本发明涉及三种饮料的色素快速筛查方法领域，特别是涉及饮料专利蓝v的表面增强拉曼光谱快速筛查方法，属于食品着色剂快速检测
技术领域：
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背景技术：
：：食品添加剂大多是化学合成产物，我国对食品着色剂使用范围和最大允许添加量都有相关规定，过量食入会对人体健康造成不良影响。一些不法商家为追求短期暴利，有的生产商用廉价的化工原料充当色素添加至食品中，或者在食品中超剂量使用，这些不法行为均严重违反我国市场准入制度。近年来，违法滥用或超剂量使用着色剂的食品安全事件频频发生，例如，“苏丹红鸭蛋”、“染色蛋糕”、“染色馒头”、“墨汁粉条”、“染色紫菜”等；每次重大食品安全事故的发生，都给国家和广大消费民众带来不可挽回的损伤。我国食品着色剂的常用检测方法前处理过程复杂，操作繁琐，耗时，设备昂贵且维修成本高，有机溶剂损耗大，不利于环境保护等缺点，故有必要建立简单、无损、快速分析食品中诱惑红、专利蓝v和糖精钠等食品添加剂的方法。表面增强拉曼光谱是一种分析分子振动模型和结构信息的技术，随着增强基底的深入研究和研究领域的不断突破，越来越多的研究转移到食品安全检测领域。（surface-enhancedramanspectroscopy,sers）作为一种新型的光谱技术，具有无需前处理、样品用量少、携带方便、灵敏度高、操作简单、实时、快速检测等优点，在食品着色剂检测领域普遍推广应用，并取得了一定的研究进展。如申请号：cn201610873996.6、名称为“一种快速同时检测饮料中非法添加十种色素的方法”的专利申请，采用将待测物滴至薄层板，通过乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、氨水和水作为展开剂，展开后挥发干，在样品谱带上滴一定量银溶胶之后，用于便携式拉曼光谱仪定性检测。申请号：cn201611125152.x、名称“高灵敏度食品着色剂检测方法”。采用抗坏血酸还原硝酸银，聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，制备银纳米增强基底，应用于胭脂红标液的检测，其最低检测浓度达到10-7mol/l。申请号：cn201610255358.8、名称“一种青色素类染料纳米金sers探针及其制备方法”的专利申请，该专利公开了制备不同百分比浓度的带负电荷的覆盖剂的及纳米粒子增强基底，并与带正电荷的青色素类染料组合成青色素类染料纳米金sers探针，达到提高待测物灵敏度的目的。一些研究者运用表面增强拉曼光谱技术检测饮料中违禁色素。如陈爽（光谱学与光谱分析，2016年第36卷第6期，p1749-1754）利用自组装表面增强基底对美年达饮料中罗丹明b、柯衣定和日落黄进行半定量品质。而目前未见到对实验条件优化，并对不同饮料中违禁色素表面增强拉曼光谱技术快速检测的相关报道。饮料中的着色剂属于痕量物质，尤其是违禁色素，其拉曼信号微弱。当存在拉曼信号干扰物时，需要除去干扰物使待测物的拉曼信号增强。上述公开的方法通过sers技术能达到对食品中着色剂快速检测和筛查的目的，但未对不同的分析对象中同一待测物进行分析和检测，对于饮料中着色剂的拉曼检测条件及其灵敏度均有待于进一步改善。技术实现要素：本发明的目的是为了提高饮料中着色剂检测方法的灵敏度，为饮料中色素快速检测箱提供一种表面增强拉曼光谱检测思路，以提高食品中着色剂快速检测方法的灵敏度和检测效率。为达到上述目的，本发明茶叶中农药残留的表面增强拉曼光谱快速检测方法，按照下述步骤进行：（1）金纳米增强基底的制备；（2）筛选电解质：对影响待测物拉曼信号的电解质进行比较，取拉曼信号增强较大的无机盐为实验条件；（3）制作拉曼谱峰标准线：利用步骤（1）所制备的基底，着色剂标准溶液及其步骤（2）中电解质按体积比为10:1:2混合均匀，用于sers检测，其检测所得拉曼谱峰与高斯模拟理论峰进行对比，并对其谱峰进行归属；（4）除去饮料中的酒精、二氧化碳等易挥发成分；（5）以市售不含待测物的三种饮料为空白样品，由步骤（4）除去易挥发物质提取，分别配制以空白饮料基质的梯度浓度的着色剂溶液。