本发明属于生物技术领域，具体涉及一种cd133质谱流式抗体、制备方法及应用。
背景技术：
流式技术是最经典的单细胞检测技术，能够对细胞进行多参数检测。传统流式使用荧光基团偶联抗体，利用荧光光路，检测细胞表面标志。传统的流式技术是基于荧光检测系统，但是由于不同荧光基团发射光谱的重叠，会导致通道间的信号相互干扰，当检测通道多于8个的时候，补偿调节极大的依赖于人工经验，使得实验设计和补偿计算则变得十分复杂。
现在新兴发展的质谱流式技术，采用金属元素偶联抗体，通过质谱技术区分细胞的形态。新型的质谱流式的检测系统和标签系统与传统流式技术不同，传统的流式技术是基于荧光检测系统而新型的质谱流式技术采用金属元素作为标签与抗体结合；传统流式技术采用激光器和电子倍增管作为检测手段，新型的质谱流式使用icp质谱技术作为检测手段。新型的质谱流式技术通过对传统的流式技术和质谱技术进行结合，彻底解决了荧光补偿问题，并实现了最多130个标志同时检测，而现在最顶级配置的bd流式细胞仪，至多同时检测50个标志。质谱流式其强大的数据获取能力和生物信息学紧密相连，对原有的数据进行了深度挖掘。
cd133抗体常表达于未成熟的造血干细胞或祖细胞，有报道认为它在脑肿瘤、前列腺癌、小鼠的lewis肺癌、b16黑色素瘤的干细胞中均有表达，已被认为是这些肿瘤干细胞的标志之一。已有报道发现，在多种肿瘤细胞系上发现有cd133两种抗原mrna的表达。cd133-2抗原的mrna在肺癌细胞系、胰腺癌细胞系以及乳腺癌细胞系等细胞表面高表达，而cd133-1抗原的mrna高表达于视网膜母细胞癌细胞系以及与其起源相同的癌细胞表面。
作为干细胞特异性表面抗原，cd133的mrna能在多种癌细胞系中检测到，提示cd133是一种肿瘤干细胞的广谱标记物，是一种独特的干细胞标志，分子量为120kda，具有5个跨膜区，曾命名为ac133。2000年，在英国harrogate举行的第7届人类白细胞分化抗原国际工作会议(7thinternationalworkshoponhumanleucocytedifferentiationantigens，hlda7)上被正式命名为cd133。可用于筛选一些尚未分选出的肿瘤干细胞或者进一步纯化已分选出的肿瘤干细胞。
然而由于质谱技术是一个新生发展的技术，目前市场市售的质谱流式单抗不过300种左右，大部分质谱流式抗体都需自行合成，缺乏成品的cd133质谱流式的抗体，限制了cd133作为肿瘤干细胞广谱标记物的应用。
技术实现要素：
本发明提供的一种cd133质谱流式抗体、制备方法及应用，该cd133质谱流式抗体填补了现有技术的空白，质谱流式检测的抗体，具有良好的应用前景。
本发明提供了一种cd133质谱流式抗体，所述cd133质谱流式抗体是以镧系金属溶液和cd133纯抗体为原料，将镧系金属负荷到cd133纯抗体上后制备而成的。
本发明提供了一种cd133质谱流式抗体的制备方法，包括以下步骤：
s1，制备金属负荷物溶液：配制镧系金属溶液，37℃孵育30-40min，得到金属负荷物溶液；
s2，cd133抗体还原：向截留分子量50kda离心超滤管中加入r-buffer和cd133纯抗体，混匀，离心，弃上清，向得到的沉淀中加入tcep-r-buffer，混匀，37℃孵育15-30min，得到还原的抗体溶液；
其中，每1000μl的tcep-r-buffer的配制方法如下：向8μl0.5mtcep溶液中加入992μlr-buffer，混匀；
s3，纯化金属负荷物：向截留分子量3kda离心超滤管中加入l-buffer，再加入s1得到的金属负荷物溶液，混匀，离心，继续加入c-buffer，混匀，离心，回收沉淀；
s4，纯化cd133抗体：向s2获得的抗体溶液中加入c-buffer，离心，弃上清，然后再加入c-buffer混匀，离心，弃上清，回收的沉淀，该沉淀为纯化的cd133抗体；
s5，制备cd133抗体复合物：用c-buffer重悬s3中回收的沉淀，并将重悬液与s4中得到的纯化的cd133抗体混匀，37℃孵育60-120min，得到cd133抗体复合物；
s6，清洗cd133抗体复合物：用w-buffer清洗s5中得到的cd133抗体复合物，得到干净的cd133质谱流式抗体；
其中r-buffer的作用是抗体缓冲液；l-buffer和c-buffer的作用是镧系金属缓冲液；w-buffer的作用是清洗液。
优选的，上述cd133质谱流式抗体的制备方法中，s1中，所述镧系金属溶液的终浓度为2.5mm，所述镧系金属为氯化镱或者氯化镧。
优选的，上述cd133质谱流式抗体的制备方法中，s2中，r-buffer：cd133纯抗体：tcep-r-buffer的体积比例为300∶100-200∶100。
优选的，上述cd133质谱流式抗体的制备方法中，s3中，金属负荷物溶液、l-buffer和c-buffer的体积比例为100∶200∶300。
优选的，上述cd133质谱流式抗体的制备方法中，s4中，第一次加入的c-buffer、第二次加入的c-buffer以及s2中加入的tcep-r-buffer的体积比例为300∶400-500∶100。
