一种利用SERS光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法与流程

本发明涉及纳米材料和生命科学领域，具体涉及一种利用sers光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法。

背景技术：

相思子毒素(abrin)是从豆科植物种子中分离的一种细胞毒性蛋白，其毒性超过了蓖麻毒素，小鼠的ld50为0.05μg/kg，成年人的致死剂量为5.0～7.0μg/kg，已被列入一种潜在的重要生物毒素战剂和生物恐怖病原物质之一。相思子毒素结构、作用机理与蓖麻毒素类似，均由a、b两条链组成，由一个二硫键相连，b链具有半乳糖凝集活性，可与细胞膜上受体结合，帮助a链进入细胞内，a链进入细胞催化60s大亚基的28srrna的第4324位脱去腺嘌呤而使60s核糖体亚基失活，从而使细胞蛋白合成被抑制。相思子毒素没有特异的化学基团和元素，一般的物理、化学和生化方法很难给予鉴别，中毒早期无特殊中毒症状和病变，待发现中毒症状后，已难以治疗，侦检极为困难。对这类毒素的检测只能依赖于抗原-抗体特异反应的免疫学检测方法。

中毒早期相思子毒素就会对细胞有一定程度的损伤从而诱导细胞的凋亡，而从细胞凋亡到细胞坏死的每个凋亡阶段细胞内发生变化的物质和程度都不一样，但仅通过普通的试剂盒无法判断细胞受损程度和凋亡水平。因此迫切需要方便、灵敏的检测细胞凋亡水平的方法，使能及时发现中毒早期，及时给予治疗，降低死亡率。

1928年，印度物理学家raman第一次发现了拉曼散射现象。由于拉曼位移仅与物质分子的振动和转动能级有关，因此拉曼光谱技术可用于进行分子结构定性分析。1974年，fleischmann等人发现在粗糙的银表面吸附单层吡啶分子，受到电磁波和化学增强机制的影响，拉曼信号强度大幅度地增强。之后通过其他科学家系统的实验和计算，指出具有粗糙的表面和纳米级表层的贵金属能够增加分析物的拉曼散射信号，并且产生的增强因子是正常拉曼散射的10⁴-10⁸倍。这种现象被称为表面增强拉曼现象。随着表面增强拉曼光谱(surfaceenhancedramanscattering,sers)技术的快速发展，逐渐成为了一种强大的分析检测工具，在生物科学、表面科学以及分析科学方面被广泛应用。

sers光谱是一种无损光谱技术。它能够进行指纹识别，并且能从分子水平出发，对物质的结构及组成信息进行探究。与其他光谱手段相比，它还不易受水的影响、光谱带宽相对较窄、不易淬灭、可用红光引发，因此非常适合于生物体系，特别是对于单个活细胞的研究。sers光谱作为一种指纹图谱，可以实现实时监测毒素作用细胞的损伤过程。

本发明提供了一种利用sers光谱表征毒素对活细胞损伤作用的方法，将sers光谱应用到活细胞表征中，不但拓展了sers光谱的新应用，也对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。以tat功能化sers探针作为拉曼增强基底，通过受体依赖介导的胞吞作用跨膜进入活性细胞，增强了细胞本身的拉曼信号。通过检测毒素作用前后细胞的平均sers光谱的变化来实现对细胞损伤的表征，并利用差谱分析和pca对比了毒素作用不同时间的细胞的差异，识别和区分了不同状态下的细胞。为了进一步验证细胞的凋亡水平，运用annexinv-fitc/pi双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。本发明能够实时无损监测毒素对细胞的损伤作用，具有简单易行、便捷高效的优点。

技术实现要素：
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本发明的目的在于利用sers光谱指纹识别的特性对毒素作用活细胞产生的损伤作用进行快速、准确的实时监测，特别涉及到纳米材料应用于生命科学的检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.前述的一种利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的tat功能化sers探针由金纳米星(aunss)偶联穿膜肽(tat)制得。

2.前述的一种利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的显微共聚焦拉曼光谱仪的设定参数是：二极管激发波长是633nm，曝光时间为10s，循环次数为1次。

3.前述的一种利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的毒素是相思子毒素。

4.前述的一种利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的活性细胞是人的肝癌细胞hepg2。

5.前述的一种利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法：是用探针与细胞孵化使探针进入细胞内，期间加入相思子毒素，然后进行拉曼多光谱检测。

6.前述的一种利用sers光谱表征毒素对细胞损伤作用的方法中，所述的annexinv-fitc/pi双染试剂利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行量化。