取50μl的上述待测液、步骤（1）制备的500μl金溶胶基底和100μl步骤（2）所得电解质溶液，三者混合均匀后，用于拉曼光谱检测；（6）将步骤（5）所得的待测液的sers谱图与步骤（3）中待测物标准溶液sers和其理论计算谱图的拉曼谱峰进行对比，便可确定待测试样中是否含有该种色素，即可完成待测饮料中是否含有该种色素的定性判别；（7）将步骤（6）所测得的三种待测饮料的sers谱图与步骤（3）所归属的色素拉曼谱峰进行比较，选择拉曼峰强度较高且峰型好的着色剂特征峰用于饮料中着色剂的定量分析。以待测物浓度为横坐标，特征峰的峰强度为纵坐标绘制标准曲线，此标准曲线用于饮料试样中色素的半定量分析。其中步骤（1）金纳米增强基底的制备，采用柠檬酸三钠加热还原法制备得到，按照下述步骤进行：为了提高基底的增强效果，以下同时制备了三种金胶基底。（1）把三口瓶放于智能恒温磁力搅拌器中，向三口瓶加入100ml氯金酸溶液（1%），加热至沸腾（边加热边搅拌），快速加入3.8ml柠檬酸三钠溶液，保持搅拌继续加热15min；（2）向三口瓶加入100ml氯金酸溶液（0.01%），加热至沸腾（边加热边搅拌），快速加入0.75ml柠檬酸三钠溶液，保持搅拌继续加热5min；（3）向三口瓶加入5mlip6与100ml氯金酸溶液（0.01%），加热至沸腾（边加热边搅拌），快速加入1ml柠檬酸三钠溶液，保持搅拌继续加热5min，三种方法所得金溶胶静置冷却、低温保存。其中步骤（2）着色剂的表面增强拉曼散射条件优化：取步骤（1）制备的表面增强基底500μl，加标浓度为11.94mg/kg饮料50μl，电解质氯化钠和氯化镁分别取100μl，放于2ml石英瓶中，混合均匀，进行拉曼光谱检测，选取增强效果较好的无机盐作为实验条件。其中步骤（3）制成一定浓度的标准液50μl、步骤（1）制备的500μl增强基底溶液和100μl电解质溶液（1%）混合均匀后，用于拉曼光谱检测。通过gaussian03w软件优化计算出该色素的理论拉曼峰，并通过gaussview查看计算结果。依据相关文献和书籍，对比理论计算和实验拉曼谱峰，分析两者其存在差异的原因。并对色素分子的各特征振动频率进行官能团的谱峰归属和解析，得到着色剂分子的特征谱峰，这些特征谱峰作为各种饮料中该着色剂的定性定量判别依据。其中步骤（4）中对含有酒精或者二氧化碳等易挥发物质的饮料，采用微波处理2分钟后，称其所减少的质量，并折算至最终待测物含量计算中。本发明采用上述技术方案后得到如下技术效果：1、饮料品种分多类，本试验选取具有代表性的三种饮料：运动饮料、果汁饮料和rio鸡尾酒调和饮料。其中有的含有酒精和二氧化碳等易挥发物质，这些物质对拉曼信号收集有影响。另外饮料中的易挥发物质量虽小，但其在检测过程中的不稳定性影响待测物定量分析。本发明采用微波处理饮料，除去干扰物；再通过对增强基底和无机盐的优化，以提高多种饮料中着色剂表面增强拉曼光谱检测的灵敏度，达到饮料中着色剂快速检测的目的；2、采用本发明公开的饮料中着色剂的表面增强拉曼光谱快速检测方法，其样品前处理简单、快速，单个样品检测只需10分钟左右，能快速准确地定性定量分析饮料试样中的着色剂，可用于现场大规模样品的快速筛查和检测。附图说明以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。图1是专利蓝v理论计算拉曼光谱图；图2是专利蓝v标液表面增强拉曼谱图；图3是不同电解质影响饮料中专利蓝v的拉曼信号对比图；图4是不同浓度的佳得乐运动饮料加标液表面增强拉曼3d谱图；图5是不同浓度的复合果汁饮料加标液表面增强拉曼二阶导谱图；图6是不同浓度的rio鸡尾酒调和饮料加标液表面增强拉曼多层谱图；图7是建立的佳得乐运动饮料中专利蓝v定量分析标准曲线图，图中横坐标为专利蓝v的加标浓度，纵坐标为1180cm-1处的峰强度；图8是建立的复合果汁饮料中专利蓝v定量分析标准曲线图，图中横坐标为专利蓝v的加标浓度，纵坐标为1180cm-1处的峰强度；图9是建立的rio鸡尾酒调和饮料中专利蓝v定量分析标准曲线图，图中横坐标为转脸蓝v的加标浓度，纵坐标为1182cm-1处的峰强度。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。实施例1：佳得乐运动饮料中专利蓝v的表面增强拉曼光谱快速检测（1）制备金纳米增强基底：金纳米增强基底的制备采用柠檬酸三钠加热还原法制备。