用于糖尿病人心肾功能监测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术诊断领域，具体涉及一种用于糖尿病人心肾功能监测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒。

背景技术：

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，而心血管疾病和肾病又是糖尿病人的主要并发症，并严重影响糖尿病人的生命。据统计，糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10%是肾脏病变所致。临床数据显示，糖尿病发病后10年左右，将有30%～40%的患者至少会发生一种并发症，且并发症一旦产生，药物治疗很难逆转，尤其是心梗和肾病。因此，早期即时监测糖尿病人的心血管损伤和肾脏损伤风险，可预防重大疾病如心梗、晚期肾病的发生，及时挽救病人的生命。

CTnI为心肌肌钙蛋白(cTn)的三个亚单位(cTnI，cTnC和cTnT)之一，是肌肉组织收缩的调节蛋白，在心肌细胞膜完整的情况下，cTnI不能透出细胞膜进入血循环。当心肌细胞因缺血、缺氧发生变性坏死时，cTnI通过破损细胞膜释放入血。由于cTnI分子量较小并持续从变性细胞内逸出，故AMI发生后，在血中出现较早，并持续相当长时间。与其他血清酶相比，cTnI是心肌损伤的更特异的标记物，同时它也很敏感，可以诊断心脏手术（例如：钙化性主动脉瓣狭窄和冠状动脉旁路手术）周围的微小梗死和缺血出现4h的AMI。cTnI在正常人血液中含量很低，约为20.4pg/ml。cTnI >20.4pg/ml ，对心肌损伤就有诊断意义。患者在出现胸痛症状前几天的微小心肌损伤即可以用cTnI检测出来。在AMI发生2.2-6.8小时，它的浓度开始升高，大约在11.2小时达到峰值195.9ng/ml，持续时间久，5～10天后可降至正常。cTnI具有以下优点：血中出现时间早，因为分子量较CK-MB小，心肌损伤后更易释放入血；灵敏度高；特异性高，骨骼肌损伤不影响结果的判断，也可推测非心脏手术病人的手术类型对cTnI无明显影响；持续时间长，因此可在心肌损伤早期和后期通过检测cTnI来明确诊断和判断心肌损伤程度。在急性心梗诊断、治疗及预后具有重要的临床应用价值。

NT-proBNP（N末端脑钠肽），是BNP前体(proBNP) 被内肽酶切割后的产物，含N端76个氨基酸。当发生心力衰竭时，BNP释放到血液中，随后降解为NT-proBNP和BNP，检测血液中NT-proBNP和BNP的含量，可监测心力衰竭的程度。由于 NT-proBNP的半衰期较长(120min)，体外稳定性强，在心力衰竭患者中的浓度较BNP高，更有利于心力衰竭的诊断，因此NT-proBNP作为心力衰竭诊断的敏感指标，并评估心功能损害严重程度。2002年美国FDA批准Roche公司的ElecsysproBNP上市，检测血液中的NT-proBNP。美国心脏协会(AHA)、美国临床生化学院(NACP)制定的“心衰诊断和治疗指南”及“心脏标志物的应用指南”中，把NT-proBNP作为心力衰竭的诊断和预后指标。

中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白(NGAL)是一种小分子量分泌型蛋白，由Kjeldsedn等人于1993年发现，是Lipocalin家族的新成员。生理条件下，NCAL少量合成于骨髓中性粒细胞和肾小管等多个系统的上皮细胞，炎症反应和恶性肿瘤可诱使其在多组织(如子宫、前列腺、唾液腺、肺、肾、气道及消化道上皮等)中大量生成，几个小时内就可以达到峰值，产生速度明显快于其它相关生物标记物。NGAL在急性肾小管损伤早期就已经表达，反映肾小管功能紊乱，它浓度的升高提示肾小管损伤发生，而传统指标血肌酐升高则需24小时以上。NGAL也是目前新型AKI诊断的首选指标物。

现有技术中，糖尿病的检测指标以血糖为主，虽然糖尿病并发症严重影响病人的生命质量，但糖尿病人和临床医生往往侧重于血糖的管理，忽视了心血管和肾脏损伤的监测。一方面，现有技术多是单指标检测，如胸痛检测心肌酶指标，尿血了才去检测肾脏指标；另一方面，现有的检测技术不够完善，平台技术不通用，如CTnI、NGAL或者NT-proBNP的检测试剂以不同形式在临床上应用，制作原理及操作程序各不相同，兼容性比较差；三是，早期监测指标应用不普及，往往发现时病人已经是心梗或肾衰的晚期，极大地影响了对患者的准确诊断，从而造成很多病人因延误救治而病情恶化甚至导致死亡。

