本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生物标志物组合在小肠神经内分泌肿瘤检测/诊断中的应用。
背景技术：
神经内分泌肿瘤是一类起源于内胚层神经内分泌细胞的异质性肿瘤，其中胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NET)是最常见的病理类型。2010年WHO对神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasms，NENs)的命名和分类做了最新修改，将NENs分为4大类：神经内分泌瘤(neuroendocrine tumor，NET)、神经内分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)，混合性腺神经内分泌癌(mixed adenoneuroendocrine carcinoma，MANEC)及部位特异性和功能性神经内分泌肿瘤。小肠神经内分泌肿瘤(small intestinal neuroendo trine neoplasms，SI-NENs)是一种来源于小肠APUD细胞系的肿瘤，以往认为SI-NENs是一种少见肿瘤，但目前研究显示，小肠肿瘤的发病率上升。SI-NENs是一种惰性肿瘤，且缺乏特异性临床表现，因此，目前仍然很难对SI-NENs进行早期诊断。小肠原发性NENs位于粘膜下层，且直径小，因此，大多数SI-NENs在诊断时己经发生转移或局部淋巴结浸润，从而失去治愈性手术的机会。与消化道其他部位的NENs相比，SI-NENs不仅更容易发生转移，且预后更差。如何提高SI-NENs的早期筛查诊断是目前临床工作中的一个重要问题。
传统的临床穿刺，虽能提前对SI-NENs进行诊断，但操作过程需要局麻或全麻，且损伤部位较大。目前临床广泛应用血浆中的生物标志物嗜铬蛋白A(Chromogranin A，CgA)进行筛查。另外，突触素(synaptophysin，Syn)和NSE(神经元特异性烯醇化酶)也是常用的生物标志物。CgA是表达在神经内分泌细胞分泌囊泡上的可溶、酸性糖蛋白，几乎所有类型的神经内分泌肿瘤均分泌CgA。NENs患者血液CgA水平明显高于健康人，且伴有类癌综合征表现或肝转移患者的血液CgA水平明显高于无类癌综合征症状和无肝转移的患者。但NENs患者血液CgA检测的特异性较差。CgA在正常组织中也表达，在非NENs患者，如小细胞肺癌、前列腺癌及心脏病、炎症性疾病和肾衰竭的情况下表达可升高。另外，血液CgA基础水平在不同人群、进食不同的食物及服用质子泵抑制剂情况下均可不同。故目前尚少单独将CgA作为神经内分泌肿瘤的诊断性筛查指标。Midkine(MK)是一种肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor，HBUF)家族成员之一，是在胚胎发育过程中明显表达的多效生长因子，在健康成年人中表达水平非常低，但在很多种癌症中过度表达。Medkine是可溶性细胞因子，容易在血液循环中测得，故针对Medkine的检查方法为非侵入性检查，对SI-NENs具有一定的诊断价值，但特异度也不高。此外，Ki-67、NKX2.2、Secretagogin(SCGN)、Ma2autoantibodies和olfactory receptor 51E1(OR51E1)等也是常被报道的SI-NENs的诊断标志物。
常见筛查方法中，单个标志物的诊出阳性率和特异性较低；而多个标志物的组合，虽然可以提高特异性，但仍然存在诊断出的阳性率(敏感性)较低，假阳性率高的问题。诊断中敏感性和特异性的平衡较难把握，同时提高该两者有较大难度。现有技术中，单独使用DcR3、TFF3、Midkine和CgA等标志物进行SI-NENs的诊断，其敏感性、特异性较低(Edfeldt K etc.“DcR3,TFF3,and Midkine Are Novel Serum Biomarkers in Small Intestinal Neuroendocrine Tumors”.Neuroendocrinology.2017；105(2):170-181)。因此，急需一种既简便，又灵敏度高、特异性高的血浆/血清生物标志物组合用于筛查SI-NENs。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中单独使用生物标志物诊断SI-NENs敏感性、特异性较低的缺点，提供一种既简便，又灵敏度高、特异性高的血浆生物标志物组合。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种用于检测小肠神经内分泌肿瘤的生物标志物，由CgA和Midkine组成。
优选地，其用于检测血浆样本包括血清样本。
根据本发明，用于检测的血浆样本可以是全血浆样本即狭义所说的血浆样本，也可以是去除了纤维蛋白原的血浆即血清样本。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种试剂盒，其包括检测生物标志物的抗体，所述抗体由CgA的抗体和Midkine的抗体组成。
所述抗体可包括捕获抗体和检测抗体：
在双抗体夹心法中，捕获抗体、检测抗体发挥的作用不同，一般地，先固定第一种抗体，即捕获抗体，其用于捕获待测抗原。将未固定的第一种抗体以及未结合于固定的抗体上(即未被捕获)的抗原洗去后，再将第二种抗体即检测抗体结合到被捕获的抗原上。加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅通常与待检测抗体的量成正比。通常地，检测抗体上带有标记，可以通过检测抗体的存在量来间接定性和定量检测被捕获的抗原。为保证测定的特异性和灵敏度，捕获抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，检测抗体通常为单克隆抗体。但在个别实施例中，为了放大信号，也不排除将单克隆抗体作为捕获抗体，将多克隆抗体作为检测抗体的技术方案。所述标记为本领域常规，可以是生物素标记、荧光素标记，也可以是酶标记、铁蛋白标记或通过胶体金标记等。
