一种快速确诊猫泛白细胞减少症的检测方法及其试纸条的制备与流程

本发明涉及一种用于猫泛白细胞减少症的快速确诊的检测方法及其试纸条的制备，属于医学检验领域。

背景技术：

猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleukopeniavirus,fplv)，又名猫细小病毒(fpv)，猫瘟病毒，猫传染性肠炎病毒，是引起猫泛白细胞减少症的病原。猫泛白细胞减少症病毒分布遍及全世界，是感染猫科动物最主要的病毒，由此病毒所引起的传染病以高热、呕吐、脱水、白细胞严重减少和出血性肠炎为主要特征。病原学研究表明，猫泛白细胞减少症病毒在自然条件下可感染猫科动物如虎、豹、狮及鼬科、浣熊科等多种动物，体型较小的猫科动物及水貂最易感染。

猫泛白细胞减少症是一种严重危害猫科动物的高致病性传染病，目前，猫泛白细胞减少症常用的实验室诊断方法包括电镜观察、病毒分离、微量ha-hi试验、琼脂扩散试验、微量sn试验、pcr检测、酶联免疫吸附试验(elisa)等。但这些方法具有操作繁琐，对仪器及操作人员要求较高等特点不能普及使用。

技术实现要素：

鉴于以上所述产品的缺点，本发明的目的在于提供一种操作方便、耗时短、灵敏度高、定量检测猫泛白细胞减少症病毒的方法及其试纸条的制备。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采取了以下技术方案：

一种快速确诊猫泛白细胞减少症的荧光定量检测试纸条，由底板、结合垫、样品垫、反应膜、吸水纸依次组成。

所述的结合垫包被有荧光聚苯乙烯微球标记物。

所述的反应膜上包括检测线t线和质控线c线，所述检测线包被有猫泛白细胞减少症病毒抗体，所述质控线包被有羊抗鼠抗体。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：结合垫的制备：

(1)用荧光乳胶微球标记猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体；

(2)将步骤(1)制备的荧光乳胶微球标记物用喷金划膜仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚酯膜上，置于烘箱烘干后备用；

步骤2：反应膜的制备：

将猫泛白细胞减少症病毒抗体和羊抗鼠抗体分别喷划于检测线t线和质控线c线；

步骤3：样品垫的制备：

将聚酯膜经缓冲液浸渍后放烘箱中烘干备用；

步骤4：

将步骤1-3所制作完成的材料组装完成后用机器切割成3.95mm的小条装入卡壳中。

本发明的另一个目的是提供一种快速确诊猫泛白细胞减少症的荧光定量方法，该方法包括以下步骤：

1)样品前处理：定量吸取样本置于稀释液中；

2)用上述的确诊猫泛白细胞减少症试纸条进行检测；

3)将加入样本后的试纸条放置于配套荧光定量仪器中检验，读取检测结果。

本发明提供了一种基于定量结果判断猫泛白细胞减少症病情及预后的判断方法，其特征在于：

0-20au：阴性

20-50au：疑似携带

50-100au：弱阳

100-300au：中度阳性

>300au：强阳

本发明的优点为：

本发明所提供的快速确诊猫泛白细胞减少症荧光定量试纸条可提供定量数值结果；

本发明提供了一种基于定量结果的病情及预后判断方法；

本方法具有一步加样即可读取结果，操作简便的优点。

说明书附图

图1显示了本发明的快速确诊猫泛白细胞减少症试纸条的结构示意图；其中，1为底板；2为加样槽；3为样品垫；4为结合垫；5为检测线；6为质控线。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式

实施例1、快速确诊猫泛白细胞减少症荧光定量试纸条的构成

快速确诊猫泛白细胞减少症试纸条由底板、结合垫、反应膜、样品垫、吸水纸依次组成。先将反应膜贴在pvc底板的中间，再贴吸水纸，吸水纸的始端与反应膜的末端相连，吸水纸的末端与pvc底板的末端对齐，结合垫的末端与反应膜的始端相连，结合垫从始端有1/3区域被样品垫覆盖，样品垫的始端与pvc底板的始端对齐。所述反应膜上有检测线t线和质控线c线，检测线t线位于靠近结合垫的末端的一侧；质控线c线位于远离结合垫的末端的一侧；检测线t线包被有猫泛白细胞减少症病毒抗体，质控线c线包被有羊抗鼠抗体。

