一种亲水性表面等离子体共振传感芯片的制备方法与流程

本发明涉及一种亲水性表面等离子体共振传感芯片的制备方法，属于表面等离子体传感共振(surfaceplasmonresonance，简称spr)器芯片制备领域。

背景技术：

spr是一种光物理现象，它对附着在金属表面的介质的折射率十分敏感，当样品和金属表面接触时，即发生物理或化学变化时，必然会引起折射率发生相应的变化。由此，可推测出待测样品的物理或化学的吸附性质。spr技术具有高灵敏度、无需标记、可实时快速检测等优势。spr共振仪的核心部分就是传感芯片，由于传感芯片中金属膜层不具有选择性，因此，需要在金属膜层上修饰目标分子识别膜层，以达到对目标分子的检测。

分子印迹技术是一种基于仿生科学和模拟自然界中抗原与抗体识别作用的基础上发展起来的分析方法，采取化学聚合方式来制备在空间上与目标物质能特异性结合的识别位点或者识别空穴的聚合物，即分子印迹聚合物(molecularimprintedpolymer，mip)，对特定物质进行识别与检测将mip和spr技术相结合，发挥两种的优势，以实现对目标分子实时、快速、特异性的检测。

然而，在水环境中检测低浓度目标分子时，仍然存在很多问题，例如为了防止水分子对mip中的识别位点和模板分子的作用，加大交联剂的用量。但是，交联剂含量的增多会影响目标分子的传质效率，增加实验的时间成本；加入大量的亲水性单体，分子印迹膜的水相兼容性好，但会引起非特异性吸附，影响检测效果。此外，采用双层印记膜结构，外层采用较高浓度的交联剂，对内层起到保护作用，也可实施对水相中生物小分子的检测，但是其在接近人体环境ph＝7.4下响应效果不好。

技术实现要素：

本发明的目的为了解决现有技术存在制备分子印迹膜过程中加入交联剂和亲水性单体量过多，且在接近人体ph环境下响应效果不好的问题，提供一种亲水性表面等离子体共振传感芯片的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种亲水性表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、将金膜长到光学玻璃片的上表面；得到a；

步骤二、将步骤一得到的a浸泡在烷基硫醇溶液中自组装后得到单分子层；

步骤三、将步骤二得到的单分子层与溶液b接触，现场紫外光照反应后得到分子印迹膜的内层分子印迹膜；

所述的溶液b为：将混合单体和模板分子加入到致孔剂中，当预聚合反应结束后，加入交联剂和引发剂；

步骤四、将步骤三得到的内层分子印迹膜与溶液c接触，现场紫外光照反应后得到分子印迹膜的外层分子印迹膜；

所述的溶液c为：将单体和模板分子加入到致孔剂中，当预聚合反应结束后，加入交联剂和引发剂；

步骤五、配制洗脱液，对所成的双层印迹膜进行洗脱，除去模板分子，在双层分子印迹膜中留下可对模板分子识别的作用位点；

溶液b中所述的模板分子为雌二醇、睾酮素、雌酮、黄体酮等激素类分子，且在致孔剂中的浓度为0.01-0.1mol/l；

所述混合单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺中的任意二种，且其中一种单体占总单体浓度的0-50％，且混合单体总体与雌二醇摩尔比为3:1-6:1；

所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、n,n-二甲基丙烯酰胺、n,n-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种；交联剂与雌二醇的摩尔比为12:1-15:1；

所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种；

所述引发剂为二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮或米蚩酮中的一种，且引发剂在致孔剂中的浓度为0.005～0.025g/ml。

溶液c中所述的模板分子为雌二醇、睾酮素、雌酮、黄体酮等激素类分子，且在致孔剂中的浓度为0.01-0.1mol/l；

所述的单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺中的一种；单体与雌二醇摩尔比为3:1-6:1；

所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、n,n-二甲基丙烯酰胺、n,n-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种；交联剂与雌二醇的摩尔比为18:-25:1；

所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种；

所述的引发剂为二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮或米蚩酮中的一种，引发剂在致孔剂中的浓度为0.005～0.025g/ml。

步骤二中所述的烷基硫醇溶液中溶质烷基硫醇的浓度为1～100mmol/l，溶剂为乙醇、甲醇或氯仿中的一种；

步骤五中所述的洗脱液由磷酸缓冲液和乙酸混合，其体积比为7:3-9:1。

本发明的工作原理为：首先在金膜表面自组装单分子层，然后加入含有引发剂的预聚合溶液。当引发剂受热分解时，形成表面自由基，从而是聚合物在表面进行接枝反应，引发聚合。该体系的优点是:可现场原位控制形成的聚合物膜厚度，形成的印迹膜结构均匀，且与金膜表面结合牢固，在水相中可以稳定存在。

