强阳离子交换层析载体及其使用方法与流程

本发明涉及具有强阳离子交换基团的离子交换层析载体、以及使用了其的生物分子的纯化方法。

背景技术：

免疫球蛋白(抗体)为掌管免疫响应的生理活性物质。近年，在药物、诊断药或所对应的抗原蛋白质的分离纯化材料等用途中，其利用价值升高。抗体由进行了免疫的动物的血液或者拥有抗体产生能力的细胞的细胞培养液或动物的腹水培养液获得。但是，这些含有抗体的血液、培养液包含抗体以外的蛋白质、或源自细胞培养中使用的原料液的复杂的夹杂成分，为了由这些杂质成分分离纯化抗体，通常需要繁杂且长时间的操作。

液相层析对于抗体的分离纯化而言是重要的。作为用于分离抗体的层析手法，有凝胶过滤层析、亲和层析、离子交换层析和反相层析等，通过将这些手法组合，将抗体分离纯化。

离子交换层析为通过将吸附剂表面的离子交换基团作为固定相而可逆地吸附存在于流动相中的平衡离子来进行分离的方法。作为吸附剂的形状，可采用珠子、或平膜和中空纤维等膜等，在这些基材键合阳离子交换基团或阴离子交换基团而成的物质作为吸附剂市售。

对于具有阳离子交换基团的吸附剂，通常进行下述纯化：通过使低盐浓度的抗体溶液与吸附材料接触来吸附抗体，通过提高流动相的盐浓度来洗脱所吸附的抗体。进而，作为更良好的方法，也提出了以下说明的利用流通方式进行的目的物质的纯化。

流通方式指的是由目的物质使杂质选择性地吸附于吸附剂的纯化方法的方式。因此，与以往的利用了吸附、洗脱的方法相比，实现缓冲液的节约、工序的简化。另外认为，若可以以高流速对抗体溶液进行处理，则流通纯化的优点进一步发挥作用。

另外，在阳离子交换工序中，往往目的在于，将抗体单体与抗体二聚体等聚集体分离。但是，由于抗体单体与抗体聚集体的等电点大致相等，因此在流通纯化中，特别难以将抗体单体与抗体二聚体分离，需要阳离子交换体的细致设计。

专利文献1中公开了将具有强阳离子交换基团的单体和非带电单体接枝聚合于载体而成的适于流通纯化的层析载体。

专利文献2中公开了温度响应性单体和具有强阳离子交换基团的接枝链固定于载体而成的适于流通纯化的层析载体。

专利文献3中公开了具有弱阳离子交换基团的适于流通纯化的层析载体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-189427号公报

专利文献2：国际公开第2014/171437号

专利文献3：国际公开第2016/013609号

技术实现要素：

发明要解决的问题

专利文献1中公开的阳离子交换体的特征在于，固体载体上的低密度(1～30毫摩尔/l)的阳离子交换基团的使用，对于更大的阳离子交换基团的密度而言，在流通纯化中，不能有效地去除聚集体，因此阳离子交换基团的密度存在限制。因此可以纯化的抗体量未必多。

专利文献2中公开的阳离子交换体由于接枝链中含有温度响应性单体的丙烯酰胺衍生物、具体而言异丙基丙烯酰胺作为单体单元，因此存在纯化性能受到温度的影响的倾向。另外，若处理温度低则含有异丙基丙烯酰胺作为单体单元的高分子链成为亲水性，聚集体去除性能降低。因此通过共聚疏水性单体，异丙基丙烯酰胺的共聚物的下限临界温度降低，通过增强高分子的疏水的性质，室温附近下的聚集体去除性能提高。但是，为了使专利文献2中公开的阳离子交换体的性能稳定，需要精密的温度控制。另一方面，蛋白质药物的制造根据制造现场而温度不同，因此优选尽可能不受温度的影响。

进而对于专利文献2中公开的阳离子交换基团的密度为30毫摩尔/l以上的阳离子交换膜，在抗体聚集体的去除效率方面存在改善余地。

专利文献3公开了30毫摩尔/l以上的阳离子交换基团密度的适于流通纯化的阳离子交换膜。对于该阳离子交换膜，即使阳离子交换基团密度高、也可以有效地去除聚集体，可以纯化大量的抗体。另一方面，所公开的阳离子交换膜主要是弱阳离子交换基团，在低的ph时阳离子交换基团不会带电，因此从宽范围的ph范围中的有效去除抗体聚集体的观点考虑，存在改善余地。

如此，对于抗体等生理活性物质的流通纯化而言，没有公开在宽范围的ph范围中可以有效地且不受温度影响地流通纯化大量的生理活性物质的阳离子交换膜。因此，本发明的目的在于，提供在流通纯化中，不易受到温度所导致的影响、即使ph低也能够有效地纯化大量的生理活性物质的阳离子交换膜。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题而从各种角度探讨而进行研究开发。其结果发现，在流通纯化中，不易受到温度所导致的影响、能够在宽的ph范围内有效地纯化大量的生理活性物质的接枝链的组成，从而完成了本发明。

根据本发明的方式，提供一种阳离子交换层析载体，其具备基材、和被固定于基材的单体单元中的一个至少具有磺酸基的共聚物，共聚物实质上不形成交联结构、并且共聚物不含有或者在实质上不造成影响的范围内含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物作为单体单元，共聚物的质量与基材的质量的比率为5％以上且200％以下，磺酸基的密度高于30毫摩尔/l且为200毫摩尔/l以下。

上述阳离子交换层析载体中，共聚物中的具有磺酸基的单体单元的摩尔比率比不具有电荷的中性单体单元的摩尔比率小为宜。

上述阳离子交换层析载体中，共聚物中的具有磺酸基的单体单元的质量比率比不具有电荷的中性单体单元的质量比率小为宜。

上述阳离子交换层析载体中，具有磺酸基的单体单元为甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生物为宜。

上述阳离子交换层析载体中，中性单体单元至少含有亲水性单体单元，共聚物中的中性单体单元中的亲水性单体单元的摩尔比率为50％以上为宜。

上述阳离子交换层析载体中，中性单体单元至少含有亲水性单体单元，共聚物中的中性单体单元的总质量中的亲水性单体单元的质量的比率为50％以上为宜。

上述阳离子交换层析载体不含有羧基为宜、或羧基的密度比磺酸基的密度低为宜。

上述阳离子交换层析载体中，基材为膜状为宜。

另外，根据本发明的方式提供一种生物分子纯化用阳离子交换层析载体，其具备上述阳离子交换层析载体。

上述生物分子纯化用阳离子交换层析载体用于抗体蛋白质纯化为宜。

另外，根据本发明的方式提供一种纯化方法，其为从含有杂质和生理活性物质的混合溶液纯化生理活性物质的纯化方法，其包括使混合溶液接触上述生物分子纯化用阳离子交换层析载体。