组装完成后将试纸条用机器切成宽3.95mm的小条，装入塑料卡壳中，再将卡壳装入铝箔袋中，并装入干燥剂后密封，保质期可达24个月。

实施例2、实施例1中所述试纸条的制备方法

试纸条的制备：

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

步骤1：结合垫的制备：

(1)用荧光乳胶微球标记猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体；

(2)将步骤(1)制备的荧光乳胶微球标记物用喷金划膜仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚酯膜上，置于烘箱烘干后备用；

步骤2：反应膜的制备：

将猫泛白细胞减少症病毒抗体和羊抗鼠抗体分别喷划于检测线t线和质控线c线；

步骤3：样品垫的制备：

将玻纤膜或聚酯膜经缓冲液浸渍后放烘箱中烘干备用；

步骤4：

将步骤1-3所制作完成的材料组装完成后用机器切割成3.95mm的小条装入卡壳中。

下面分别详细叙述：

1.猫泛白细胞减少症病毒-荧光微球标记物的制备

(1)将500μl缓冲溶液加入50μl的荧光聚苯乙烯微球中，超声后得到荧光聚苯乙烯微球分散液。

(2)将edc&nhs活化剂迅速加入到(1)中的荧光乳胶微球分散液中后快速置于涡旋振荡器上低速震荡6min后，固定在涡旋震荡器上，室温下震荡活化。

(3)活化结束后，将步骤(2)中的荧光乳胶微球分散液离心，离心参数为16000rpm，20min，离心结束后除去上清液，用步骤(1)中的缓冲溶液清洗后以相同条件离心，除去上清液后用步骤(4)中缓冲溶液复溶。

(4)取猫泛白细胞减少症病毒抗体，加入缓冲溶液稀释至0.06mg/ml。

(5)将步骤(3)中重悬的荧光聚苯乙烯微球颗粒分散液加入到步骤(4)中的抗体稀释液中后立即在涡旋振荡器上震荡，随后超声，然后固定在涡旋震荡器上在室温下震荡反应6h。

(6)反应结束后，将步骤(5)中溶液超声6min后离心，离心参数为16000rpm，20min，离心结束后除去上清液，加入封闭液后固定在涡旋振荡器上室温条件下震荡反应。

(7)步骤(6)反应结束后将溶液离心，离心后加入封闭液清洗，在16000rpm下，离心20min后除去上清液，即可得到荧光微球标记的抗体。

(8)步骤(3)中复溶的缓冲溶液以及步骤(4)的缓冲溶液均是硼酸缓冲溶液，其ph值为7.8。

2.结合垫的制备

(1)将适量微球重悬液加入荧光微球标记的抗体中，反复吹打直至无可见颗粒存在，随后超声5min至沉淀完全消失。

(2)将步骤(1)中的荧光微球标记的抗体用喷金划膜仪喷涂于预处理的玻璃纤维膜或聚酯膜上，随后干燥，取出后置于干燥环境中保存备用。

3.反应膜的制备

将检测线和质控线需要包被的抗体，分别用适宜的稀释液稀释后，用喷金划膜仪机将其分别喷划于反应膜上。质控线包被的抗体为羊抗鼠抗体，涂覆量为2μl/cm；检测线包被的抗体为猫泛白细胞减少症病毒抗体，涂覆量为2μl/cm。

4.样品垫的制备

将样品垫用含0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.2)浸泡2h，干燥备用。

5.试纸条的组装

先将反应膜贴在pvc底板的中间，再贴吸水纸，吸水纸的始端与反应膜的末端相连，吸水纸的末端与pvc底板的末端对齐，结合垫的末端与反应膜的始端相连，结合垫从始端有1/3区域被样品垫覆盖，样品垫的始端与pvc底板的始端对齐。

实施例3、试纸条的应用

一般检测方法如下：

1.样本的制备：用棉签蘸取适量动物粪便加入样本稀释液中，充分混匀后待测。

2.样本检测：用移液器吸取待测液120μl垂直滴于加样孔中，计时15min后将试纸条插入配套的荧光定量检测仪中。

3.检测结果分析：仪器自动给出检验报告，根据检测报告结果可得出阴性/阳性结果，同时会得到猫泛白细胞减少症病毒的含量。

实验与验证结果：

1.使用本案例猫泛白细胞减少症病毒快速检测试纸条测定200份临床样本，区间判定结果和样本值的符合率为97.8％。本发明所述的猫泛白细胞减少症快速检测试纸条可以灵敏地定量检测样品中的猫泛白细胞减少症病毒。

2.使用本案例猫泛白细胞减少症病毒快速检测试纸条的稳定性验证：包装后的试纸条分别在一月、两月、三月后用同样的样品检测，结果显示cv小于8％，表明此试纸条具有较好的稳定性。