多光谱显微成像系统的制作方法

本发明涉及计算摄像学技术领域，特别涉及一种多光谱显微成像系统。

背景技术：

遥感成像、生命科学和材料科学研究对多光谱成像提出了更高要求。观测目标或场景由于不同区域包含不同材质或荧光标记蛋白，能够发出具有不同的光谱曲线的信号。多光谱成像，就是利用这些光谱响应差异，计算重建出各种材质或荧光蛋白成像，且主要困难在于不同材质或标记蛋白光谱响应曲线可能存在重叠，导致不能简单通过加入不同谱段的滤光片实现材质或荧光标记成像的拆分。

目前，在宏观领域，多光谱成像主要在成像光路上加入不同谱段的滤光片多次成像或利用多个不同谱段的二向色镜同时对多个谱段成像，然后利用这些光谱成像堆栈，计算重建出不同材质或标记图像。在显微成像领域，有基于宽场显微镜的多光谱成像、基于共聚焦显微镜和光片照明的多光谱显微成像。基于宽场显微镜的多光谱成像，光照端采用单色或多色激发，在成像光路上加入不同谱段滤光片多次成像或多个不同谱段的二向色镜同时成像，利用这些光谱成像堆栈计算重建出不同材质或标记图像，减少光谱响应曲线存在重叠的影响。基于共聚焦显微的多光谱显微成像，逐点扫描荧光样本，在采集端加入色散器件，利用多个pmt(photomultipliertube，光电倍增管)记录该点光谱信息。基于共聚焦和光片照明的多光谱显微，采用线扫光片照明，在成像光路加入色散器件，然后用相机记录整条线上激发的荧光光谱。通过共聚焦显微逐点扫描或逐行扫描获得整个视场光谱信息，然后计算重建出各种标记结构成像。

然而，相关技术中仍存在不足，如，基于共聚焦显微镜的多光谱成像，所需激发光较强，容易造成荧光漂白，而且强光照射可能损伤样本细胞或组织结构；再如，成像过程需要扫描或多次拍摄，时间效率低，导致适用于光敏样本和生物样本，而且成像速度慢，不能记录动态过程，有待解决。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的目的在于提出一种多光谱显微成像系统，该系统可以提高成像速度，提高图像分辨率，减少激光对光敏样本、生物样本的破坏，并且结构简单，成本低廉。

为达到上述目的，本发明实施例提出了一种多光谱显微成像系统，包括：显微镜，用于将显微样本放大并成像到像面引出口；调制掩膜，所述调制掩膜位于所述显微镜的输出像面上，以约束后级成像视场范围，并加入随机掩膜调制；滤光片，所述滤光片位于视场光阑后，以对来自所述显微样本的光照信息进行窄带滤波，约束系统成像光谱范围；色散单元，用于将所述样本上各点光谱信息在空间上展开；像感器，用于记录经前级调制的样本图像，以通过色散和掩膜调制在一张或两张重建出多种标记图像。

本发明实施例的多光谱显微成像系统，能够实现单相机下单次或多次曝光采集数据，即可恢复出单色标记图像，实现仅采用一张或两张图像即可重建出多种标记图像，从而提高成像速度，提高图像分辨率，减少激光对光敏样本、生物样本的破坏，并且结构简单，成本低廉。

另外，根据本发明上述实施例的多光谱显微成像系统还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，还包括：重构模块，通过所述色散和掩膜调制得到图像，并和标记荧光蛋白光谱响应曲线重建出所述样本的各荧光蛋白标记的组织结构。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述显微镜可以为宽视场荧光显微镜。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述调制掩膜位于像面上，色散单元位于傅立叶面上。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述色散单元处的傅立叶面和所述像感器处的像面通过透镜或镜头组成的4f系统实现。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述4f系统用于加入色散调制和成像放大倍率调整。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述滤光片位于成像光路上所述4f系统第一级透镜后，或直接加在所述显微镜内部或光路其他位置，以约束所述成像光谱范围。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述随机掩膜通过平移方式调整掩膜横向位置。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述色散单元为阿莫西色散棱镜。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述像感器为scmos单色传感器。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的多光谱显微成像系统的结构示意图；

图2为根据本发明一个具体实施例的多光谱显微成像系统的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参照附图描述根据本发明实施例提出的多光谱显微成像系统。

图1是本发明实施例的多光谱显微成像系统的结构示意图。

如图1所示，该多光谱显微成像系统10包括：显微镜100、调制掩膜200、滤光片300、色散单元400和像感器500。

其中，显微镜100用于将显微样本放大并成像到像面引出口。调制掩膜200位于显微镜100的输出像面上，以约束后级成像视场范围，并加入随机掩膜调制。滤光片300位于视场光阑后，以对来自显微样本的光照信息进行窄带滤波，约束系统成像光谱范围。色散单元400用于将样本上各点光谱信息在空间上展开。像感器500用于记录经前级调制的样本图像，以通过色散和掩膜调制在一张或两张重建出多种标记图像。本发明实施例的系统10可以仅采用一张或两张图像即可重建出多种标记图像，提高成像速度，提高图像分辨率，减少激光对光敏样本、生物样本的破坏，并且结构简单，成本低廉。

其中，在本发明的一个实施例中，本发明实施例的系统10还包括：重构模块。其中，重构模块通过色散和掩膜调制得到图像，并和标记荧光蛋白光谱响应曲线重建出样本的各荧光蛋白标记的组织结构。