上述纯化方法中，以流通方式使混合溶液接触载体为宜。

上述纯化方法中，混合溶液的ph为4.0以上且10.0以下为宜。

上述纯化方法中，生理活性物质为抗体蛋白质的单体为宜。

上述纯化方法中，杂质含有抗体蛋白质的二聚体以上的聚集体为宜。

上述纯化方法中，生理活性物质的回收率为80％以上为宜。

上述纯化方法中，生物分子纯化用阳离子交换层析载体每1ml纯化含有单体和聚集体的抗体蛋白质100mg以上为宜。

上述纯化方法中，纯化含有单体和聚集体的抗体蛋白质溶液时，聚集体比率降低50％以上为宜。

上述纯化方法中，在利用阳离子交换层析载体进行的纯化工序之前或之后还包括利用阴离子交换层析载体进行纯化为宜。

上述纯化方法中，阴离子交换层析载体为膜状为宜。

上述纯化方法中，利用阴离子交换层析载体进行的纯化为流通方式为宜。

上述纯化方法中，在利用阳离子交换层析载体进行的纯化工序和利用阴离子交换层析载体进行的纯化工序之前还包括亲和层析工序为宜。

上述纯化方法中，在一系列的纯化工序中，不进行缓冲液更换为宜。

上述纯化方法中，亲和层析工序以结合并洗脱(bindandelute)方式实施，在洗脱工序中，利用包含一元酸的缓冲液洗脱生理活性物质为宜。

上述纯化方法中，包含一元酸的缓冲液的电导率为10.0ms/cm以下为宜。

上述纯化方法中，在亲和层析工序之后还包括使混合溶液的ph为4.0以下的工序为宜。

上述纯化方法的一系列的纯化工序中，含有生理活性物质的混合溶液的电导率为10ms/cm以下为宜。

发明的效果

若使用本发明的阳离子交换层析载体，则不易受到温度所导致的影响、能够在宽的ph范围内有效地流通纯化大量的生理活性物质。

附图说明

图1为利用尺寸排阻层析测定抗体溶液时吸光度的层析图。

图2为图1的层析图的放大图。

图3为示出实施例1～17及比较例1～4的结果的表。

图4为示出实施例18中的阳离子交换膜的材料的表。

图5为示出实施例19的结果的表。

图6为示出实施例20及21的结果的表。

图7为示出实施例22的结果的表。

图8为示出实施例23～25的结果的表。

图9为示出实施例26的结果的表。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施方式(以下称为“实施方式”)进行详细说明。需要说明的是，以下所示的实施方式例示出用于将本发明的技术上的思想具体化的装置、方法，对于本发明的技术上的思想而言，构成构件的组合等不特定于下述内容。本发明的技术上的思想可以在专利权利要求书中附加各种变更。

实施方式的阳离子交换层析载体具备基材、和被固定于基材的共聚物。共聚物的单体单元中的一个至少具有磺酸基。共聚物实质上不形成交联结构、并且共聚物不含有或者在实质上不造成影响的范围内含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物作为单体单元。另外，作为共聚物的质量与基材的质量的比率的接枝率为5％以上且200％以下，磺酸基的密度高于30毫摩尔/l且为200毫摩尔/l以下。

实施方式的阳离子交换层析载体例如用于含有杂质的生理活性物质的纯化。生理活性物质例如指的是抗体蛋白质的单体。杂质例如指的是抗体蛋白质的二聚体以上的聚集体。

作为生理活性物质的一例的抗体蛋白质如生物化学中的通常定义那样，为作为脊椎动物的感染防御机构的b淋巴细胞所产生的糖蛋白分子(也称为γ球蛋白或免疫球蛋白)。例如用实施方式的阳离子交换层析载体纯化的抗体蛋白质作为人的药物使用，具有与处于作为给药对象的人的体内的抗体蛋白质实质上相同的结构。

抗体蛋白质可以为人抗体蛋白质、也可以为源自人以外的牛和小鼠等哺乳动物的抗体蛋白质。或者，抗体蛋白质可以为与人igg的嵌合抗体蛋白质、和人源化抗体蛋白质。与人igg的嵌合抗体蛋白质指的是可变区源自小鼠等人以外的生物、而其它恒定区置换为源自人的免疫球蛋白的抗体蛋白质。另外，人源化抗体蛋白质指的是可变区中、互补性决定区(complementarity-determiningregion：cdr)源自人以外的生物，而其它的框架区(frameworkregion：fr)源自人的抗体蛋白质。人源化抗体蛋白质与嵌合抗体蛋白质相比，免疫原性进一步降低。

对于作为实施方式的阳离子交换层析载体的纯化对象的一例的抗体蛋白质的类型(class)(同种型(isotype))和亚型(subclass)没有特别限定。例如抗体蛋白质根据恒定区的结构不同而分类为igg、iga、igm、igd和ige这五种类型。但是，成为实施方式的阳离子交换层析载体的纯化对象的抗体蛋白质可以为五种类型中的任意种。另外，人抗体蛋白质中，igg存在igg1～igg4这四种亚型，iga存在iga1和iga2这两种亚型。但是，成为实施方式的阳离子交换层析载体的纯化对象的抗体蛋白质的亚型可以为任意种。需要说明的是，在fc区域结合蛋白质而成的fc融合蛋白质等抗体相关蛋白质也能够包含于成为实施方式的阳离子交换层析载体的纯化对象的抗体蛋白质。

进而，抗体蛋白质也可以根据来源而分类。但是，成为实施方式的阳离子交换层析载体的纯化对象的抗体蛋白质可以为天然的人抗体蛋白质、利用基因重组技术制造的重组人抗体蛋白质、单克隆抗体蛋白质、和多克隆抗体蛋白质中的任意种。这些抗体蛋白质中，作为成为实施方式的阳离子交换层析载体的纯化对象的抗体蛋白质，从作为抗体药物的需要、重要性的观点考虑，优选为人igg，但是不限于此。

实施方式的阳离子交换层析载体适于流通纯化。流通指的是意图在于不将目的的生理活性物质捕捉于载体而使其透过的纯化方法。例如，抗体蛋白质的单体为目的物、抗体蛋白质的聚集体为杂质的情况下，抗体蛋白质单体不吸附于载体而透过、抗体蛋白质的聚集体吸附于载体。此时，抗体蛋白质的单体也可以被吸附于载体，但是抗体蛋白质的聚集体进一步选择性地被载体吸附，由此抗体蛋白质的单体被纯化。

对于实施方式的阳离子交换载体所具备的基材的形状没有特别限定，若为膜状则通常能够以高流速进行处理。作为膜的形状，可列举出中空纤维状、平膜状、无纺布状、整体式多孔体(monolith)、毛细管、烧结体、圆板和圆筒状等。另外，材料也不受特别限定，但是优选由聚烯烃系聚合物、聚酰胺(尼龙)、聚酯、聚醚砜、或纤维素等构成。

作为聚烯烃系聚合物，可列举出例如乙烯、丙烯、丁烯和偏二氟乙烯等的烯烃均聚物，该烯烃的两种以上的共聚物，或者一种或两种以上的烯烃与全卤化烯烃的共聚物等。作为全卤化烯烃，可列举出四氟乙烯和/或氯三氟乙烯等。它们之中，从机械的强度优异并且得到蛋白质等夹杂物的高吸附容量的观点考虑，优选为聚乙烯或聚偏二氟乙烯。另外，作为聚酰胺，不受特别限定，可列举出尼龙6(ε-己内酰胺的缩聚体)、尼龙11(十一烷内酰胺的缩聚体)、尼龙12(十二烷内酰胺的缩聚体)、尼龙66(六亚甲基二胺与己二酸的共缩聚物)、尼龙610(六亚甲基二胺与己二酸的共缩聚物)、尼龙6t(六亚甲基二胺与对苯二甲酸的共缩聚物)、尼龙9t(壬二胺与对苯二甲酸的共缩聚物)、尼龙m5t(甲基戊烷二胺与对苯二甲酸的共缩聚物)、尼龙621(己内酰胺与十二烷内酰胺的共缩聚物)、对苯二胺与对苯二甲酸的共缩聚物、以及间苯二胺与间苯二甲酸的共缩聚物等。作为聚酯，不受特别限定，可列举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸1,3-丙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸丁二醇酯等。

