领域的检测方法，具体的涉及到多抗霉素b的生物学效价的检测和hplc化学含量的检测。

背景技术：

多抗霉素是由金色链霉菌，经过发酵产生的代谢产物，属于广谱性抗生素杀菌剂，是由a-n14种不同组分的同系物和异构体组成，为肽嘧啶核苷类抗菌素，主要用于防治苹果落叶斑点病，人参黑斑病，水稻纹枯病等病害。

目前多抗霉素b的检测方法，主要是hplc检测法，进行化学分析计量，但是hplc方法检测费用昂贵，流动消耗大且毒性强，而前期处理步骤过程复杂，分析时间长，不仅于大规模的菌种筛选和生产动态监控中使用，并且色谱柱容易受到发酵杂质的污染，使用寿命短，价格昂贵。

抗生素的生物活性的另一个衡量标准是以生物效价检测法，该方法用量少，灵敏度高。杯碟杯法是琼脂扩散法中的一种常见的分析方法，其原理：

①利用抗生素在摊布含有特定指示菌的琼脂培养基内，滴加液体可进行球型立体扩散的特征；

②形成一定浓度的含有抗生素的肉眼可观察到的透明抑制圈，抑制了试验菌的繁殖；

③抗生素的浓度不同，抑菌大小也不同，比较供试样品与标准品的抑菌直径，可得供试样品的含量，传统的生物测定一般采用常规的90mm、120m的培养皿，在检测时制备平板比较多，工作量大，并且每个平板最多能放6个牛津杯，并且在绘制标准曲线时由于标准溶液分别滴在不同培养皿中，存在较大的误差，因此，建立一套直观、准确快速、简单的生物效价检测方法成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用生物活性检测法，利用自制装置快速的定量分析多抗霉素的生物效价。在利用hplc检测方法分析生物效价中含量高的样品，测得化学含量，有利于在高产菌株筛选及阶段发酵的监控，二者结合，能够二者结合的办法快速、有效、准确测定多抗霉素的有效含量，操作方便，节省成本。

本发明的技术方案是：

1.确认生物效价所用指示菌：利用烟草赤星病菌作为指示菌，生长速度快，抑菌圈明显，培养时间为16-20小时，周期短，将烟草赤星菌的成熟孢子接种到事先灭菌的pda液体培养基中，培养3-4天，得到烟草赤星病菌的成熟菌丝体；

2.确定生物效价测定过程适用的工具：采用自制的木盘取代传统的90mm、120mm的培养皿，规格为长30cm*宽20cm*高4cm，底面积为600cm²，比传统的90mm、120mm培养皿大，可放40个牛津杯，可同时检测18个样品，效率是传统的9倍；

3.确定生物检测的条件：平板厚度为底层培养基为150ml，上层培养基为120ml，为确保平板厚度，利用250ml三角瓶进行定量盛装，一次使用，灭菌和使用方便。烟草赤星病菌经过均质器破碎后，向冷却到45-50℃的上层培养就加入8-12ml，摇匀，浇注成平板，28℃培养预培养1.5h，取出在凝固的平板上摆上牛津杯；

4.标准曲线的建立：将多抗霉素的标品溶于缓冲液中，分别配置成25iu/ml、50iu/ml、100iu/ml；分别滴入牛津杯中，每个牛津杯加200μl，测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径为横坐标，标品浓度的对数作纵坐标，绘制标准曲线；

5.样品的含量测定：将筛选的发酵液用ph＝6.8的缓冲液稀释至600倍，滴入牛津杯中，盖好玻璃将平板放入28℃培养箱培养16-20好，取出，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，代入标准曲线中计算发酵液的含量。

本发明通过确定利用自制装置对多抗霉素生物检测的最佳条件，其优点在于每个玻璃木盘中都滴入标准液，可独立绘制标准曲线，减少误差，另外才方法玻璃木盘的浇注的平板面积大，浇注方便，测量样品的数量多，有利于菌种的高通量筛选。