把三口瓶放于智能恒温磁力搅拌器中，向三口瓶加入一定量一定浓度的氯金酸溶液，大火快速加热至沸腾（边加热边搅拌），快速加入一定量ip6作为保护剂，并加入1ml柠檬酸三钠溶液，此时溶液有深红色变为酒红色，并继续保持搅拌继续加热15min；室温冷却后，避光保存；使用时，可对金溶胶进行适当提纯处理。（2）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。称取一定量的专利蓝v标准品，放于100ml的容量瓶中，用超纯水定容到刻度，制成浓度为100mg/l的标准品母液，将母液逐步稀释成一定梯度的标准溶液。取一定浓度的稀释液进行步骤（1）制备的500μl金溶胶增强基底溶液和步骤（2）中无机盐溶液100μl（1%），三者混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到专利蓝v标准溶液的表面增强拉曼光谱，如图2所示。图中400、426、572、776、856、890、912、938、1156、1182、1210、1276、1336、1430、1492和1608cm-1这16个谱峰信号较强，对这些谱峰进行归属如下表1：table1theoreticalandexperimentalramanspectraofpatentbluevanditsassignmentsw=weak,m=medium,s=strong,vs=verystrong,υ=stretching,δ=bending,ρ=rocking（3）将待测的佳得乐运动饮料微波处理2min后，称取2ml浓度为0.5mg/ml的专利蓝v的标液，加入一定量的佳得乐运动饮料，制备大约100mg/kg的加标液，依次类推制备出0、0.997、1.995、3、3.9913、5.99、8.479、9.874和11.1mg/kg不同浓度的加标液。备用。（4）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。取500μl一定浓度的饮料加标液，步骤（1）制备的500μl金纳米溶液和浓度为1%的100μl步骤（2）中两种无机盐溶液100μl（1%），分别混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到待测饮料的表面增强拉曼谱图，如图3所示，对比图3中1156、1182、1210、1278四个特征峰的强度可知添加氯化镁的溶液拉曼信号较好。（5）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。步骤（3）的各浓度溶液分别取50μl、取步骤（1）制备的500μl金纳米溶液和浓度为1%的100μl步骤（2）中无机盐溶液100μl，分别混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到待测运动饮料的表面增强拉曼3d谱图，如图4所示。对比图4专利蓝v加标溶液的表面增强拉曼谱图和图2专利蓝v标准溶液的表面增强拉曼谱图，可看出待测试样的表面增强拉曼光谱中存在1156和1180cm-1处专利蓝v的拉曼特征峰，这2个特征峰可作为佳得乐运动饮料中专利蓝v的定性判别依据。由图4可知，1180cm-1处的峰强度在不同浓度时的特征峰强度随佳得乐饮料中加标的专利蓝v浓度减少而降低，选用该特征峰强度制定标准曲线，标准曲线如图7所示，特征峰1180cm-1处的峰强度与佳得乐加标专利蓝v浓度具有良好的线性关系，在浓度范围为0.997～11.1mg/kg内，线性方程为y=0.1286x+1.0158，相关系数r2=0.996，可用于佳得乐运动饮料中专利蓝v的定量分析。向佳得乐空白样品中加入一定量的专利蓝v标液，制备低、中、高三个不同浓度的加标液，按实施例1（5）进行操作，每个样品重复测定3次，同时测定加标回收率与相对标准偏差，结果见表2。加标平均回收率为95.97~103.6%，相对标准偏差在3.12～4.4%之间，说明本发明公开的方法具有较高的准确度和精密度。表2佳得乐饮料准确度与精密度分析报告实施例2：复合果汁饮料中专利蓝v的表面增强拉曼光谱快速检测（1）制备金纳米增强基底：金纳米增强基底的制备采用柠檬酸三钠加热还原法制备。