基材例如具有多个细孔。对于细孔直径没有特别限定，基材为中空纤维状的情况下例如为5nm以上且1000nm以下、优选为10nm以上、更优选为50nm以上、进一步优选为100nm以上、特别优选为150nm以上、或者400nm以上。另外，从基材膜表面积的观点考虑，细孔直径优选为900nm以下、更优选为800nm以下、进一步优选为700nm以下、特别优选为650nm以下。若细孔直径为5nm以上则存在可以分离的抗体蛋白质的分子量增大的倾向。另外若细孔直径为1000nm以下则该膜状基材的表面积增大，存在杂质的结合容量也增大的倾向。

需要说明的是，基材为平膜状、无纺布状的情况下，使用该阳离子交换层析载体时，能够使用支承体、能够进行层叠来使用，因此细孔直径的优选范围变宽。因此，基材为平膜状、无纺布状的情况下，细孔直径的优选范围为10nm以上且1mm以下、优选为100nm以上、更优选为200nm以上、进一步优选为300nm以上。另外从表面积的观点考虑，细孔直径优选为500μm以下、更优选为300μm以下、进一步优选为100μm以下。

实施方式的阳离子交换层析载体具备利用接枝聚合法而以共价键合固定于基材的共聚物。作为接枝聚合法，可列举出辐射线接枝聚合法、表面活性自由基聚合法。

通过辐射线接枝聚合法在基材表面固定共聚物的情况下，为了在基材生成自由基，可以采用任意手段，但是若对于基材照射电离性辐射线则在基材整体生成均匀的自由基，所以优选。作为电离性辐射线的种类，可以利用γ射线、电子束、β射线和中子射线等，但是对于工业规模的实施而言优选为电子束或γ射线。电离性辐射线由钴60、锶90和铯137等放射性同位素，或者通过x射线拍摄装置、电子束加速器和紫外线照射装置等得到。

电离性辐射线的照射剂量优选为1kgy以上且1000kgy以下、更优选为2kgy以上且500kgy以下、进一步优选为5kgy以上且200kgy以下。照射剂量为1kgy以上时，存在容易均匀地生成自由基的倾向。另外，从膜状基材的物理上的强度的观点考虑，照射剂量为1000kgy以下为宜。

利用电离性辐射线的照射进行的接枝聚合法通常大致分为：在基材生成自由基后、接着使自由基与反应性化合物接触的前照射法；和，在使基材与反应性化合物接触的状态下在基材生成自由基的同时照射法。实施方式中，任意方法都能够适用，但是优选为低聚物的生成少的前照射法。在此所称的低聚物指的是游离低聚物。游离低聚物不会被引进到接枝链中，因此优选不生成。

对于实施方式中用于共聚物的聚合时的溶剂，若可以均匀地溶解反应性化合物则没有特别限定。作为这种溶剂，可列举出例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等醇类，二乙基醚、四氢呋喃等醚类，丙酮、2-丁酮等酮类，水、或它们的混合物等。

被固定于实施方式的阳离子交换层析载体的基材的共聚物的单体单元中的一个至少具有磺酸基。

通过具有阳离子交换基团的共聚物利用接枝聚合法而固定于基材，存在于接枝链的阳离子交换基团被立体地配置。因此，与仅在基材表面上分布阳离子交换基团的情况相比，能够将吸附对象分子在立体上吸附。由此纯化抗体时，与抗体单体相比分子量大的抗体聚集体，通过与接枝链上的阳离子交换基团多点键合而被选择性地吸附于基材，能够以高纯度得到抗体单体。

抗体纯化工艺中，不仅去除抗体聚集体是重要的、而且去除具有宽范围的pi分布的源自宿主细胞的蛋白质(hcp)等也是重要的，因此利用阳离子交换载体的流通纯化中，优选即使在ph低时也可以纯化。因此，实施方式的阳离子交换层析载体具备作为与羧酸基等弱阳离子交换基团相比，即使在ph低时也带电、可以吸附杂质的强阳离子交换基团的磺酸基。

另外，从与抗体单体相比更牢固地吸附抗体聚集体的选择性的观点考虑，实施方式的阳离子交换层析载体中，共聚物实质上并非交联结构。共聚物实质上并非交联结构的情况下，基材上的共聚物的分子链随着通液而立起，因此抗体聚集体可以在立体上吸附于基材。

在此，实质上并非交联结构包括即使具有交联结构、实质上交联度也低到不会对抗体聚集体的吸附性能造成影响的程度。交联结构通过共聚物包含含有2个以上的聚合性官能团的单体单元、而形成于共聚物内或所邻接的共聚物彼此之间。共聚物实质上并非交联结构的情况下，含有2个以上的聚合性官能团的单体单元在共聚物中的质量比率例如为10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、或0.1％以下，越低越优选。

进而，实施方式的阳离子交换层析载体不含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物作为单体单元、或者在实质上不造成影响的范围内含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物作为单体单元。

共聚物含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物作为单体单元的情况下，共聚物具有温度响应性。因此，若共聚物含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物中的至少任意一种，则存在由于纯化时的温度而杂质去除的性能变化的倾向。与此相对地，为了纯化工序的再现性、稳定性，实施方式的阳离子交换层析载体不含有丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物、或者即使含有也以不会造成影响的范围含有。以不会造成影响的范围含有指的是例如在共聚物的全部单体单元之中、以50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、3％以下、2％以下、或1％以下的质量比率含有丙烯酰胺和/或丙烯酰胺衍生物。

实施方式的阳离子交换层析载体的接枝链的键合率(接枝率)根据基材的密度不同而最合适值有可能不同。基材为聚乙烯时，从吸附容量和立体上的吸附的观点考虑优选为10％以上、更优选为25％以上、进一步优选为30％以上、特别优选为40％以上、50％以上、60％以上、或70％以上。另外，从力学上确保稳定的强度的观点考虑，优选为200％以下、更优选为150％以下、进一步优选为120％以下。接枝率通过下述式(1)表示。

dg(％)＝(w1-w0)/w0×100(1)

在此，w0为导入接枝链之前的基材(例如多孔中空纤维)的质量、w1为导入了接枝链之后的基材的质量。本公开中，接枝率不考虑到由于接枝聚合后的官能团转换所造成的质量变化，通过接枝聚合前后的质量变化来定义。

基材为聚偏二氟乙烯时，聚偏二氟乙烯与聚乙烯相比，密度高，因此合适的接枝率与聚乙烯时不同。基材为聚偏二氟乙烯时，从吸附容量的观点考虑优选为5％以上、更优选为10％以上。另外，从力学上确保稳定的强度的观点考虑，优选为100％以下、更优选为80％以下、进一步优选为70％以下。