附图说明：

图1：生物效价检测法的效果图

图2：杯碟法检测标品绘制的标准曲线

图3：hplc线性方程。

具体实施方法

实施例一

步骤1.杯碟法多抗霉素的生物效价测定条件的确定

测定条件：取多抗霉素标准品溶于ph＝6.8的磷酸盐缓冲液，再依次稀释到25iu/ml、50iu/ml、100iu/ml，样品根据酸化量、过滤速度、滤液色泽等因素进行估值，稀释不同倍数，按照估值最终稀释到50iu/ml，将标样、稀释液滴入同一玻璃木盘中的牛津杯中，盖好玻璃培养16-20小时，测定抑菌圈的直径，绘制标准曲线，计算样品含量

①平板浇制：上层培养基为pda培养基，(马铃薯200克去芽去皮切块，加蒸馏水1000ml煮汁，六层纱布过滤，加入至刻度，加1％葡萄糖、2％琼脂粉，调节ph＝6.2)，分装120ml/250ml三角瓶，灭菌备用；

下层培养基2％琼脂粉，分装150ml/500ml三角瓶，灭菌备用；

将玻璃木盘用75％的酒精棉由内向外依次擦拭，放入45℃的恒温无菌室中保温1小时，将底层培养基冷却到50-60℃，迅速倒入玻璃木盘中左右轻轻摇匀，凝固，将上层培养基冷却到45-50℃，加入由均质器打碎的烟草赤星菌病8-12ml，同时加入1ml单位为30iu链霉素，轻微震荡，避免产生气泡，倒入已凝固的底层培养基上，待上层培养基凝固后放入28℃培养箱预培养1-1.5小时，取出将牛津杯按照8*5的排列，顺序摆放，将稀释好的样品及标品，滴入牛津杯中，滴加量200μl，盖好玻璃盖，28℃培养16-20h，取走牛津杯，依次测定抑菌圈的直径，绘制标准曲线，计算样品含量；

②.琼脂用量及胨化程度的确定：不同品牌的琼脂用量和胨化程度有所不同，胨化强度不佳，直接影响液体的扩散，使抑菌圈不圆，边缘不规整等，通过试验对红旗牌、乘风牌、海燕牌琼脂进行甄别筛选，最终确定，海燕牌琼脂2％，胨化较好、扩散效果好，抑菌圈效果最佳；

③.指示菌使用方法的确定：经过pda液体培养基培养的指示菌是球状，结团不分散，无法使用。要利用均质器将其打破，破碎程度上表现在肉眼可分辨不大于0.5mm的即可，加入指示菌时要严格控制上层培养基的温度，温度过高会杀死指示菌，温度过低凝固，无法形成均相的菌悬液；加入量过多，菌悬液浓度过高，菌活量大，抑菌作用不明显，加入量过少，菌悬液浓度过低则菌体生长稀疏，抑菌圈不明显或者不规则，难以准确测量。

步骤2，标准曲线的建立及含量的计算

①标准曲线的建立：在每个测定的玻璃木盘上中标准位置上都滴加在标准的位置上滴加25iu/ml、50iu/ml、100iu/ml的标准稀释液，每一个滴定盘对应一条标准曲线，这就保证了在相同的培养条件下的同步性，在一般情况下，标准单位对应的抑菌圈直径如下：

25iu/ml24.1mm

50iu/ml27.9mm

100iu/ml31.2mm

绘制标准曲线为y＝0.0832x-0.6115,r²＝0.9990

②样品的计算：将样品的抑菌圈直径的平均值代入标准曲线的x中，计算y值，将y值作10的指数计算数值乘以稀释倍数即得样品的含量；

杯碟法利用烟草赤星作为指示菌测多抗霉素含量步骤如下：

1.试验器材的准备自制玻璃木盘用酒精棉由内向外依次擦拭干净，同时放入恒温无菌室中紫外灭菌45分钟，牛津杯选择为同一厂家同一批次，保证管理厚薄，重量均匀，牛津杯清洗干净后，浸泡在75％的酒精中，使用前取出对牛皮纸包裹，在烘干箱中烘干使用；

