一对用于细胞表面神经节苷脂定量筛查的浮力微球探针及其制备方法与流程

本发明涉及一对用于细胞表面神经节苷脂定量筛查的浮力微球探针及其制备方法。

二、

背景技术：

神经节苷脂是一种包含一个或多个唾液酸末端寡糖链的鞘糖脂。它们通过神经酰胺部分的烷烃链嵌在细胞膜上，调节细胞结构，细胞粘附和信号传导，同时作为微生物毒素、细菌和病毒的受体位点。细胞表面的神经节苷脂通过对应的高特异性的酶以增加或减少糖单元的方式不断地被合成和降解。其异常的糖基化生物通路与一些疾病相关，如遗传性疾病和癌症的恶性转化。不同亚类的神经节苷脂的异常过表达还与肿瘤的类型和进程密切相关。因此，筛查细胞表面的神经节苷脂对揭示其相关的生物过程和潜在的肿瘤进程具有重要的意义。

为了实现对细胞表面神经节苷脂的定量检测，该专利制备了一对功能化的浮力微球探针，实现了对细胞表面神经节苷脂的非破坏性定量筛查。

三、

技术实现要素：

本发明的目的是：基于硼酸介导的共价识别细胞表面唾液酸和十八烷基分子介导的疏水作用，分别设计了包含核酸切割酶位点和硼酸末端的提取探针和包含十八烷基分子的收集探针。利用提取探针非破坏性地提取细胞表面含唾液酸的生物分子，并通过核酸切割酶将提取物释放到溶液中。再利用收集探针收集释放物中的脂类物质，即神经节苷脂，通过神经节苷脂上结合的核酸片段进行杂交链反应，获得可供定量的荧光信号。以mcf-7乳腺癌细胞系为模型，制备的探针实现了对细胞表面神经节苷脂的定量。

本发明提出的可对细胞表面神经节苷脂定量筛查的浮力微球探针如图1所示。以羟基化的二氧化硅浮力微球为载体，在其表面逐步进行氨基硅烷化，组装琥珀酰亚胺和马来酰亚胺双修饰聚乙二醇连接体，在进一步修饰具有氨基苯硼酸末端和核酸内切酶位点的功能dna分子，得到提取探针；直接对羟基化的二氧化硅浮力微球进行十八烷硅烷化，得到收集探针。

本发明通过以下技术方案来实现：

1)含有核酸内切酶位点的dna分子由dna1和dna2杂交形成。dna1的5’端修饰有羧基，用于共价偶联氨基苯硼酸；3’端修饰有巯基，用于共价连接到浮力微球上的马来酰胺基团。

2)提取探针以羟基化的浮力微球为载体，先进行氨基硅烷化，再共价修饰马来酰胺基团，最后共价组装上含有核酸内切酶位点的dna分子；收集探针通过直接对羟基化的浮力微球进行十八烷硅烷化获得，如图1所示。

本发明的工作原理：

本发明的工作原理如图2所示：首先将提取探针与细胞在垂直旋转仪上孵育，并间歇性离心。循环若干次后在离心作用下通过浮力将提取探针与细胞分离。然后将提取探针与核酸内切酶孵育，将被提取的含唾液酸基团的生物分子酶切，连同结合的核酸碎片释放到溶液中。通过浮力去除提取探针后，向释放物溶液中加入收集探针。在垂直旋转仪上孵育一段时间后，通过浮力分离收集探针；向收集探针分散液中加入杂交链反应的引发dna和一对发夹dna，进行杂交链反应，获得荧光信号。利用标准的神经节苷脂溶液获得标准曲线，对细胞表面神经节苷脂进行定量检测。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

本发明使用的浮力微球与细胞尺寸接近，具有快速浮力分离能力和易于修饰的特点。制备的提取探针可以高效快速地与细胞进行作用和分离，实现对细胞表面神经节苷脂非破坏性的提取。制备的收集探针可通过疏水作用对释放的神经节苷脂进行特异性收集，并进一步利用杂交链反应获得灵敏的荧光信号，实现细胞表面神经节苷脂的定量检测。