另外，接枝链的比率也可以作为阳离子交换层析载体单位体积的接枝链的质量(接枝链密度)表示。此时，从吸附容量等观点考虑，接枝链密度优选为0.03g/ml以上、更优选为0.04g/ml以上、进一步优选为0.05g/ml以上、特别优选为0.06g/ml以上、0.07g/ml以上、0.08g/ml以上、0.09g/ml以上、0.1g/ml以上、0.11g/ml以上、或0.12g/ml以上。从力学上稳定的强度的观点考虑，优选为0.25g/ml以下、更优选为0.20g/ml以下、进一步优选为0.18g/ml以下。本公开中，上述的值由并非制造过程、而是作为最终产物得到的阳离子交换载体的接枝链的量算出。接枝链密度通过下述式(2)表示。

sg(g/ml)＝(w2-w0)/v1×100(2)

在此，w2为作为最终产物得到的阳离子交换层析载体的质量、v1为作为最终产物得到的阳离子交换层析载体的体积。需要说明的是，如上所述，式(1)中，w1为刚接枝聚合之后、进行此后的官能团转换之前的基材的质量。

实施方式的阳离子交换层析载体中的磺酸基的密度的范围高于30毫摩尔/l且为200毫摩尔/l以下。“密度”通常作为阳离子交换层析载体每1升的阳离子交换基团的摩尔数的浓度表示。阳离子交换基团的密度从吸附容量的观点考虑，高于30毫摩尔/l、优选为35毫摩尔/l以上、更优选为40毫摩尔/l以上、进一步优选为50毫摩尔/l以上、60毫摩尔/l以上、70毫摩尔/l以上。另外，若阳离子交换基团密度过高则存在抗体的单体和聚集体的选择性变差的倾向，因此为200毫摩尔/l以下、优选为170毫摩尔/l以下、更优选为150毫摩尔/l以下。

实施方式的阳离子交换层析载体除了磺酸基之外，可以还含有或不含有羧基等弱阳离子交换基团。但是若含有羧基等弱阳离子交换基团则存在由于抗体溶液的ph而阳离子交换体的状态大幅变化的倾向，因此优选实质上不含有羧基等弱阳离子交换基团。实质上不含有弱阳离子交换基团指的是，虽然取决于强阳离子交换基团与弱阳离子交换基团的量比，但是羧酸基密度不足15毫摩尔/l、或不足10毫摩尔/l、或不足5毫摩尔/l。含有羧基的情况下，优选与羧基的密度相比磺酸基的密度高，羧酸基的密度例如为磺酸基的1/2以下、更优选为1/3以下、进一步优选为1/4以下、或进一步优选为1/5以下、特别优选为1/6以下。若处于这种范围内则存在不会受到抗体溶液的ph的微细的变化的影响、容易得到纯化结果的再现性的倾向。

实施方式的阳离子交换层析载体中，从抗体单体和抗体聚集体的选择性的吸附性的观点考虑，共聚物中，优选具有磺酸基的单体单元的摩尔比率比不具有电荷的中性单体单元的摩尔比率小、优选为1/2以下、更优选为1/3以下、进一步优选为1/4以下、特别优选为1/5以下。同样地共聚物中的具有磺酸基的单体单元的质量相对于中性单体单元的质量的比率优选为1/2以下、更优选为1/3以下、进一步优选为1/4以下、特别优选为1/5以下。

同样地从聚集体的选择性的吸附性的观点考虑，作为实施方式的阳离子交换层析载体的合成中的反应溶液的投料组成，优选具有磺酸基的单体或具有磺酸基导入前体的单体的摩尔比率比中性单体的摩尔比率小、优选为1/2以下、更优选为1/3以下、进一步优选为1/4以下、特别优选为1/5以下。同样地具有磺酸基的单体或具有磺酸基导入前体的单体的质量相对于中性单体的质量的比率优选为1/2以下、更优选为1/3以下、进一步优选为1/4以下、特别优选为1/5以下。

作为导入实施方式的阳离子交换基团的方法，不受特别限定，在接枝聚合时，可列举出包含具有磺酸基的单体的方法；包含具有“磺酸基导入前体”的单体进行共聚后、将磺酸基导入前体转换为磺酸基的方法等。

在此所称的“磺酸基导入前体”指的是能够赋予磺酸基的官能团，可列举出例如环氧基等，但是不限定于此。具有“磺酸基导入前体”的单体指的是具有能够赋予磺酸基的官能团的单体。另外，“磺酸基导入前体”能够包含“磺酸基的前体”。“磺酸基的前体”例如指的是在磺酸基附加保护基团而成的基团。作为具有“磺酸基的前体”的单体，可列举出苯基乙烯基磺酸酯等，但是不限定于它们。

作为具有磺酸基的单体单元的例子，可列举出作为具有磺酸的聚合物的结构单元的(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸、乙烯基磺酸、丙烯酰胺叔丁基磺酸、和苯乙烯磺酸等。

作为具有磺酸基导入前体的单体，可列举出苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯等。通过使用甲基丙烯酸缩水甘油酯等至少一部分为甲基丙烯酸衍生物或丙烯酸衍生物的强阳离子交换基团导入前体单体，即使利用表面活性自由基聚合法将具有强阳离子交换基团的单体聚合的情况下，也可以得到充分的聚合速度。

具有磺酸基导入前体的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯的情况下，将甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合后，与亚硫酸钠反应，由此也可以将甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基的一部分或全部转换为磺酸基。通过将环氧基转换为磺酸基，可以提高阳离子交换基团密度。

实施方式的共聚物中的中性单体单元不含有或以实质上不会造成影响的范围含有丙烯酰胺衍生物作为单体单元，除此之外不受特别限定。中性单体单元中存在亲水性单体单元、和疏水性单体单元，哪种都可以含有。

实施方式的阳离子交换层析载体为了通过接枝链进行抗体聚集体等杂质的立体上的吸附，共聚物中的中性单体单元的总质量中的亲水性单体单元的质量的比率优选为50％以上。更优选为60％以上、进一步优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、或者也可以为100％。若亲水性单体的比率多则接枝链在水溶液中立起，存在在立体上容易吸附的倾向。共聚物的中性单体单元中的亲水性单体单元的摩尔比率优选为50％以上、更优选为60％以上、进一步优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、或者也可以为100％。

同样地，从立体上的吸附的观点考虑，作为实施方式的阳离子交换层析载体的合成中的反应溶液的投料组成，中性单体的总质量中的亲水性单体的质量的比率优选为50％以上。更优选为60％以上、进一步优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、或者也可以为100％。投料组成的中性单体中的亲水性单体的摩尔比率优选为50％以上、更优选为60％以上、进一步优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、或者也可以为100％。

作为这种亲水性单体，可列举出丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、丙烯酸2-羟基丙酯、甲基丙烯酸2-羟基丙酯、丙烯酸3-羟基丙酯、甲基丙烯酸3-羟基丙酯、丙烯酸4-羟基丁酯、甲基丙烯酸4-羟基丁酯、丙烯酸2-(二甲基氨基)乙基酯、和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙基酯等(甲基)丙烯酸酯化合物、以及它们的混合物等，优选为甲基丙烯酸2-羟基乙酯和甲基丙烯酸2-羟基丙酯。