优选地，所述CgA的抗体包括CgA捕获抗体和生物素化的CgA检测抗体，所述Midkine的抗体包括Midkine捕获抗体和生物素化Midkine检测抗体。更优选地，所述Midkine捕获抗体为山羊抗人Midkine捕获抗体，所述生物素化Midkine检测抗体为生物素化山羊抗人Midkine检测抗体。
进一步更优选地，所述试剂盒用于检测血浆包括血清样本。优选地，所述试剂盒还包括肝素或者EDTA。
更优选地，所述试剂盒还包括标准品CgA和Midkine。
进一步更优选地，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种试剂盒组合，其由检测CgA的试剂盒与检测Midkine的试剂盒组成。
优选地，所述试剂盒均为ELISA试剂盒，例如现有市场上市售的试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
上述试剂盒或试剂盒组合在制备检测小肠神经内分泌肿瘤的制剂中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
由CgA和Midkine组成的标志物组合在制备小肠神经内分泌肿瘤的血浆包括血清样本生物标志物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
首次提供一种用于筛查SI-NENs的既简便，又灵敏度高、特异性高的血浆/血清生物标志物组合。通过并联试验即CgA和Midkine 2个生物标志物筛查，任一检测结果为阳性即为并联诊断结果阳性，灵敏度可达89.47％；通过串联试验即2个生物标志物筛查，所有检测结果均为阳性即为串联诊断结果阳性，特异性可达82.14％；而且约登指数较高(53.76％)，一致率也较高(77.66％)。
具体实施方式
以下概括了实验方法，例如实验者纳入标准、NENs的临床表现、镜检及免疫组化法、ELISA检测样品准备及检测等实验方法。
A.实验者纳入标准：(1)结合临床症状、影像学资料、手术组织病理学及免疫组化确诊为SI-NENs患者；(2)健康自愿者；且(3)签署知情同意书者。排除标准：(1)不符合以上纳入标准；(2)伴随其他组织器官恶性肿瘤的患者。
B.NENs的临床表现：根据NENs是否出现与激素分泌相关的症状，可将NENs分为功能性肿瘤和无功能性肿瘤。小肠NENs可分为小肠胃泌素瘤、生长抑素瘤和无功能性肿瘤。90％的小肠NENs是无特异症状的，小肠NENs常因患者出现上腹部隐痛(37％)、上消化道出血(21％)、贫血(21％)、黄疽(18％)等症状行胃镜检查时发现。另外，(10.3)％的十二指肠NENs会合并卓艾综合征。
C.镜检：所有标本均经4％中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4mm厚连续切片，常规HE染色。由大小一致的圆形或卵圆形细胞排列而成，呈巢状、腺管状或菊花团样，细胞分化好，核分裂象少。小典型类癌细胞中等分化，核大质少，少数表现异型性，核分裂象稍多。神经内分泌癌细胞分化差，核大，异型性明显，核分裂象多见。
D.免疫组化法：采用Envision免疫组化法，将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片(4微米)脱蜡和复水。再浸泡在10mM的枸橼酸盐缓冲液中(pH 6.0)，并微波炉100℃10分钟。通过在0.5％过氧化氢溶液室温下孵育10分钟阻断切片内源性过氧化物酶活性。然后由5％的胎牛血清封闭后，4℃孵育抗体过夜。加二抗HRP(BioGenex，San Ramon，CA)孵育，再加DAB(BioGenex)显色。切片用苏木精复染。阴性对照组用5％胎牛血清替代一抗。在所有标记物中，1％的肿瘤细胞被认为是阳性的。对标志物进行定性诊断，即+/-。
指标包括:①神经内分泌肿瘤标记物：嗜铬类素A(Chromogranin A,CgA)和突触素(Synaptophysin,Syn)用来定性诊断；②增值活性标记物：依据核分裂像数和Ki-67分为3级：G1、G2和G3，其中增值活性主要以核分裂象数和(或)Ki-67阳性指数为指标。NET为高分化神经内分泌肿瘤，多为低度或中度恶性，表现为G1和G2；NEC为低分化神经内分泌癌，多为高度恶性，表现为G3；见表1。
表1 2010年WHO胃肠胰神经内分泌肿瘤分级标准
表2免疫组化标记抗体基本信息
E.ELISA检测样品准备
细胞上清样品离心取上清即可(约100-500g，5分钟)。对于血浆样品，采集的全血使用肝素或者EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，制备好的血浆需置于冰上待用。不能及时检测的待测样品，样品制备后分装，冻存于-20℃或-80℃。对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，制备好的血清需置于冰上待用。
F.样品检测
利用上述步骤E处理的样品，采用全自动酶标仪VER-SAmax(美国)，按照CgA(DY9098-05，美国R&D system)、DcR3(DY142，美国R&D system)、TFF3(DTFF30，美国R&D system)和Midkine(DY258，美国R&D system)ELISA试剂盒说明书操作，简述如下：