优选的，上述cd133质谱流式抗体的制备方法中，s6的具体步骤如下：向s5得到的含有cd133抗体复合物的50kda离心超滤管中加入300μlw-buffer，混匀，12,000g离心10min，弃上清，再用400μlw-buffer洗涤沉淀三次，最后加入50μlw-buffer，冲洗，收集超滤管内溶液a；然后将该离心超滤管1000g离心2min，再用50μlw-buffer冲洗管壁，收集超滤管内溶液b，合并超滤管内溶液a和溶液b，得到干净的cd133质谱流式抗体。
本发明提供了上述的cd133质谱流式抗体作为质谱流式检测干细胞标志物的应用。
本发明提供了上述的cd133质谱流式抗体的制备方法在制备质谱流式检测干细胞标志物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种cd133质谱流式抗体、制备方法及应用，具有以下有益效果：
在此发明之前，质谱流式抗体不存在镧系金属负荷的cd133质谱流式抗体，在质谱流式研究研究干细胞，细胞早起分化中缺乏这样的标志性cd133质谱流式抗体，限制了质谱流式技术的应用范围，本发明通过构合成新的镧系金属负荷的cd133质谱流式抗体，填补了市场的空白，对质谱流式检测干细胞标志提供了新的靶抗体，拓展了质谱流式技术研究干细胞新的领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的是
纯化的igg(购自上海远慕生物科技有限公司)：无负载(不含有bsa，蛋白质，明胶等稳定剂)；cd133纯抗体(未标记，无载体)，德国美天旎公司生产。
下述实施例中使用的耗材有：截留分子量3kda的离心超滤管、截留分子量50kda的离心超滤管和流式上样管，均为市售。
本发明实施例中，cd133质谱流式抗体是以镧系金属溶液和cd133纯抗体为原料，将镧系金属负荷到cd133纯抗体上后制备而成的。其制备方法如下：
s1，制备金属负荷物溶液：配制终浓度为2.5mm的镧系金属溶液，混匀，37℃孵育30-40min，得到金属负荷物溶液；具体操作如下：
预处理镧系金属：将购买的镧系金属溶液(购买的镧系金属溶液管内含有20μl镧系金属氯化镱)12,000g离心10s，确保试剂在离心超滤管底部，弃上清，加入95μll-buffer(磷酸缓冲液，ph7.0，1mol/l)重悬，混匀，得到待反应试管；
制备金属负荷物溶液：向所述待反应试管中加入5μl购买的镧系金属溶液，得到终浓度为2.5mm的镧系金属溶液，混匀，37℃孵育30-40min，得到金属负荷物溶液，孵育期间开始s2步骤。
s2，cd133抗体还原：向截留分子量为50kda离心超滤管(柏之瑞)中加入300μlr-buffer和100μl的cd133纯抗体(上海浩然生物技术有限公司)，混匀，室温12,000g离心10min，弃上清，向得到的沉淀中加入100μl4mmtcep-r-buffer，混匀，37℃孵育30min，得到还原的抗体溶液，该抗体溶液保存于该50kda离心超滤管中；
其中每1000μl的tcep-r-buffer的配制方法如下：向8μl0.5m三(2-羧乙基)膦溶液(tcep溶液)中加入992μlr-buffer中，混匀。
s3，纯化金属负荷物：向截留分子量为3kda离心超滤管中加入200μll-buffer，再加入s1得到的金属负荷物溶液100μl，混匀，室温12,000g离心25min，继续加入300μlc-buffer，混匀，室温12,000g离心30min，回收沉淀，该沉淀为纯化的金属负荷物溶液；
s4，纯化cd133抗体：向s2获得的含有还原的抗体溶液50kda离心超滤管中加入300μlc-buffer，12,000g室温离心10min，弃上清，然后再加入400μlc-buffer混匀，12,000g室温离心10min，弃上清，回收的沉淀，该沉淀为纯化的cd133抗体。
s5，制备cd133抗体复合物：用60μlc-buffer重悬s3中回收的沉淀，并将重悬液转移至s4中装有纯化的cd133抗体的50kda离心超滤管中，混匀(将重悬液与s4中得到的纯化的cd133抗体混匀)，37℃孵育60min，得到cd133抗体复合物；
s6，清洗cd133抗体复合物：用w-buffer清洗s5中得到的cd133抗体复合物，得到干净的cd133质谱流式抗体，具体步骤如下：向s5得到的含有cd133抗体复合物的50kda离心超滤管中加入300μlw-buffer，混匀，12,000g离心10min，弃上清，再用400μlw-buffer洗涤沉淀三次，最后加入50μlw-buffer，冲洗，收集超滤管内溶液a；然后将该离心超滤管1000g离心2min，再用50μlw-buffer冲洗管壁，收集超滤管内溶液b，合并超滤管内溶液a和溶液b，得到干净的cd133质谱流式抗体，此时cd133纯抗体结合了镧系金属，4℃保存备用。
s7，测cd133质谱流式抗体的280nm光吸收值，计算得出cd133质谱流式抗体浓度，用w-buffer调零，计算得cd133纯抗体转化为cd133质谱流式抗体的回收率为60％左右；
用市售的抗体缓冲液稀释cd133质谱流式抗体至终浓度0.5mg/ml，抗体缓冲液中预先添加0.05g/100ml叠氮钠，测定cd133质谱流式抗体的效价为1∶50到1∶200之间。
需要说明的是，本发明的方法中涉及数值范围的，应当理解为在该数值范围内的任一数值均可实现本发明的方案，由于其带来的效果相似，故本发明具体实施方式中仅描述了优选的实施例1，尽管已描述了本发明的优选实施，1，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。