另外，通过如上所述将甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基转换为磺酸基后的未反应的环氧基用酸进行处理，可以转换为二醇。此时，含有由环氧基转换的二醇的单体单元为亲水性。通常，未反应的环氧基若使用0.5摩尔/l的硫酸在80℃下进行2小时左右的反应则全部转换为二醇。

共聚物中的中性单体单元可以含有或不含有疏水性单体单元。通过含有疏水性单体单元，与抗体的疏水性相互作用增强，也有可能进一步提高杂质去除效率。

作为这种疏水性单体单元，存在苯乙烯类、烷基丙烯酰胺类、烷基甲基丙烯酰胺类、丙烯酸烷基酯类、和甲基丙烯酸烷基酯类等，但是从力学上的强度的观点考虑，优选为烷基丙烯酰胺类、烷基甲基丙烯酰胺类、丙烯酸烷基酯类、和甲基丙烯酸烷基酯类。关于烷基，若为碳数4以上的直链或支链状的烷基则能够对于抗体实质上表现出疏水性相互作用。

实施方式的得到纯度提高了的生理活性物质的纯化方法为从含有杂质和生理活性物质的混合溶液中纯化生理活性物质的纯化方法，其包括使混合溶液接触上述阳离子交换层析载体。利用实施方式的纯化方法得到的生理活性物质的回收率例如为80％以上。回收率基于下述式(3)算出。

回收率＝(抗体回收量×处理后单体成分纯度)/(抗体处理量×处理前单体成分纯度)(3)

作为实施方式的流通纯化的层析的流动相，利用强酸、强碱以外的缓冲液(buffer)即可，无需有机溶剂。在此，对于缓冲液，具体而言，可列举出磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、和乙酸缓冲液等，若为通常利用的缓冲液则没有特别限定。缓冲液(buffer)浓度为1毫摩尔/l以上且200毫摩尔/l以下、优选2毫摩尔/l以上且100毫摩尔/l以下、更优选5毫摩尔/l以上且70毫摩尔/l以下、进一步优选10毫摩尔/l以上且50毫摩尔/l以下、进一步优选10毫摩尔/l以上且40毫摩尔/l以下、特别优选10毫摩尔/l以上且30毫摩尔/l以下。在此，缓冲液浓度指的是缓冲液的有效成分的浓度。例如若为通常由乙酸和乙酸钠调整的乙酸缓冲液则为乙酸和乙酸钠的总浓度。另外，对于tris缓冲液而言，指的是三羟基甲基氨基乙烷的浓度。需要说明的是，对于如乙酸-tris缓冲液等那样记载的缓冲液，为前者的浓度，对于乙酸-tris而言，若为乙酸、tris-乙酸，则为tris的浓度。

实施方式的缓冲液可以含有或不含有氯化钠等无机盐类。该无机盐类的浓度为0毫摩尔/l以上且100毫摩尔/l以下、优选0毫摩尔/l以上且90毫摩尔/l以下、更优选0毫摩尔/l以上且80毫摩尔/l以下、进一步优选0毫摩尔/l以上且70毫摩尔/l以下、进一步优选0毫摩尔/l以上且60毫摩尔/l以下、进一步优选0毫摩尔/l以上且50毫摩尔/l以下、进一步优选0毫摩尔/l以上且40毫摩尔/l以下、进一步优选0毫摩尔/l以上且30毫摩尔/l以下。但是缓冲液的无机盐类的合适的浓度有可能根据所处理的蛋白质的等电点、尺寸、缓冲液的ph的组合而变化。

若实施方式的缓冲液以电导率这种尺度表示则为0.5ms/cm以上且20ms/cm以下、优选0.5ms/cm以上且15ms/cm以下、更优选0.5ms/cm以上且10ms/cm以下、进一步优选0.8ms/cm以上且8ms/cm以下、进一步优选0.5ms/cm以上且5ms/cm以下、进一步优选0.5ms/cm以上且4ms/以下、进一步优选0.5ms/cm以上且3ms/cm以下。但是缓冲液的合适的电导率有可能根据所处理的蛋白质的等电点、尺寸、与缓冲液的ph的组合而变化。

缓冲液的ph优选为4.0以上且10.0以下、更优选为4.5以上且9.5以下、特别优选为5.0以上且9.0以下。但是缓冲液的合适的ph有可能根据所处理的蛋白质的等电点、尺寸、缓冲液的无机盐类的浓度的组合而变化。

使用了实施方式的阳离子交换层析的流通纯化中的负载抗体溶液时的流速，从纯化效率的观点考虑，每1分钟优选为膜体积的1倍以上、更优选2倍以上、进一步优选3倍以上、或者4倍以上、特别优选5倍以上。另外，从与杂质的接触时间的观点考虑，优选为30倍以下、更优选20倍以下、进一步优选15倍以下、特别优选10倍以下。

使用了实施方式的阳离子交换层析的流通纯化中的含有单体和聚集体的抗体蛋白质的负载量，不受特别限定，相对于载体1ml为100mg以上，从有效地进行纯化等观点考虑，相对于载体1ml优选为500mg以上、更优选为700mg以上、进一步优选为800mg以上、另外进一步优选为900mg以上、特别优选为1g以上。

使用了实施方式的阳离子交换层析的流通纯化中的含有单体和聚集体的抗体蛋白质的浓度例如为2.0mg/ml以上、优选3.0mg/ml以上、更优选4.0mg/ml以上、进一步优选4.5mg/ml以上、更进一步优选5.0mg/ml以上、特别优选5.5mg/ml以上，另外也优选为6.0mg/ml以上、7.0mg/ml以上等。存在抗体蛋白质溶液的浓度越高则纯化效率越高的倾向。

根据使用了实施方式的阳离子交换层析的流通纯化，抗体蛋白质中的聚集体的比率降低50％以上、更优选降低60％以上、进一步优选降低70％以上、特别优选降低80％以上。需要说明的是，抗体蛋白质的聚集体的比率的降低率指的是由将图1所示的层析图的一部分放大而成的图2中的处理前的聚集体成分(1)、(2)的含有率而得到处理后的聚集体成分(1)、(2)的含有率之差，该差除以处理前的聚集体成分(1)、(2)的含有率得到的值的百分率表示。聚集体成分(1)、(2)的各自的含有率如图2所例示地那样，由层析图的峰面积算出。

另外，除了利用实施方式的阳离子交换层析进行的纯化工序之外，通过还与利用阴离子交换层析进行的纯化工序组合，能够进一步提高纯化物的纯度。具体而言，实施方式的流通纯化中，去除具有低于目的物质的pi的杂质的情况下，可以组合利用阴离子交换层析载体进行的纯化。通过将利用实施方式的阳离子交换层析载体进行的纯化工序、和利用阴离子交换层析载体进行的纯化工序组合，可以在保持具有比目的物质pi高的pi的杂质的去除性的状态下达成效率良好的纯化。

具有低于目的物质的pi的杂质不受特别限定，例如存在源自宿主细胞的蛋白质(hcp)、dna、和作为源自亲和层析工序的杂质的蛋白a等。

利用阴离子交换层析载体进行的纯化工序可以在利用阳离子交换层析载体进行的纯化工序之前或之后。

阴离子交换层析载体不受特别限定，若为膜状则能够实现高流速的处理，能够进行效率更良好的纯化工序的构筑。另外，阴离子交换层析载体可以为在基材上具有接枝聚合链的结构。若为在基材上具有接枝聚合物的结构则可以立体地吸附于杂质，因此能够得到更高的杂质去除性。