与已有的神经节苷脂检测方法相比，本发明具备以下优点：

1.本发明所述的浮力微球探针制备方法简便，具有高的特异性提取能力和收集能力。提取过程无需细胞破碎及其它预处理步骤，与已有方法相比更有优势。

2.本发明涉及的dna功能分子在核酸内切酶作用下可以高效释放被捕获的含唾液酸基团的生物分子。结合在神经节苷脂上的核酸碎片可引发杂交链反应，实现信号放大。

四、附图说明

图1.两种浮力微球探针的结构及合成示意图

图2.两种浮力微球探针对细胞表面神经节苷脂检测的原理图

五、具体实施方式

实施例1：结合图1，合成可对细胞表面神经节苷脂定量筛选的浮力微球探针

将分散于杂交缓冲液(te+100mmnacl和10mmmgcl2，ph8.0)的100μldna1(10μm)和100μldna2(10μm)在37℃下混合孵育过夜。得到的杂交产物用10kd的超滤离心管离心分离并分散到磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)中。然后向其中分别加入20μl氨基苯硼酸(apba，500μm)和20μl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc，500μm)，室温下搅拌过夜。得到的功能dna分子(hs-dna1/2-apba)用10kd的超滤离心管离心分离并分散到te缓冲液中备用。

将二氧化硅浮力微球(约2.5×10⁷个)首先用食人鱼酸(30％过氧化氢∶98％硫酸＝1∶3)在垂直旋转搅拌仪上搅拌过夜。得到的羟基化浮力微球在洗涤烘干后再用1ml溶解于甲醇的5％氨基硅烷化试剂搅拌过夜。获得的氨基硅烷化的浮力微球用甲醇和二甲基甲酰胺(dmf)洗涤两次后，分散到含有琥珀酰亚胺和马来酰亚胺双修饰聚乙二醇(nhs-peg-mal，100mm)和n，n-二异丙基乙胺(dipea，150mm)的dmf溶液中，室温下搅拌过夜，然后用dmf和水洗涤两次。最后向得到的修饰有马来酰亚胺基团的浮力微球中加入100μl1μm的hs-dna1/2-apba，室温搅拌过夜后用水洗涤两次即可得到提取探针。

将羟基化的二氧化硅浮力微球(约1.5×10⁶个)加入到含5％十八烷硅烷试剂的甲醇溶液中，室温下搅拌过夜后用甲醇和pbs洗涤两次，即可得到收集探针。

实施例2：结合图2，利用浮力微球探针进行细胞表面神经节苷脂的定量检测

以mcf-7乳腺癌细胞系为基本模型，将mcf-7细胞(50μl，1.2×10⁵ml^-1)与提取探针(50μl，9.6×10⁵ml^-1)在pbs溶液中混合振荡55分钟后再以1000rpm速度离心5分钟。循环4次后离心，利用浮力取出上浮的提取探针，用pbs洗涤两次后加入到100μl包含2％eco47iii的酶切缓冲液中。搅拌孵育15分钟后离心，利用浮力去除上浮的提取探针，向下层溶液中加入10μl收集探针(9×10⁴ml^-1)，室温下搅拌孵育两小时后离心分离并用pbs洗涤两次。将得到的收集有神经节苷脂的收集探针加入到100μl包含有杂交链反应引物(1μm)，杂交链反应发夹h1(10μm)和h2(10μm)的杂交缓冲液中，在37℃下混合孵育4小时。得到的收集探针通过离心分离出，用te洗涤两次，进行荧光成像，获得可供定量的荧光信号。

将不同浓度的神经节苷脂gd1a的标准溶液(50μl，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5nm)分别与提取探针(50μl，9.6×10⁵ml^-1)在pbs溶液中孵育，然后用于上述同样的方法进行酶切、收集和杂交链反应，得到标准曲线，结合细胞实验的荧光信号可以得到胞表面神经节苷脂的定量检测结果。