本发明的优点是：

(1)tat功能化sers探针的制备简单便捷。

(2)将sers光谱应用到活细胞的表征中，拓展了sers光谱的新应用，同时对活性细胞损伤的研究具有潜在的应用前景。

(3)本实验简单易行、便捷高效，结果准确可靠，为实时监测毒素对细胞的损伤作用提供了新方法。

附图说明

图1：金种子的紫外-可见吸收光谱图(a)和tem电镜图(b)；

图2：金纳米星的紫外-可见吸收光谱图(a)和tem电镜图(b)；

图3：不同激发波长下nba标记金纳米星的sers光谱(a)和在633nm激发光条件下，592cm^-1处nba的sers强度(b)；

图4：tat修饰后的金纳米星的紫外-可见吸收光谱图(a)和tat修饰后的金纳米星的sers光谱(b)；

图5：水溶液中tat功能化sers探针37℃下放置不同时间的紫外-可见吸收光谱(a)和培养基中tat功能化sers探针37℃下放置不同时间的紫外-可见吸收光谱((b)；

图6：不同浓度金含量(0、25、50、100、200和500μm)的tat功能化sers探针与hepg2细胞共培养24h的存活率(a)、200μm金含量的功能化sers探针与hepg2细胞共培养不同时间(12、24、36、48和72h)的细胞存活率(b)；

图7：不同浓度的相思子毒素(0、1.2、6、12、60和600μg/ml)侵染hepg2细胞12h的细胞存活率；

图8：60μg/ml的相思子毒素侵染hepg2细胞不同时间(0、2、4、8、12和24h)的平均拉曼光谱；

图9：60μg/ml的相思子毒素侵染hepg2细胞不同时间(0、2、4、8、12和24h)之间的差谱分析；

图10：相思子毒素作用肝癌细胞hepg2不同时间的pca散点图；

图11：用膜联蛋白v-fitc/pi染色流式细胞术测定60μg/ml的相思子毒素侵染hepg2细胞不同时间(0、2、4、8、12和24h)的细胞凋亡水平。

具体实施方式

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

实施例1

金种子的合成路线如下：

称取0.2g柠檬酸三钠溶于20ml的超纯水中配成质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液。将1ml浓度为100mm的haucl4加入99ml沸腾的超纯水中。然后加入15ml质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液并剧烈搅拌。反应10分钟后，金溶胶的颜色变成酒红色，终止反应。制备的金种子常温冷却至室温，用紫外-可见吸收光谱图(图1a)和tem电镜图(图1b)进行表征，在4℃下储存备用。

实施例2

金纳米星的合成路线如下：

将50μl浓度为100mm的haucl4溶液加入19.5ml不断搅拌的超纯水中，然后分别加入200μl上述制得的金种子、200μl浓度为3mm的硝酸银溶液和100μl浓度为100mm的抗坏血酸溶液，在室温下搅拌反应10min至溶液颜色变为蓝绿色。最后通过3000rpm离心15min终止反应，用紫外-可见吸收光谱图(图2a)和tem电镜图(图2b)进行表征。

实施例3

金纳米星sers效应的检测：

将200μl浓度为0.5mm的nba水溶液加入20ml制备的金纳米星溶液中，在37℃的摇床中过夜孵育。以3000rpm的转速离心15min停止反应，用超纯水重悬，分别选择532nm、633nm和785nm波长二极管激光作为激发光源，检测了nba的sers光谱，得到最佳激发波长为633nm(图3a)。在633nm激发波长下，金纳米星测得nba的sers光谱的信号强度远大于相同浓度下nba的拉曼信号。以592cm^-1处的nba特征峰强度用于比较金纳米星的增强效应(图3b)。

实施例4

tat功能化sers探针的合成如下：

在上述制备的金纳米星溶液中加入100μlsh-peg-cooh(10μm)溶液并且不断搅拌1h后以3000rpm的转速离心15min去除多余未反应的试剂，加入pbs重悬。然后将20μltat加入到上述溶液中，37℃振荡过夜孵育。最后以3000rpm的转速离心两次，每次15min，用超纯水重悬，即制得tat功能化sers探针，用紫外-可见吸收光谱图(图4a)和tem电镜图(图4b)进行表征。