对于利用阴离子交换层析载体进行的纯化方法不受特别限定，但是若为流通纯化则能够更有效地进行纯化。

对于阴离子交换层析工序中的含有单体和聚集体的抗体蛋白质的负载量，若可以去除杂质则不受特别限定，但是从有效地进行纯化的观点考虑，相对于载体1ml优选为0.2g以上、更优选为0.5g以上、进一步优选为1.0g以上、另外进一步优选为2.0g以上、特别优选为4.0g以上。

在利用阳离子交换层析载体进行的纯化工序和利用阴离子交换层析载体进行的纯化工序之间可以进行缓冲液更换、也可以不进行缓冲液更换。不进行缓冲液更换的情况下，可以更有效地进行纯化。

阳离子交换层析载体中的纯化工序和阴离子交换层析载体中的纯化工序可以连续进行，也可以在先前的工序结束之后，暂时储藏于罐，进行以下的工序。

在利用阳离子交换层析载体进行的纯化工序和利用阴离子交换层析载体进行的纯化工序之间可以进行溶液的ph的调整。通过调整ph，具有前者的处理ph左右的pi的杂质的去除性进一步提高。具体而言，首先利用阳离子交换层析载体进行纯化的情况下，在利用阴离子交换层析载体进行纯化之前，向溶液加入碱，提高溶液的ph，由此杂质带负电，因此利用阴离子交换层析时，可以进一步去除杂质。另外，首先利用阴离子交换层析载体进行纯化的情况下，在利用阳离子交换层析载体进行纯化之前向溶液加入酸，降低溶液的ph，由此杂质带正电，因此利用阳离子交换层析时可以去除的杂质的pi的范围变宽，可以进一步去除杂质。所变化的ph的值若提高杂质去除性则不受特别限定，可以根据成为标的的杂质任意变化。作为ph的变化量的值，可列举出0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、和3.0等，可以为这些值，也可以为各自之间的值。若可以去除杂质则不受特别限定，但是优选的是，若ph变化0.1以上则杂质去除性特别提高。

另外，与ph同样地，在利用阳离子交换层析载体进行的纯化工序和利用阴离子交换层析载体进行的纯化工序之间可以进行溶液的电导率的调整。所变化的电导率的值若杂质去除性提高则不受特别限定，可以根据成为标的的杂质任意变化。作为电导率的变化量的值，可列举出0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、和5.0ms/cm等，可以为这些值，也可以为各自之间的值。

另外，通常抗体纯化中，利用亲和层析进行纯化后，利用离子交换层析工序进行纯化，在利用实施方式的阳离子交换层析进行的纯化工序和阴离子交换层析工序之前，也可以进行亲和层析工序。在亲和层析工序后，通过进行利用上述阳离子交换层析进行的流通纯化和阴离子交换层析工序，由此能够得到纯度更高的目的物。亲和层析载体例如指的是负载有蛋白质a、蛋白质g的载体。亲和层析工序例如以结合并洗脱方式实施。

通过进行利用阳离子交换层析进行的流通纯化和利用阴离子交换层析进行的流通纯化，而不进行亲和层析工序后的含有抗体的洗脱液的缓冲液更换，由此能够有效地进行纯化。作为这种洗脱液，存在含有一元酸作为主要成分的缓冲液，可列举出例如乙酸缓冲液。

通常阴离子交换层析工序中，若使用以多元酸作为主要成分的洗脱缓冲液，则吸附量降低，存在杂质去除性能降低的倾向，因此在亲和层析工序中使用以多元酸作为主要成分的洗脱缓冲液的情况下，优选直至阴离子交换层析以前预先更换缓冲液。因此通过使用以一元酸作为主要成分的洗脱缓冲液进行亲和层析工序的洗脱，能够无需更换缓冲液地、更简便地利用阳离子交换层析工序和阴离子交换层析工序进行纯化。

对于以一元酸作为主要成分的洗脱缓冲液，若能够在亲和层析工序中进行洗脱、在此后的离子交换层析工序中可以去除杂质则不受特别限定，但是优选为乙酸。若洗脱缓冲液为乙酸则即使不进行缓冲液更换等，在此后的工序中也能够容易地调整到所要求的ph。

另外，亲和层析工序的洗脱中使用的洗脱缓冲液不限定于以下，但是从此后的利用阳离子交换层析进行的流通纯化的杂质去除性的观点考虑，电导率优选为10.0ms/cm以下、更优选7.0ms/cm以下、进一步优选5.0ms/cm以下、进一步优选3.0ms/cm以下、特别优选2.5ms/cm以下。从缓冲液浓度的观点考虑，优选为100毫摩尔/l以下、更优选50毫摩尔/l以下、进一步优选40毫摩尔/l以下、更进一步优选30毫摩尔/l以下、特别优选25毫摩尔/l以下。

另外，为了保持洗脱生理活性物质的洗脱池的电导率低，优选在即将进行亲和层析工序的洗脱之前，用电导率低的缓冲液洗涤载体。作为缓冲液，以不会洗脱生理活性物质的方式使ph充分高、电导率充分低即可。通过保持洗脱池的电导率低，在此后的工序中能够容易地调整到所要求的电导率。另外，可以防止生理活性物质的变性、聚集体的生成。

作为这种ph，优选为5.0以上、更优选为6.0以上、进一步优选为7.0以上，作为电导率，优选为10.0ms/cm以下、更优选为7.0ms/cm以下、进一步优选为5.0ms/cm以下、特别优选为3.0ms/cm以下。

另外，也可以在亲和层析工序中的洗脱后，将洗脱液中有可能含有的病毒在酸性(低ph)条件下暴露一定时间，由此进行病毒的灭活。为了灭活病毒，ph优选为4.0以下、优选为3.8以下、进一步优选为3.6以下、另外进一步优选为3.5以下、特别优选为3.4以下。

作为将洗脱液调整到低ph的酸，不受特别限定，可以为强酸或弱酸。但是，从所添加的量可以少、此后的中和操作的简便性的观点考虑，酸优选为强酸。作为这种强酸，可列举出例如盐酸。

实施方式的含有生理活性物质的混合溶液的电导率在包括亲和层析工序、利用低ph处理进行的病毒灭活、阳离子交换层析工序、和阴离子交换层析工序的这一系列工序中，可以总是为10ms/cm以下。若电导率总是为10ms/cm以下则存在容易去除杂质的倾向。电导率可以为9.0以下、优选8.0以下、更优选7.0以下、进一步优选6.0以下、进一步优选5.0以下、进一步优选4.0以下、特别优选3.0以下。

实施例

以下基于实施例对实施方式进行更详细说明，但是它们对实施方式没有任何限定。

(实施例1)

实施例1中，通过辐射线接枝聚合法，制作中空纤维状的阳离子交换膜。

1)阳离子交换膜的制作

将甲基丙烯酸2-羟基乙酯7.07g、甲基丙烯酸缩水甘油酯0.79g溶解于甲醇113ml，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.03g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kgy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液55ml，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到6.13g、接枝率103％的中空纤维膜。