为克服上述技术的缺陷，本实用新型提供了一种可以实现心肾损伤同步、快速、即时监测的试剂盒，实现糖尿病人在家庭、养老院、社区卫生所、急诊等随时随地检测，避免恶性心肾损伤的发生。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是提供一种用于糖尿病人心肾功能监测的时间分辨荧光免疫层析试剂盒。

为解决以上技术问题，本实用新型采用如下技术方案：

一种用于糖尿病人心肾功能监测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其包括检测卡和可选择的荧光免疫定量分析仪，检测卡包括上样垫、结合垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸样垫及底板，检测指标包括心肌肌钙蛋白（CTnI）、N末端脑钠肽（NT-proBNP)和中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（NGAL），结合垫包括结合垫本体和涂覆于结合垫本体上的时间分辨荧光微球标记抗体涂层，该时间分辨荧光微球标记抗体涂层中的抗体为所述指标的抗体；检测线有三条，这三条检测线相互分离且分别为能够与时间分辨荧光微球标记抗体特异性结合的配对抗体或抗原形成的涂层。

检测垫上包被有分别与CTnI、NGAL、NT-proBNP相对应的单克隆抗体、多克隆抗体，或相应的抗原构成的检测线和羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等抗体构成的质控线。

本实用新型还提供另一种用于糖尿病人心肾功能监测的时间分辨荧光免疫层析试剂盒的方案，该试剂盒包括检测卡和可选择的荧光免疫定量分析仪，检测卡包括上样垫、结合垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸样垫及底板，指标包括心肌肌钙蛋白、N末端脑钠肽和中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白，试剂盒还包括荧光标记抗体溶液，其中时间分辨荧光微球标记抗体涂层中的抗体为所述指标的抗体；检测线有三条，这三条检测线相互分离且分别为能够与时间分辨荧光微球标记抗体特异性结合的配对抗体或抗原形成的涂层。

根据本实用新型的一个具体方面，检测卡由上样垫、结合垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。

根据本实用新型的一个优选方面，检测卡还包括滤血膜，滤血膜覆设在上样垫上，上样垫、结合垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上。

根据本实用新型的又一优选方面，检测卡还包括助推垫，且检测卡由上样垫、结合垫、助推垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。

根据本实用新型的还一优选方面，检测卡还包括滤血膜和助推垫，滤血膜覆设在上样垫上，上样垫、结合垫、助推垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上。

优选地，助推垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布。

根据本实用新型的一个优选方面，所述检测垫仅有一条，所述三条检测线、质控线相互平行且沿着所述检测垫的长度方向依次设置在所述检测垫上。

进一步地，三条检测线中靠近结合垫的检测线为心肌肌钙蛋白的配对抗体或抗原涂层，靠近吸样垫的检测线为中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白的配对抗体或抗原涂层，中间的检测线为N末端脑钠肽的配对抗体或抗原涂层，质控线位于检测垫的靠近吸样垫的端部。

根据本实用新型的又一优选方面，所述检测垫包括三条检测分垫，所述三条检测线分别分布在三条检测分垫上。在各检测分垫上分别设置有质控线。CTnI、NT-proBNP、NGAL相对应的单克隆抗体、多克隆抗体，或相应的抗原分别包被在三条检测垫上，每条检测垫上平行设置质控线，包被羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等抗体，或仅对结合垫经过玻纤处理液处理，制备包含荧光微球标记的CTnI单克隆抗体、荧光微球标记的NT-proBNP单克隆抗体和荧光微球标记的NGAL单克隆抗体的荧光液。

根据本实用新型的又一优选方面，检测卡包括三个独立的检测分卡，上样垫、结合垫、吸样垫和底板分别有三条，每一条上样垫、结合垫、检测分垫、吸样垫和底板组装成一个检测分卡。

优选地，质控线通过包被包括但不限于羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等形成。

优选地，检测垫为硝酸纤维素膜且为孔径5～12um的多孔样结构膜；上样垫、结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布，吸样垫的材质为吸水滤纸。

荧光微球时间分辨技术和免疫层析检测技术是已知的。本实用新型所述的时间分辨荧光微球标记抗体可采用本领域熟知的方法制备。

由于以上技术方案的实施，本实用新型与现有技术相比具有如下优点：本实用新型的创新点在于通过同时检测CTnI、NT-proBNP和NGAL的指标变化，及时、简便、直观、快捷的对心血管、糖尿病等重大疾病引起的心衰和肾衰的发生、发展进行同步定量监测，能实现家庭检测和现场检测，所需样本量少，灵敏度高，检测背景信号低，特异性强，线性范围宽，操作简便，结果可靠。