实施例5

tat修饰的金纳米星的稳定性的研究：

将上述制得的tat功能化sers探针离心分别重悬于超纯水和基本培养基中，37℃下分别放置12h、24h和48h，用紫外-可见吸收光谱图(图5)进行表征。

实施例6

tat功能化sers探针的细胞毒性检测：

采用cck-8法检测tat功能化sers探针的细胞毒性。通过质量守恒定律，测得制备的标记sers探针的金含量约为50μg/ml，通过稀释和浓缩得到金含量梯度为126.9μm、253.8μm、507.6μm、1015.2μm和2538.1μm的探针。首先将生长对数期的细胞消化下来制备成细胞悬液加入到96孔板中，以5000个/ml的密度每孔接种100μl。培养至细胞贴壁后加入20μl不同金含量的sers探针，使得培养基内金的终浓度分别为0、25μm、50μm、100μm、200μm和500μm，然后将其放置在培养箱中共培养24h。通过微量移液器在96孔板中加入10μlcck-8试剂，继续培养4h。最后用酶标仪测定450nm激发波长下的吸光值。利用下述公式计算细胞相对存活率：细胞相对存活率(rgr)＝(实验组吸光值—cck8本底)/(对照组实验值—cck8本底)×100％(图6a)。

采用cck-8法确定tat功能化sers探针与细胞共培养的最佳时间。将生长对数期的细胞消化下来制备成细胞悬液加入到96孔板中，以5000个/ml的密度每孔接种100μl。培养至细胞贴壁后加入20μl的sers探针，然后将其放置在培养箱中分别共培养12h、24h、36h、48h和72h。通过微量移液器在96孔板中加入10μlcck-8试剂，继续培养4h。最后用酶标仪测定450nm激发波长下的吸光值。利用上述公式计算细胞相对存活率(图6b)。

实施例7

相思子毒素的细胞毒性检测：

采用cck-8法检测相思子毒素的细胞毒性。将生长对数期的细胞消化下来制备成细胞悬液加入到96孔板中，以5000个/ml的密度每孔接种100μl。培养至细胞贴壁后加入10μl不同浓度的相思子毒素，使得毒素的终浓度分别为0、1.2μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、60μg/ml和600μg/ml，然后将其放置在培养箱中共培养。通过微量移液器在96孔板中加入10μlcck-8试剂，继续培养4h。最后用酶标仪测定450nm激发波长下的吸光值，计算细胞相对存活率(图7)。

实施例8

相思子毒素作用肝癌细胞hepg2不同时间的sers检测：

待细胞生长到对数生长期后，将细胞按80000个/ml的密度接种350μl到无菌石英片上。细胞培养至贴壁后，吸出旧培养基，加入混匀tat功能化sers探针的基本培养基2ml，与细胞共培养24h，期间加入200μl的相思子毒素，使毒素对细胞的作用时间分别为0、2h、4h、8h、12h和24h，然后进行拉曼多光谱检测(图8)。

实施例9

相思子毒素作用肝癌细胞hepg2不同时间的差谱分析：

每种细胞的平均sers光谱的强度被归一化至相对值0到1的范围内，对比了毒素作用hepg2不同时间sers光谱的差异(图9)。

实施例10

相思子毒素作用肝癌细胞hepg2不同时间的主成分分析：

pca是一种将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量以便更好区分不同研究对象的多元统计分析方法。通过pca分析得到毒素作用细胞不同时间的sers光谱的二维散点图。毒素作用细胞不同时间的过程中，第一主成分得分贡献率是86.277％，第二主成分得分的贡献率是13.723％。相思子毒素作用0h和作用24h的细胞分布在不同区域，说明在毒素的作用下，细胞受到损伤，两种细胞已经存在明显差异(图10)。

实施例11

相思子毒素作用肝癌细胞hepg2不同时间的流式细胞术检测：

通过用annexinv-fitc/pi双染色法对细胞进行染色，并于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。细胞贴壁后，加入相思子毒素分别反应0、2h、4h、8h、12h和24h。将培养基吸出至离心管中，用pbs洗涤细胞一次，加入不含edta的胰酶消化液。用已收集的培养基吹打下细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬并计数。然后取50万重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清。加入195μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞，加入5μlannexinv-fitc染色液，轻轻混匀；加入10μlpi染色液，轻轻摇匀。然后在室温(20—25℃)避光孵育10—20min，随后置于冰浴中，用流式细胞仪进行检测。孵育过程中可重悬细胞2—3次以改善染色效果。anv-/pi-为正常活细胞，anv-/pi+为机械损伤死亡细胞，anv+/pi-为早期凋亡细胞，anv+/pi+为晚期凋亡以及坏死细胞(图11)。