将利用辐射线接枝聚合法导入了接枝链的中空纤维投入到亚硫酸钠、和异丙醇的混合水溶液(亚硫酸钠/异丙醇/纯水＝10/15/75wt％)160g，在80℃下进行20小时反应，将接枝链中的环氧基转换为磺酸基。反应后用纯水洗涤。然后，将该中空纤维投入到0.5摩尔/l硫酸中，在80℃下进行2小时反应，由此将残留于接枝链中的环氧基转换为二醇基。用水和甲醇洗涤后进行真空干燥，得到6.29g的阳离子交换膜1。

利用乙醇将该中空纤维1根(0.419g)湿润，置换为水后，投入到装有水的量筒，通过体积的增加份测定体积，结果为1.4ml。基材膜的质量为0.202g，因此接枝链的质量为0.217g、密度为0.156g/ml。去除水后，加入0.1摩尔/l的氢氧化钠水溶液10ml。放置1小时后，取出氢氧化钠水溶液，加入纯水10ml。进一步放置1小时后，回收纯水，由此回收残留于膜内的氢氧化钠。将所回收的氢氧化钠溶液汇总，利用0.1摩尔/l盐酸进行滴定，结果需要8.88ml。空白(不具有离子交换基团的中空纤维)的滴定中，为10.05ml，因此与氢氧化钠反应的阳离子交换膜所具有的磺酸基的量为140微摩尔(0.000140摩尔)。除以测定其得到的体积而算出的磺酸基的密度为100毫摩尔/l。将所得到的阳离子交换膜1组件化(膜体积0.30ml)，形成实施例1的阳离子交换膜1。

具有磺酸基的单体单元的质量可以由磺酸基的量求出。转换为磺酸基后的甲基丙烯酸缩水甘油酯的分子量为224.23，因此具有磺酸基的单体单元的质量为0.0314g。另外，由反应前后的多孔中空纤维的质量可知每1根中空纤维的接枝链的质量为0.217g。因此，由每1根中空纤维的接枝链的质量、和具有磺酸基的单体单元的质量可知，中性单体单元的质量为0.1856g。由此计算则可知，具有磺酸基的单体单元的质量为中性单体单元的质量的1/5.91。

2)细胞培养液的制造

作为抗体蛋白质，准备含有由cho细胞crl12445表达的人单克隆抗体(以下称为“crl12445抗体”)0.151g/l的培养液上清液。使用过滤膜(asahikaseimedicalco.,ltd制、商品名biooptimal(注册商标)mf-sl)将含有crl12445抗体产生细胞的培养液过滤，获得含有杂质和抗体的抗体溶液(培养上清液)。

3)利用亲和柱进行的抗体蛋白质的纯化

向用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))平衡化了的蛋白a柱(gehealthcarebiosciencesk.k.制、填充有mabselectsure的柱)添加抗体溶液，使抗体蛋白质吸附于蛋白a。接着向柱子流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l的磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))进行洗涤后，向柱子流通洗脱缓冲液(100毫摩尔/l柠檬酸钠(ph3.6))，由蛋白a柱洗脱抗体蛋白质，回收杂质降低了某种程度的抗体溶液。

4)聚集体的制造

向所得到的抗体溶液的一部分加入盐酸，调整到ph2.5，放置一小时。然后，使用氢氧化钠水溶液进行中和，制造含有大量的抗体聚集体的抗体溶液。

5)含有聚集体的抗体溶液的制造

将由蛋白a柱得到的抗体溶液进行缓冲液更换为15毫摩尔/乙酸缓冲液(ph5.0)而成的溶液、和含有大量的聚集体的抗体溶液进行缓冲液更换为15毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph5.0)而成的溶液以任意比率混合，制造含有聚集体的抗体溶液。

6)聚集体量的测定

对于所得到的抗体溶液，通过下述条件，使用尺寸排阻层析(sec：sizeexclusionchromatography)装置测定。

层析柱：acquityyplcbeh200sec1.7μm(waters公司制)

柱温：30℃

系统：acquityuplchclass(waters公司制)

流动相：0.1摩尔/l磷酸氢二钠+0.2摩尔/ll(+)-精氨酸水溶液(用盐酸调整到ph6.7)

其结果得到图1所例示的层析图，其放大图为图2。图2的(1)和(2)出现的峰为抗体的聚集体，(3)出现的峰为单体。由层析图的峰的面积算出的聚集体(1)的比率为2.35％、聚集体(2)的比率为1.92％、单体的比率为95.73％。以下的实施例和比较例中，也将首先出现的聚集体的峰称为聚集体(1)、第二出现的聚集体的峰称为聚集体(2)。

7)聚集体的去除

使含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜1接触。所加入的量为50ml(5.36mg/ml的浓度、抗体蛋白质的总量268mg)、流速为1.5ml/分钟。流通抗体溶液后，以流速1.5ml/分钟使用15毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph5.0)10ml洗涤阳离子交换膜1。通过流通工序和洗涤工序回收60ml的溶液。对于所回收的溶液利用尺寸排阻层析(sec：sizeexclusionchromatography)进行分析，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。

(实施例2)

实施例2中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有30毫摩尔/l的氯化钠的ph5.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为50ml、其浓度为5.56mg/ml。结果如图3所示。

(实施例3)

实施例3中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有50毫摩尔/l的氯化钠的ph5.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例2相同的操作。经过处理的抗体溶液量为40ml、其浓度为5.56mg/ml。结果如图3所示。

(实施例4)

实施例4中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph6.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.70mg/ml。结果如图3所示。

(实施例5)

实施例5中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有10毫摩尔/l的氯化钠的ph6.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.71mg/ml。结果如图3所示。

(实施例6)

实施例6中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有30毫摩尔/l的氯化钠的ph6.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.96mg/ml。结果如图3所示。

(实施例7)

实施例7中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有50毫摩尔/l的氯化钠的ph6.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.91mg/ml。结果如图3所示。

(实施例8)

实施例8中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph7.0的15毫摩尔/ltris缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.69mg/ml。结果如图3所示。

(实施例9)

实施例9中示出对于含有聚集体的抗体，每1ml膜体积处理2g以上的例子。经过处理的抗体溶液的量为120ml、抗体溶液的浓度为5.89，除此之外进行与实施例8相同的操作。结果如图3所示。

(实施例10)

实施例10中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有10毫摩尔/l的氯化钠的ph7.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.57mg/ml。结果如图3所示。

(实施例11)

实施例11中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有30毫摩尔/l的氯化钠的ph7.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为60ml、其浓度为5.67mg/ml。结果如图3所示。

(实施例12)

实施例12中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph8.0的15毫摩尔/ltris缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为50ml、其浓度为5.53mg/ml。结果如图3所示。

(实施例13)

实施例13中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph9.0的15毫摩尔/ltris缓冲液)，除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为50ml、其浓度为5.44mg/ml。结果如图3所示。

(实施例14)

实施例14中，作为抗体蛋白质，准备含有ae6f4抗体(人单克隆抗体)0.172g/l的培养上清液。ae6f4产生细胞由九州大学大学院农学研究院、片仓喜范准教授提供。ae6f4抗体产生细胞的培养参考文献(日本生物工学会讲演要旨集、1994年、65卷、65页)培养。使用过滤膜(asahikaseimedicalco.,ltd制、商品名biooptimal(注册商标)mf-sl)将含有ae6f4抗体产生细胞的培养液过滤，获得含有杂质和抗体的抗体溶液(培养上清液)。

