直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法与流程

本发明涉及病理鉴别技术领域，尤其是涉及一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法。

背景技术：

直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，据世界卫生组织国际癌症研究中心(iarc)资料显示，2012年全世界约有136万直肠癌新发病例，位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位。近年来，随着直肠肿瘤现代治疗理念的不断深入，新辅助放化疗对局部中晚期直肠癌的疗效已得到肯定，新辅助放化疗(neo-adjuvantchemoradiotherapy，neo-crt)指术前采取的放化疗措施。由于患者术前直肠肿瘤血供健全，乏氧肿瘤细胞少，对放疗敏感；新辅助放化疗可缩小肿瘤，使之降级、降期，增加完整切除率、尽最大可能增加保肛率。总体而言，新辅助放化疗可以使术后局部复发降低50％左右，因为这样的优势，新辅助放化疗近年来在我国也得到了广泛的推广应用。

但是，新辅助放化疗在降低直肠肿瘤局部复发率、提高保肛率、延长患者的生存期的同时，放化疗所造成的局部组织胶原增生，影响患者吻合口愈合，进而增加了患者术后出现吻合口狭窄、吻合口漏等并发症的可能。其中，吻合口漏表现为持续性高热、麻痹性肠梗阻、急性腹膜炎等症状，严重者可危及生命，是直肠癌时候常见的严重并发症，也是死亡的主要原因之一；吻合口狭窄往往造成病人排便不畅、便频，甚至产生急性闭袢性肠梗阻，降低患者的生存质量。而切缘处的胶原含量会直接影响到吻合口愈合，与术后是否出现上述并发症息息相关。

因此，研究开发出一种对直肠癌切除标本的切缘处胶原进行组织评价的方法，对获取患者直肠组织的结构信息和患者术后吻合口愈合状况以及评估患者术后是否可能出现严重并发症等均具有十分重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，上述方法通过masson染色结合多光子成像分析对直肠癌新辅助治疗后的直肠癌切除标本的切缘处胶原进行组织评价，有助于临床工作者了解患者直肠组织的局部纤维化程度及吻合口的愈合状况。

本发明提供的一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取2～3张组织切片，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，剩余组织切片圈注组织粘膜下层后进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图。

进一步的，所述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm。

进一步的，所述步骤(a)中冷藏保存为-86℃冰箱保存。

进一步的，所述步骤(b)中masson染色切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像。

进一步的，所述步骤(d)进行二次谐波成像前对待测多光子成像切片滴少量无荧光镜油。

进一步的，所述步骤(d)二次谐波成像为利用单通道探测器进行成像。

更进一步的，所述步骤(d)单通道探测器的输出功率为1.5w～1.8w，成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm。

进一步的，所述步骤(d)二次谐波成像的成像倍数为63倍，成像面积为585μm×585μm。

进一步的，所述方法具体包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取2～3张组织切片，组织切片的厚度为3～8μm，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，剩余组织切片圈注组织粘膜下层后放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，扫描成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：采用单通道探测器对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述单通道探测器的成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm，输出功率为1.5w～1.8w，所述二次谐波成像的成像倍数为63倍，成像面积为585μm×585μm。

进一步的，所述方法还包括将步骤(d)得到的多光子胶原成像图导入分析系统进行胶原层面分析的步骤。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，通过masson染色结合多光子成像分析对直肠癌新辅助治疗后的直肠癌切除标本的切缘处胶原进行组织评价，有助于临床工作者了解患者直肠组织的局部纤维化程度及吻合口的愈合状况，从而为临床医生在术式选择及后续诊疗中提供参考，为患者提供更具个性化治疗方案，最终达到提高患者的生活质量、尽量避免严重并发症出现的目的。本发明设计合理，技术成熟，简便易行，具有广阔的临床应用前景和良好的科研推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法流程图；

图2为本发明效果例1提供的传统方法测得的胶原含量较多标本的多光子胶原成像图；

图3为本发明效果例1提供的传统方法测得的胶原含量较少标本的多光子胶原成像图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取2～3张组织切片，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，剩余组织切片圈注组织粘膜下层后进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图。

本发明中，直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，通过masson染色结合多光子成像分析对直肠癌新辅助治疗后的直肠癌切除标本的切缘处胶原进行组织评价，首先利用masson染色切片确定多光子成像区域，随后进行多光子成像，上述多光子成像是一种基于非线性光学和飞秒激光镭射之上的多光子显微成像技术，通过利用活体组织中细胞自身产生的自体荧光及非中心对称组织(如胶原)产生的二次谐波进行成像，该方法无需传统病理活检的组织切取、固定、包埋、切片、染色等步骤，便可实时快速地观察到标本的组织结构和细胞形态的目的，其具有穿透力强、光损伤小、分辨率高等优点能对石蜡切片、新鲜离体组织以及活体组织都可以清晰成像。因此，本发明将多光子成像技术应用于直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价具有广阔的应用前景和科研推广价值。

本发明直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法有助于临床工作者了解患者直肠组织的局部纤维化程度及吻合口的愈合状况，从而为临床医生在术式选择及后续诊疗中提供参考，为患者提供更具个性化治疗方案，最终达到提高患者的生活质量、尽量避免严重并发症出现的目的。本发明设计合理，技术成熟，简便易行，具有广阔的临床应用前景和良好的科研推广价值。

优选的，将步骤(b)标注组织粘膜下层的masson染色切片扫描图片导入商业化的软件分析系统，得出单位面积下胶原百分比和reticulationindex值。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm。

作为一种优选的实施方式，上述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm更利于光学电镜以及多光子成像的观察。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)中冷藏保存为-86℃冰箱保存。