把三口瓶放于智能恒温磁力搅拌器中，向三口瓶加入一定量一定浓度的氯金酸溶液，大火快速加热至沸腾（边加热边搅拌），快速加入一定量ip6作为保护剂，并加入1ml柠檬酸三钠溶液，此时溶液有深红色变为酒红色，并继续保持搅拌继续加热15min；室温冷却后，避光保存；使用时，可对金溶胶进行适当提纯处理。（2）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。称取一定量的专利蓝v标准品，放于100ml的容量瓶中，用超纯水定容到刻度，制成浓度为100mg/l的标准品母液，将母液逐步稀释成一定梯度的标准溶液。取一定浓度的稀释液进行步骤（1）制备的500μl金溶胶增强基底溶液和步骤（2）中无机盐溶液100μl（1%），三者混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到专利蓝v标准溶液的表面增强拉曼光谱，如图2所示。图中400、426、572、776、856、890、912、938、1156、1182、1210、1276、1336、1430、1492和1608cm-1这16个谱峰信号较强，对这些谱峰进行归属如下表1：table1theoreticalandexperimentalramanspectraofpatentbluevanditsassignmentsw=weak,m=medium,s=strong,vs=verystrong,υ=stretching,δ=bending,ρ=rocking（3）称取2ml浓度为0.5mg/ml的专利蓝v的标液，加入一定量的复合果汁饮料，制备大约100mg/kg的加标液，依次类推制备出11.94、10.0、8.95、7.96、5.98、4.99、3.96、2.99、0.99、0mg/kg不同浓度的加标液。备用。（4）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。取500μl一定浓度的饮料加标液，步骤（1）制备的500μl金纳米溶液和浓度为1%的100μl步骤（2）中两种无机盐溶液100μl（1%），分别混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到待测饮料的表面增强拉曼谱图，如图3所示，对比图3中1156、1182、1210、1278四个特征峰的强度可知添加氯化镁的溶液拉曼信号较好。（5）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。例2（3）的各浓度溶液分别取50μl、取步骤（1）制备的500μl金纳米溶液和浓度为1%的100μl步骤（2）中无机盐溶液100μl，分别混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到待测饮料的表面增强拉曼二阶导谱图，如图5所示。对比图5专利蓝v加标溶液的表面增强拉曼谱图和图2专利蓝v标准溶液的表面增强拉曼谱图，可看出待测试样的表面增强拉曼光谱中存在1156和1180cm-1处专利蓝v的拉曼特征峰（此图未显示1156cm-1特征峰），这2个特征峰可作为复合果汁饮料中专利蓝v的定性判别依据。由图5可知，二阶导图谱位于下方的部分为凸型图，且某特征峰强度的二阶导数值越小说明其强度越高，从另一方面反映1180cm-1处的峰强度在不同浓度时的特征峰强度随复合果汁饮料中加标的专利蓝v浓度减少而降低，选用该特征峰强度制定标准曲线，标准曲线如图8所示，特征峰1180cm-1处的峰强度与复合果汁饮料中专利蓝v浓度具有良好的线性关系，在浓度范围为0.99～11.94mg/kg内，线性方程为y=0.0827x+1.4132，相关系数r2=0.9926，可用于复合果汁饮料中专利蓝v的定量分析。向复合果汁饮料空白样品中加入一定量的专利蓝v标液，制备低、中、高三个不同浓度的加标液，按实施例2（5）进行操作，每个样品重复测定3次，同时测定加标回收率与相对标准偏差，结果见表3。加标平均回收率为95.72~104.51%，相对标准偏差在4.10～5.2%之间，说明本发明公开的方法具有较高的准确度和精密度。表3复合果汁饮料准确度与精密度分析报告实施例3：rio鸡尾酒调和饮料中专利蓝v的表面增强拉曼光谱快速检测（1）制备金纳米增强基底：金纳米增强基底的制备采用柠檬酸三钠加热还原法制备。