检测前，各试剂盒(各试剂盒反应孔中均已固定有各生物标志物的捕获抗体，其中Midkine捕获抗体为山羊抗人Midkine捕获抗体)从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟。配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20×)用双蒸水或去离子水稀释至1×，例如10ml洗涤液(20×)加190ml水混匀后即为1×的洗涤液。按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到250pg/ml。每个浓度的标准品检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl。取洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液，进行标准品的倍比稀释，最终得到250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125pg/ml共六个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共七个标准品浓度。
分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血浆样品，加入50μl样品分析缓冲液后加50μl样品；如稀释比例大，将样品与样品分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100μl。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入各生物标志物的检测抗体(100μl/孔，用封板膜封住反应孔，室温孵育60分钟。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)100μl/孔。用封板膜封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜封住反应孔，室温避光孵育20分钟。加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。在450nm波长下进行吸光度的测定，依据标准品读数，绘制标准曲线。将待测样品数据代入标准方程，计算得出结果。
CgA的正常值上限为19U/L，Midkine的正常值上限330ng/L。DcR3的正常值上限是122.22pg/ml和TFF3的正常值上限是28.10ng/ml。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1血浆CgA试验与病理诊断结果的比较
病理学结果为阳性共38例，阴性56例。单用血浆CgA诊断，阴性结果的有49例，其中真阴性的有40例，假阴性的有9例，阳性结果有45例，其中真阳性有29例，假阳性有16例。见表3。
表3血浆CgA试验与病理诊断结果的比较
实施例2血浆Midkine试验与病理诊断结果的比较
单用血浆Midkine诊断，阴性结果的有42例，其中真阴性的有34例，假阴性的有8例，阳性结果有52例，其中真阳性有30例，假阳性有22例。见表4。
表4血浆Midkine试验与病理金标准诊断结果的比较
实施例3血浆DcR3试验与病理诊断结果的比较
单用血浆DcR3诊断，阴性结果的有45例，其中真阴性的有31例，假阴性的有14例，阳性结果有49例，其中真阳性有24例，假阳性有25例。见表5。
表5血浆DcR3试验与病理金标准诊断结果的比较
实施例4血浆TFF3试验与病理诊断结果的比较
单用血浆TFF3诊断，阴性结果的有50例，其中真阴性的有33例，假阴性的有17例，阳性结果有44例，其中真阳性有21例，假阳性有23例。见表6。
表6血浆TFF3试验与病理金标准诊断结果的比较
下述效果实施例中的并联试验(并联诊断)是指：上述2个或2个以上生物标志物筛查，任一检测结果为阳性即为并联诊断结果阳性。
串联试验(串联诊断)是指：上述2个或2个以上生物标志物筛查，所有检测结果均为阳性即为串联诊断结果阳性。
效果实施例1血浆DcR3、TFF3、CgA和Midkine的并联试验与病理诊断结果的比较
经血浆并联试验诊断，阴性结果的有38例，其中真阴性的有34例，假阴性的有4例，阳性结果有56例，其中真阳性有34例，假阳性有22例。见表7。
表7 DcR3、TFF3、CgA和Midkine并联试验与金标准诊断结果的比较
效果实施例2血浆DcR3、TFF3、CgA和Midkine的串联试验与病理诊断结果的比较
经血浆串联试验诊断，阴性结果的有59例，其中真阴性的有47例，假阴性的有12例，阳性结果有35例，其中真阳性有26例，假阳性有9例。见表8。
表8 DcR3、TFF3、CgA和Midkine串联试验与金标准诊断结果的比较
效果实施例3单个生物标志物检测的诊断价值比较
4种检测方法中CgA和Midkine试验的敏感度和约登指数较高，使用CgA和Midkine试验的特异度和一致率也较高。见表9。
表9上述4种指标4种检测方法的诊断价值比较
效果实施例4血浆CgA和Midkine的并联试验与病理诊断结果的比较
经血浆并联试验诊断，阴性结果的有39例，其中真阴性的有35例，假阴性的有4例，阳性结果有55例，其中真阳性有34例，假阳性有21例。见表10。
表10 CgA和Midkine的并联试验与病理金标准诊断结果的比较
效果实施例5血浆CgA和Midkine的串联试验与病理诊断结果的比较
经血浆串联试验诊断，阴性结果的有57例，其中真阴性的有46例，假阴性的有11例，阳性结果有37例，其中真阳性有27例，假阳性有10例。见表11。
表11 CgA和Midkine的串联试验与病理金标准诊断结果的比较