作为一种优选的实施方式，上述步骤(a)中冷藏保存为在-86℃冰箱中保存，可以使组织切片保持更好的安全性、均匀性和稳定性，进而使多光子成像达到更好的技术效果。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(b)中masson染色切片的扫描成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像。

作为一种优选的实施方式，上述步骤(b)中masson染色切片的扫描成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像可以使获得的masson染色切片扫描图更加清晰。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(d)进行二次谐波成像前对多光子成像切片滴少量无荧光镜油。

作为一种优选的实施方式，在多光子成像切片上滴少量无荧光镜油可以避免荧光对多光子成像的影响。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(d)二次谐波成像为利用单通道探测器进行成像。

在上述优选实施方式中，所述步骤(d)单通道探测器的输出功率为1.5w～1.8w，成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm。

作为一种优选的实施方式，本发明根据直肠癌切除标本的切缘制得的待测切片的特点，选择单通道探测器的输出功率为1.5w～1.8w，成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm对待测切片进行成像。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(d)二次谐波成像的成像倍数为63倍，成像面积为585μm×585μm。

在本发明的一种优选实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取2～3张组织切片，组织切片的厚度为3～8μm，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，剩余组织切片圈注组织粘膜下层后放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，扫描成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：采用单通道探测器对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述单通道探测器的成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm，输出功率为1.5w～1.8w，所述二次谐波成像的成像倍数为63倍，成像面积为585μm×585μm。

在本发明的一种优选实施方式中，所述方法还包括将步骤(d)得到的多光子胶原成像图导入分析系统进行胶原层面分析的步骤。

作为一种优选的实施方式，上述方法还包括将步骤(d)得到的多光子胶原成像图导入分析系统进行胶原层面分析，进而得出胶原百分比面积、每平方毫米胶原数量、平均胶原长度、胶原长度标准差、平均胶原宽度、胶原宽度标准差、平均胶原垂直度、胶原垂直度标准差、胶原交联密度、胶原平均交联空间和胶原交联空间标准差数值等数据。

实施例1

如图1所示，一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，所述方法具体包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取2张组织切片，组织切片的厚度为3μm，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，剩余组织切片圈注组织粘膜下层后放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，扫描成像倍数为15倍，分辨率为0.50μm/像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：采用单通道探测器对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述单通道探测器的成像波长为800nm，接收波长为390nm，输出功率为1.5w，所述二次谐波成像的成像倍数为60倍，成像面积为585μm×585μm。

实施例2

一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，所述方法具体包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取3张组织切片，组织切片的厚度为8μm，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，剩余组织切片圈注组织粘膜下层后放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，扫描成像倍数为25倍，分辨率为0.50μm/像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：采用单通道探测器对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述单通道探测器的成像波长为820nm，接收波长为410nm，输出功率为1.8w，所述二次谐波成像的成像倍数为65倍，成像面积为585μm×585μm。

实施例3

一种直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法，所述方法具体包括以下步骤：

(a)样本准备：将直肠癌切除标本的切缘处取出后进行常规蜡块制备，每一块组织中连续切取2张组织切片，组织切片的厚度为5μm，取一张进行病理学masson染色，制得masson染色切片，另一张组织切片圈注组织粘膜下层后放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)masson切片扫描：通过切片扫描仪对masson染色切片进行整体切片成像，扫描成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像，成像完毕后通过软件标注组织粘膜下层；

(c)标注成像区域：在普通光学显微镜下对masson染色切片中组织粘膜下层符合直肠癌切除标本的切缘处胶原区域进行观察，并以标注的组织粘膜下层为基准，与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(d)多光子胶原成像：采用单通道探测器对步骤(c)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述单通道探测器的成像波长为810nm，接收波长为400nm，输出功率为1.6w，所述二次谐波成像的成像倍数为60倍，成像面积为585μm×585μm。

效果例1

为表明本发明直肠癌切除标本的切缘处胶原进行组织评价的方法，可以直观准确的对直肠癌切除标本的切缘处胶原进行组织评价，同时具有简便易行的特点。现特别使用现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法对新辅助放化疗后的两个直肠癌切除标本的切缘处胶原含量进行测定，其中：标本1为测得胶原含量较多的标本，标本2为测得胶原含量较少的标本。

现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法，主要操作过程为：组织切片在100℃环境下干燥至恒重后在110℃6mol/l的hcl溶液中水解18小时；酸解液蒸发完毕后残渣用无离子水洗涤三次，每次洗涤步骤之间需完全蒸发，以除去残酸；样品经乙酸乙酯枸橼酸盐缓冲液(ph6)溶解和处理后，通过比色分析羟脯氨酸值，分析结果乘固定系数7.46即为胶原含量，单位为ug/mg。该方法操作流程较为繁琐且耗时，也无法对胶原微观结构进行分析。

将上述标本1和标本2分别使用本发明实施例3提供的直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法进行评价，其中：

如图2所示，标本1的多光子胶原成像图可见局部胶原含量多、排列紊乱，吻合口愈合情况不佳，评估患者术后出现吻合口漏的可能性较大，建议行预防性造口并术后严密监测有无发热、腹膜炎体征等吻合口漏症状，避免患者出现严重腹腔感染危及生命。

如图3所示，标本2的多光子胶原成像图可见胶原含量少、排列整齐，吻合口愈合情况尚可，提示患者术后出现吻合口漏的可能性较小，可根据患者一般情况考虑不行预防性造口，避免二次手术所致风险及临时性造口所致心理负担，提高患者的生存质量。

由此可知，本发明直肠癌切除标本的切缘处胶原组织评价方法与现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法得到的结果相同，且相较于现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法不但更为直观准确、简便易行，并且还可以对胶原微观结构进行分析，同时，也避免了现有胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法的复杂实验操作流程对实验结果的影响

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。