本实用新型检测卡通过增加滤血膜，使其可以方便、简易、准确的应用于对心血管、糖尿病等重大疾病引起的心衰和肾衰的发生、发展进行同步定量监测，适用于家庭、养老院、条件简陋的社区卫生所。其使用方法也仅是由病人或家属针刺一滴血来实现对心血管、糖尿病等重大疾病引起的心衰和肾衰的发生、发展进行同步定量监测，减轻去医院挂号、排队、化验、取报告等繁琐过程，减轻公共医疗机构的压力，更有益于患者的日常监测。

进一步地，本实用新型在结构上增加了助推垫，可以有效的去除背景干扰，从而进一步提高诊断灵敏度高和准确度，此外助推垫还有助于加快检测样品流动，提高检测效率，缩短检测时间。

附图说明

图1为根据本实用新型的实施例1的检测卡的主视结构示意图；

图2为根据本实用新型的实施例2的检测卡的主视结构示意图；

图3为根据本实用新型的实施例3的检测卡的立体结构示意图；

图4为根据本实用新型的实施例4的检测分卡的主视结构示意图（含T1检测线）；

图5为根据本实用新型的实施例4的检测分卡的主视结构示意图（含T2检测线）；

图6为根据本实用新型的实施例4的检测分卡的主视结构示意图（含T3检测线）；

其中：1,1’,1”、上样垫；2,2’,2”、胶体金结合垫；20,20’,20”、结合垫本体；21,21’,21”、胶体金标记抗体涂层；3、检测垫；30,30’,30”、检测分垫；4,4’,4”、吸样垫；5,5’,5”、底板；6,6’,6”、滤血膜；7,7’,7”、助推垫；T1,T2,T3、检测线；C,C’,C”、质控线。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，本例提供一种用于糖尿病人心肾功能监测的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其包括检测卡、荧光免疫定量分析仪，检测卡包括上样垫1、结合垫2、具有检测线和质控线C的检测垫3、吸样垫4及底板5、滤血膜6和助推垫7，滤血膜6覆设在上样垫1上，上样垫1、结合垫2、检测垫3及吸样垫4依次相互交错粘贴在底板5上。其中，助推垫7的材质为玻璃纤维素膜或无纺布。检测垫3为硝酸纤维素膜且为孔径5～12um的多孔样结构膜；上样垫1、结合垫2的材质为玻璃纤维素膜或无纺布，吸样垫4的材质为吸水滤纸。

进一步地，检测卡能够同时检测心肌肌钙蛋白、N末端脑钠肽和中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白三种指标，结合垫2包括结合垫本体20和涂覆于结合垫本体20上的时间分辨荧光微球标记抗体涂层21，该时间分辨荧光微球标记抗体涂层21中的抗体为所述指标的抗体。该检测垫3为一个，其上有三条检测线T1、T2、T3，这三条检测线T1、T2、T3相互分离且分别为三种标志物的配对抗体或抗原形成的涂层，三种标志物的配对抗体或抗原分别能够与时间分辨荧光微球标记抗体涂层特异性结合。三条检测线T1、T2、T3、质控线C相互平行且沿着检测垫3的长度方向依次设置。三条检测线T1、T2、T3中靠近结合垫2的检测线T1为心肌肌钙蛋白的配对抗体或抗原涂层，靠近吸样垫4的检测线T3为中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白的配对抗体或抗原涂层，中间的检测线T2为N末端脑钠肽的配对抗体或抗原涂层，质控线C位于检测垫3的靠近吸样垫4的端部。质控线C通过包被包括但不限于羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等形成。

本例中的各部件是这样组装到一起的，在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于40％，取底板5，将已包被的检测垫3放置在底板5的中部粘贴，将结合垫裁切成合适的宽度，在检测垫3靠近检测线一侧搭接助推垫7，将结合垫2裁切成合适的宽度，粘贴在助推垫7的1/4处，在结合垫2另一侧搭接粘贴上样垫1，搭结合垫2的1/3粘贴；滤血膜6覆设在的上样垫1上；在检测垫3的靠近质控线一侧搭接吸样垫4，搭吸样垫4的1/10粘贴。最后用裁剪机将贴好的底板切成3～5mm宽的试纸条，装入塑料卡内即形成检测卡。

本例试剂盒的检测方法如下（干法上样）：

(1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出检测卡，平放；

(2)吸取待测样本，加入洁净的离心管中，用样本稀释液进行稀释，充分混匀；

(3)用移液枪吸取稀释后的样本加入到上样垫1的样本孔中，15分钟后，根据已预先设置在时间分辨荧光免疫定量读数仪的标准曲线对CTNI、NGAL和NT-proBNP的浓度进行计算并显示结果。