有益效果

本专利制备spr芯片的方法具有以下优点：

1、采用现场紫外光聚合方式，方便、快速，可现场原位控制分子印迹膜厚度；

2、采用分子印迹技术，操作步骤简单，对试验条件要求不是很苛刻；

3、通过向内层分子印迹膜中加入亲水性单体，制备的双层印迹膜具有很好的亲水性能；

4、制备的分子印迹膜，不仅实现在磷酸缓冲液ph＝7.4接近人体ph值的环境下对低浓度模板分子进行检测，同时可在实际水体中检测较低浓度的模板分子。

附图说明

图1为反应池示意图；

图2为表面等离子体共振仪芯片结构示意图；

图3为具体实施例1中双层雌二醇分子印迹膜成膜spr共振角度图；

图4为具体实施例1中裸金、自组装金膜、成膜芯片接触角图；

图5为具体实施例1中磷酸缓冲液中(ph＝7.4)吸附样品spr动力学曲线图；

图6为具体实施例1中实际水体中吸附样品spr动力学曲线图；

图7为具体实施例2中磷酸缓冲液中(ph＝7.4)吸附样品spr动力学曲线图。

其中，1—光学玻璃片；2—金膜；3—单分子层；4—分子印迹膜。

具体实施内容

下面结合附图和实施例对本发明的内容进一步说明。

实施例1

一种亲水性表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤如下：

1)采用高真空蒸镀的方法在光学玻璃片1上蒸镀一层金属膜；具体蒸镀方法为：将洁净的玻璃基片1在真空度≥1×10^-5pa条件下进行真空蒸镀金，所镀金膜厚度为50nm；此时得到芯片为2层芯片；其中，所述光学玻璃片1为2.5cm×3.0cmlasfn9玻璃；

2)采用自组装方法，将1)中新鲜蒸镀的2层芯片立即浸入到含有1mm的十二烷基硫醇的乙醇自组装溶液中，24小时后，该玻璃片上的金膜2上自组装一层单分子层3，将其用乙醇冲洗3遍，氮气吹干后备用，得到3层芯片；其中，十二烷基硫醇化学式为：shch2(ch2)10ch3；

3)内层分子印迹膜的制备：将模板分子雌二醇0.0136g溶于2ml乙腈混合溶液中，超声至完全溶解；加入功能单体甲基丙烯酸12.5μl和甲基丙烯酸羟乙酯6μl于上述溶液，超声至全部溶解，静止3h；再加入142μl乙二醇二甲基丙烯酸酯和二苯甲酮0.040g，超声混合5min，然后通氮气10min，得到预聚合反应溶液；

4)将预聚合液通入到自制的反应池中，如图1所示。在紫外光照下引发反应，达到目标共振角度停止反应，用乙腈冲洗芯片表面，之后通入第二层预聚合液；

5)外层印迹膜制备方法参照步骤3)和步骤4)，只是加入功能单体为甲基丙烯酸17μl，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯170ul，引发剂二苯甲酮0.030g；反应停止后，用乙腈冲洗芯片表面，得到4层芯片，如图2所示。扫描成膜spr角度曲线，得到双层雌二醇分子印迹膜成膜角度图；如图3所示。

6)采用磷酸缓冲液(ph＝7.4)和乙酸体积比为9：1的洗脱液对带有分子印迹膜的4层芯片进行洗脱，除去分子印迹膜中的模板分子，得到本案例实施例1所述的一种亲水性检测雌二醇分子的印迹膜传感器芯片；

7)对所形成的印迹膜和裸金以及自组装金膜进行接触角表征，如图4所示。由接触角数据可知，合成的印迹膜具有很好的亲水性；

8)用制备所得的传感器芯片检测雌二醇的磷酸缓冲溶液(ph＝7.4)，溶液浓度为2.5×10^-16～2.5×10^-6m，每个样品吸附时间为20min，所得到的连续吸附动力学曲线如图5所示。由图5可得，当含有目标分子的水溶液通过芯片表面时，反射率值逐渐增加，这是由于印迹膜中的印迹孔穴同目标分子雌二醇相互作用引起的；

9)用制备所得的传感器芯片检测雌二醇的自来水溶液，溶液浓度为2.5×10^-16～2.5×10^-7m，吸附动力学曲线如图6所示，实验结果表明本发明所制得的分子印迹传感器芯片能够对实际水体中低浓度的雌二醇样品有响应，且响应迅速。

实施例2

一种亲水性表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤如下：

1)与实施例1中1)相同；

2)与实施例1中2)相同；；

3)与实施例1中3)基本相同，区别在于：加入功能单体甲基丙烯酸15μl和甲基丙烯酸羟乙酯3μl；

4)与实施例1中4)相同；

5)与实施例1中5)相同；

6)与实施例1中6)相同；

7)用制备所得的传感器芯片检测雌二醇的磷酸缓冲溶液(ph＝7.4)，溶液浓度为2.5×10^-6m，样品吸附时间为20min，所得到的吸附spr动力学曲线如图7所示。由图7可得，当含有目标分子的磷酸缓冲溶液(ph＝7.4)通过芯片表面时，制得的分子印迹传感器芯片能够对雌二醇样品有响应，且响应迅速。

本发明提供一种基于分子印迹技术的表面等离子体共振仪芯片，包括：光学玻璃片1和其上的金膜2，单分子层3是通过在所述的金膜层上以自组装的方法引入单分子层3，以及和单分子层结合的功能化的分子印迹膜层4。

以上所述的具体描述，对发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。