2.样品与标准品溶液的配置标准品一次性称取一定量配置标准母液，4℃冰箱内保存，每次使用取出母液，稀释到25iu/ml、50iu/ml、100iu/ml浓度，样品按照估值，稀释一定倍数，得到50iu/ml的样品溶液；

3.底层培养基的配置要注意保持无菌工作台水平，底层平整无气泡无凝结；

4.指示菌的制备将烟草赤星菌成熟孢子接入灭菌的pda培养基中，在环境温度28℃，转速220r/min的摇床上培养3-4天，结团颜色由白色变成黑色，取出，用均质器转速3000r/min,切短菌丝体备用，菌体细度要符合要求；

5.上层培养基的制备将灭菌的上层pda培养基溶化，冷却到45-50℃，加入1ml单位为30iu链霉素，同时加入8-12ml均质的赤星病菌，混合均匀，浇注在凝固的下层培养基上，注意要缓慢摇匀，避免产生气泡，厚度不匀，将凝固的上层培养基放入培养箱中培养1-1.5小时，取出；

6.放置牛津杯每个制备好的平板可放置40个牛津杯，采用8*5的排列，间距等同，放置时小心，要从同一高度垂直放在制备好的平板上，不得倾倒，不能悬空摔下，放置好后不能随意移动，静置5分钟，使之在琼脂内稍下沉降后，再开始滴加样品；

7.滴加样品用移液枪往每个牛津杯滴加200μl样品，滴加枪头要事先灭菌，滴加时不要离开牛津杯口太高，避免溅出，滴加完后，平板要轻拿轻放，盖好玻璃盖，放在培养箱中培养16-20小时，取出；

8.测抑菌圈的直径：将平板中的牛津杯取走，在平板底部放一张黑纸，在灯光下用游标卡尺测量抑菌圈直径，并记录测量数据，绘制标准曲线，计算结果。

此方法的好处在于，制备平板较便捷，测定的样品数量较多，并且平板培养时避免位置的受热不匀导致菌的生长迟延发生，最重要的每个平板对应一条标准曲线，减少误差值。

实施例二

hplc检测

实施例一测量的高效价的样品，在采用hplc检测，利用二者对比，有效减少工作量，完成含量准确测量

hplc检测条件如下：

色谱条件：色谱柱品牌安捷伦，填充hypersil，c185um填料；

规格250*10mm，检测器波长260nm，流动相甲醇：水＝10：90三氟乙酸调节ph＝3.5-4.0，可有效的检测多抗霉素的化学含量。

步骤1、线性关系

配制一定浓度梯度的多抗霉素标准溶液，按照上述方法进行分析，每个浓度重复两次，对其峰面积取平均值。以多抗霉素的质量浓度为横坐标，以多抗霉素的峰面积为纵坐标，绘制线性关系图。实验结果如表1

表1：多抗霉素hplc检测线性关系

以上结果表明，在0.2mg/ml--1.0mg/ml范围内，多抗霉素b峰面积与进样浓度具有良好的线性关系，线性方程式为：y＝1000000x-22802，线性相关系数r2＝0.9994，可以较好地对多抗霉素b进行定量分析。

步骤2、多抗霉素准确度实验

将已知含量的本产品试样加入不同质量的多抗霉素标样，测定本方法对多抗霉素b的加标回收率，实验结果如表2

表2：多抗霉素b加标回收率

由表2数据进行分析，多抗霉素b平均回收率在99.7％，可见本方法测定多抗霉素b的质量分数的准确度较高，能满足定量的要求。

步骤3、检测方法的精密度实验

按照本标准规定的方法对同一样品中的多抗霉素b质量分数进行8次平行测定，并对标准偏差和变异系数进行统计，实验结果如表3

表3：多抗霉素b标准偏差

由表3数据可知，本方法对统一样品中多抗霉素b质量分数分析的标准偏差为0.207％，变异系数为1.01％。