本例检测卡的检测原理如下：

当样本加入到样品孔后，样本中含有的CTnI、NT-proBNP或NGAL抗原与荧光微球标记的CTnI、NT-proBNP或NGAL抗体结合，借助毛细管作用，所形成的抗体-抗原免疫复合物沿硝酸纤维素膜层析至检测线，然后与固化在检测线上的CTnI、NT-proBNP和NGAL抗体发生高特异性和高亲和性的免疫反应 , 因而免疫复合物被富集或截留在层析材料的检测带上，未结合的免疫复合物则继续层析至质控线被羊抗鼠IgG羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等抗体捕获。反应完成后，检测带上Eu ^{3 +}螯合物的含量与目标被检物的浓度有一定的对应关系 。如果待测样品溶液中不含被检物 , 则检测带上就没有Eu ^{3 +}螯合物 。由于镧系离子螯合物的荧光衰变时间长，为传统荧光的10³—10⁶倍。用时间分辨荧光仪测量其荧光时，在脉冲光源激发之后，可以延迟一段时间再进行测量，此时其他成分的短半衰期荧光已经衰变，只存在Eu³⁺标记物的特异性荧光，通过测量免疫反应后试纸条检测带上 Eu ^{3 +}螯合物的含量 ,参照标准浓度曲线就可以定量得到待测样品中对应抗原的浓度。

当反应结束后，进行分析，根据已预先设置在时间分辨荧光免疫定量读数仪内的标准曲线对CTnI、NT-proBNP和NGAL的浓度进行计算并显示结果。

实施例2

如图2所示，本例提供一种用于糖尿病人心肾功能监测的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，其结合垫不具有时间分辨荧光微球标记抗体涂层，试剂盒还进一步包括时间分辨荧光微球标记抗体溶液。

本例试剂盒的检测方法如下（湿法上样）：

(1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出检测卡，平放；

(2)吸取待测样本，与时间分辨荧光微球标记抗体溶液充分混合；

(3)用移液枪吸取混合液加入到上样垫1的样本孔中，15分钟后，根据已预先设置在时间分辨荧光免疫定量读数仪的标准曲线对CTnI、NT-proBNP和NGAL的浓度进行计算并显示结果。

实施例3

如图3所示，本例提供一种用于糖尿病人心肾功能监测的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，其检测垫3包括三个并排设置的检测分垫30，30’，30”，每个检测分垫30，30’，30”上分别形成一条检测线和质控线。

本例试剂盒的制备、检测及检测原理同实施例1。

实施例4

如图4、图5、图6所示，本例提供一种用于糖尿病人心肾功能监测的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，检测卡包括三个独立的检测分卡，滤血膜6，6’，6”、上样垫1，1’，1”、结合垫2，2’，2”、助推垫7，7’，7”、检测分垫30，30’，30”、吸样垫4，4’，4”和底板5，5’，5”分别有三条，每一条滤血膜6，6’，6”、上样垫1，1’，1”、结合垫2，2’，2”、助推垫7，7’，7”、检测分垫30，30’，30”、吸样垫4，4’，4”和底板5，5’，5”组装成一个检测分卡，每个检测分卡上的检测分垫30，30’，30”上分别形成一条检测线和质控线。

本例试剂盒的制备、检测及检测原理同实施例1。

综上，本实用新型的创新点在于通过同时检测CTnI、NT-proBNP和NGAL和的指标变化，及时、简便、直观、快捷的对心血管、糖尿病等重大疾病引起的心衰和肾衰的发生、发展进行同步定量监测，能实现家庭检测和现场检测，所需样本量少，灵敏度高，检测背景信号低，特异性强，线性范围宽，操作简便，结果可靠，临床监测的准确率高达95%以上。

本实用新型检测卡通过增加滤血膜，使其可以方便、简易、准确的应用于对糖尿病引起的心衰和肾衰的发生、发展进行同步定量监测，适用于家庭、养老院、条件简陋的社区卫生所。其使用方法也仅是由病人或家属针刺一滴血来实现对心衰和肾衰的发生、发展进行同步定量监测，减轻去医院挂号、排队、化验、取报告等繁琐过程，减轻公共医疗机构的压力，更有益于患者的日常治疗。

进一步地，本实用新型在结构上增加了助推垫，可以有效的去除背景干扰，从而进一步提高诊断灵敏度和准确度，此外助推垫还有助于加快检测样品流动，提高检测效率，缩短检测时间。

以上对本实用新型做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本实用新型的内容并加以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围，凡根据本实用新型的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围内。