把三口瓶放于智能恒温磁力搅拌器中，向三口瓶加入一定量一定浓度的氯金酸溶液，大火快速加热至沸腾（边加热边搅拌），快速加入一定量ip6作为保护剂，并加入1ml柠檬酸三钠溶液，此时溶液有深红色变为酒红色，并继续保持搅拌继续加热15min；室温冷却后，避光保存；使用时，可对金溶胶进行适当提纯处理。（2）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。称取一定量的专利蓝v标准品，放于100ml的容量瓶中，用超纯水定容到刻度，制成浓度为100mg/l的标准品母液，将母液逐步稀释成一定梯度的标准溶液。取一定浓度的稀释液进行步骤（1）制备的500μl金溶胶增强基底溶液和步骤（2）中无机盐溶液100μl（1%），三者混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到专利蓝v标准溶液的表面增强拉曼光谱，如图2所示。图中400、426、572、776、856、890、912、938、1156、1182、1210、1276、1336、1430、1492和1608cm-1这16个谱峰信号较强，对这些谱峰进行归属如下表1：table1theoreticalandexperimentalramanspectraofpatentbluevanditsassignmentsw=weak,m=medium,s=strong,vs=verystrong,υ=stretching,δ=bending,ρ=rocking（3）将待测的rio鸡尾酒调和饮料微波处理2min后，称取2ml浓度为0.5mg/ml的专利蓝v的标液，加入一定量的rio鸡尾酒空白试样，制备大约100mg/kg的加标液，依次类推制备出0、0.53、1.30、1.97、2.39、3.58、4.99、5.63、6.35mg/kg不同浓度的加标液。备用。（4）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。取500μl一定浓度的饮料加标液，步骤（1）制备的500μl金纳米溶液和浓度为1%的100μl步骤（2）中两种无机盐溶液100μl（1%），分别混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到待测饮料的表面增强拉曼谱图，如图3所示，对比图3中1156、1182、1210、1278四个特征峰的强度可知添加氯化镁的溶液拉曼信号较好。（5）选择激发光源波长为785nm的拉曼光谱仪，功率为300mw，光谱扫描范围100～4278cm-1，分辨率为4cm-1，积分时间为10s，曝光次数2次，每个样品重复检测3次取平均。例3（3）的各浓度溶液分别取50μl、取步骤（1）制备的500μl金纳米溶液和浓度为1%的100μl步骤（2）中无机盐溶液100μl，分别混合均匀，用于拉曼光谱检测，得到待测饮料的表面增强拉曼多层谱图，如图6所示。对比图6专利蓝v加标溶液的表面增强拉曼谱图和图2专利蓝v标准溶液的表面增强拉曼谱图，可看出待测试样的表面增强拉曼光谱中存在1156、1182、1210、1432和1612cm-1处专利蓝v的拉曼特征峰，这5个特征峰可作为rio鸡尾酒调和饮料中专利蓝v的定性判别依据。由图6可知，1180cm-1处的峰强度在不同浓度时的特征峰强度随rio鸡尾酒中加标的专利蓝v浓度减少而降低，选用该特征峰强度制定标准曲线，标准曲线如图9所示，特征峰1182cm-1处的峰强度与rio鸡尾酒调和饮料中专利蓝v浓度具有良好的线性关系，在浓度范围为0.53～6.35mg/kg内，线性方程为y=0.2597x+1.6206，相关系数r2=0.9903，可用于rio鸡尾酒调和饮料中专利蓝v的定量分析。向rio鸡尾酒空白样品中加入一定量的专利蓝v标液，制备低、中、高三个不同浓度的加标液，按实施例3（5）进行操作，每个样品重复测定3次，同时测定加标回收率与相对标准偏差，结果见表4。加标平均回收率为101.19~107.55%，相对标准偏差在1.75～7.54%之间，说明本发明公开的方法具有较高的准确度和精密度。表4rio调和饮料准确度与精密度分析报告当前第1页12当前第1页12