可以理解的是，本发明实施例利用单次拍摄或平移掩膜得到的多张图片，结合各荧光标记的光谱响应曲线，可以计算重建出不同标记成像。其中，重建模块计算重建过程可以在普通pc机或工作站等硬件系统上实现。

也就是说，本发明实施例的多光谱显微成像系统10主要包括图像采集和计算重建两部分。

其中，图像采集部分由显微镜100，调制掩膜200，滤光片300，色散单元400和像感器500组成。显微镜100可以实现多标记样本荧光激发和放大成像。调制掩膜200在像面加入随机二值调制。色散单元400在4f系统傅立叶面上将像面上面每个点光谱信息在空间展开，4f系统实现成像系统放大倍率调整和色散范围调整。

计算重建部分利用单次拍摄或平移掩膜得到的多张图片，即通过单次拍摄或两次拍摄即可获得多标记样本各自成像，且成像速度快，结合各荧光标记的光谱响应曲线，可以计算重建出不同标记成像。其中，重建模块计算重建过程可以在普通pc机或工作站等硬件系统上实现。

进一步地，在本发明的一个实施例中，显微镜100可以为宽视场荧光显微镜。

可以理解的是，本发明实施例的显微镜100为宽视场荧光显微镜，以实现荧光样本的一级放大，将样本像面从引出口导出便于后级处理。

进一步地，在本发明的一个实施例中，调制掩膜200位于像面上，色散单元位于傅立叶面上。

进一步地，在本发明的一个实施例中，色散单元400处的傅立叶面和像感器500处的像面通过透镜或镜头组成的4f系统实现。

进一步地，在本发明的一个实施例中，4f系统用于加入色散调制和成像放大倍率调整。

进一步地，在本发明的一个实施例中，滤光片300位于成像光路上4f系统第一级透镜后，或直接加在显微镜100内部或光路其他位置，以约束成像光谱范围。

可以理解的是，本发明实施例的滤光片300可以位于调制掩膜200后的4f系统第一级透镜后，滤光片300用于对来自样本的光信号进行谱段范围约束。也就是说，通过滤光片300后，来自样本的光信号仅特定带宽范围内可以通过，从而限定了后级色散范围。需要说明的是，在实际成像光路中，滤光片300的并不严格限定，即位置可调。

其中，4f系统可以为两个不同焦距透镜或镜头，前级透镜后焦面和后级透镜前焦面重合。如果成像光路像面位于前级透镜前焦面上，在后级透镜后焦面处将得到被放大或缩小的像面，像面放大缩小比例由后级透镜和前级透镜焦距比例决定。

进一步地，在本发明的一个实施例中，随机掩膜可以通过平移方式调整掩膜横向位置。

可以理解的是，调制掩膜200位于显微输出像面上，调制掩膜200用于限制视场范围并加入随机掩膜调制，其中，该随机掩膜可以通过平移方式调整掩膜的横向位置。

可选地，在本发明的一个实施例中，色散单元为阿莫西色散棱镜。

可选地，在本发明的一个实施例中，像感器500可以为scmos单色传感器。

可以理解的是，像感器500可以位于4f系统第二个透镜的后焦面上，像感器500用于记录经掩膜调制和色散调制的成像结果，其中，像感器500采用scmos单色相机。

综上所述，本发明实施例可以利用显微镜物镜，在输出的样本荧光图像面上加入二值随机掩膜调制，用滤光片300约束光谱范围，然后在傅立叶面上加入色散调制，利用4f系统调整放大倍率和色散范围，像感器500记录调制后图像。本发明实施例的系统10在于激发光源功率低，可应用于光敏样本和生物样本成像，减少荧光漂白和对样本的损伤，成像速度快，图像重建分辨率高。

例如，如图2所示，在本发明的一个具体实施例中，该系统包括：显微镜100、调制掩膜200、滤光片300、色散单元400及像感器500。

具体地，结合图2所示，显微样本107位于显微镜100的显微物镜106的焦面上；激光光源104发出的激发光通过二向色镜105反射后经物镜106聚焦后激发样本107的荧光信号。荧光信号经物镜106后，透过二向色镜105，再经反射镜103和管镜102后成像到像面引出口101；在像面位置放置随机掩膜调制，限制视场范围并加入调制；进一步通过4f系统第一个透镜和滤光片300继接像至色散棱镜400；色散后的光信号经过4f系统第二个透镜成像到后焦面的像感器500上。

其中，上述的显微镜100既可以是传统的商业显微镜，也可以根据不同应用选择倒置显微镜，也可以是正置显微镜，并不局限于图2中所示的倒置显微镜形式，其构成以及作用对于本领域的技术人员而言都是已知的，此处不再详细赘述。

另外，对本发明实施例采集到多标记荧光样本不同调制成像处理，利用单个标记光谱响应曲线，可以重建出单个标记成像。首先利用单色标记未色散样本成像训练生成过完备稀疏表示字典；将成像过程看作真值图像和标记光谱响应的卷积过程；通过计算色散图像在色散核与字典乘积上的稀疏表示系数，恢复出单色标记成像。

需要说明的是，各级系统的数值孔径的匹配，物镜本身提供的数值孔径，同时需要选定适当的色散核和训练过完备字典的尺寸。

根据本发明实施例提出的多光谱显微成像系统，能够实现单相机下单次或多次曝光采集数据，即可恢复出单色标记图像，实现仅采用一张或两张图像即可重建出多种标记图像，从而提高成像速度，提高图像分辨率，减少激光对光敏样本、生物样本的破坏，并且结构简单，成本低廉。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。