除此之外进行与实施例1相同的操作。经过处理的抗体溶液量为30ml、其浓度为5.92mg/ml。结果如图3所示。

(实施例15)

实施例15中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(含有30毫摩尔/l的氯化钠的ph5.0的15毫摩尔/l柠檬酸缓冲液)，除此之外进行与实施例14相同的操作。经过处理的抗体溶液量为40ml、其浓度为5.66mg/ml。结果如图3所示。

(实施例16)

实施例16中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph6.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与实施例14相同的操作。经过处理的抗体溶液量为30ml、其浓度为5.50mg/ml。结果如图3所示。

(实施例17)

实施例17中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph7.0的15毫摩尔/ltris缓冲液)，除此之外进行与实施例14相同的操作。经过处理的抗体溶液量为40ml、其浓度为5.67mg/ml。结果如图3所示。

(比较例1)

比较例1中，使用以下说明的阳离子交换膜2。阳离子交换膜2如下所述制作。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯3.08g、甲基丙烯酸丁酯1.54g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240ml，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kgy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140ml，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.31g、接枝率77％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，作为弱阳离子交换基团的羧酸的密度为175毫摩尔/l。将其组件化(膜体积0.25ml)，形成比较例1的阳离子交换膜2。

比较例1中，使用阳离子交换膜2，除此之外与实施例1同样地实施。结果如图3所示。

(比较例2)

比较例2中，抗体溶液和洗涤工序使用不同的缓冲液(ph6.0的15毫摩尔/l乙酸缓冲液)，除此之外进行与比较例1相同的操作。结果如图3所示。

(比较例3)

比较例3中，使用以下说明的阳离子交换膜3。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯7.72g、甲基丙烯酸缩水甘油酯0.13g溶解于甲醇113ml，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.03g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kgy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液55ml，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到6.09g、接枝率101％的中空纤维膜。此后与实施例1同样地导入磺酸基，得到阳离子交换膜8。磺酸基密度为22毫摩尔/l。

使用阳离子交换膜3，此后与实施例1同样地进行聚集体去除的评价。结果如图3所示。

(比较例4)

比较例4中，使用以下所示的强阳离子交换基团和弱阳离子交换基团的总计为高于30毫摩尔/l的密度，但是主要成分为弱阳离子交换基团主体的阳离子交换膜4。阳离子交换膜4如下所述合成。将n-异丙基丙烯酰胺3.09g、甲基丙烯酸丁酯1.29g、甲基丙烯酸缩水甘油酯0.51g、甲基丙烯酸叔丁酯0.26g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240ml，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kgy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140ml，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.12g、接枝率71％的阳离子交换膜前体。

将通过辐射线接枝聚合法导入有接枝链的中空纤维投入到亚硫酸钠和ipa的混合水溶液(亚硫酸钠/ipa/纯水＝10/15/75wt％)200g，80℃下进行24小时反应，接枝链中的环氧基转换为磺酸基。反应后，用纯水洗涤该中空纤维。然后，将该中空纤维投入到0.5摩尔/l硫酸中，80℃下进行2小时反应，由此残留于接枝链中的环氧基转换为二醇基。进而，在140ml的氯仿中，与4ml的甲磺酸反应，将叔丁基脱保护，转换为羧基。用与实施例1相同的方法，测定全部阳离子交换基团量和膜体积，结果分别49微摩尔/l和1.0ml。由此全部阳离子交换基团密度为49毫摩尔/l。

磺酸基密度通过以下的方法求出。浸渍于1摩尔/l的盐酸1小时，将磺酸全部氢化。用纯水洗涤，去除盐酸后，加入1摩尔/l氯化钠水溶液10ml，溶出氯化氢。放置1小时后，回收含有氯化氢的氯化钠水溶液。进而加入1摩尔/l氯化钠水溶液10ml，放置1小时，进行回收，由此回收残留于膜内的氯化氢。将回收物合并，使用0.01摩尔/l氢氧化钠水溶液进行滴定，结果中和需要2.09ml。空白为0.29ml，因此可知膜所具有的磺酸基为18毫摩尔。羧基可以通过由全部阳离子交换基团密度减去磺酸基密度来求出，为31毫摩尔/l。

使用阳离子交换膜4，此后与实施例1同样地进行聚集体去除的评价。结果如图3所示。

(实施例18)

实施例18中，使用图4所示的单体的投料组成，除此之外使用与实施例1相同的条件，分别制作磺酸基密度不同的阳离子交换膜5～13。图4也示出合成后的接枝率、磺酸基密度、具有磺酸基的单体单元质量/不具有电荷的单体单元质量、和接枝链密度。随着接枝率增加、膜体积也由于膨胀而增大，因此接枝率高、但是接枝密度未必高。

(实施例19)

实施例19中，使用实施例18中制作的阳离子交换膜5～13。对于阳离子交换膜5～8，使用ph5.0的抗体溶液，进行与实施例1相同的操作，对于阳离子交换膜9～13，使用ph6.0的抗体溶液，进行与实施例4相同的操作。结果如图5所示。

(实施例20)

实施例20中，合成以下所示的阳离子交换膜14，使用阳离子交换膜14，除此之外与实施例17同样地使用ae6f4抗体，进行聚集体去除的评价。制作阳离子交换膜14时，将甲基丙烯酸2-羟基丙酯10.9g、甲基丙烯酸缩水甘油酯0.87g溶解于甲醇109ml，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.02g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kgy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液55ml，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到6.10g、接枝率102％的中空纤维膜。然后与实施例1同样地导入磺酸基，得到阳离子交换膜14。磺酸基密度为78毫摩尔/l。另外具有磺酸基的单体单元质量/中性单体单元质量为1/9.18、接枝链密度为0.160g/ml。

使用阳离子交换膜14，除此之外与实施例17同样地进行聚集体去除的评价。结果如图6所示。

(实施例21)

实施例21中，合成以下所示的阳离子交换膜15，使用阳离子交换膜15，除此之外与实施例17同样地使用ae6f4抗体，进行聚集体去除的评价。制作阳离子交换膜15时，将甲基丙烯酸缩水甘油酯0.98g溶解于甲醇119ml，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.02g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kgy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液55ml，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到3.47g、接枝率15％的中空纤维膜。然后与实施例1同样地导入磺酸基，得到阳离子交换膜15。磺酸基密度为53毫摩尔/l。另外具有磺酸基的单体单元质量/中性单体单元质量的比率为1/1.50、接枝链密度为0.038g/ml。另外，具有磺酸基的单体单元与中性单体单元的摩尔比率为1/3.2。

使用阳离子交换膜15，除此之外与实施例17同样地进行聚集体去除的评价。结果如图6所示。

(实施例22)

实施例22中，使用阳离子交换膜1，使用15毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph5.0)、15毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph6.0)、15毫摩尔/ltris缓冲液(ph7.0)的抗体溶液，对于crl12445抗体分别不仅评价聚集体的去除性，还评价hcp和proteina的去除性。

hcp使用cygnustechnologies公司的chinesehamsterovaryhostcellproteins-3^rdgenerationelisakit，蛋白a使用thchnologies公司的proteinaelisakit，通过uv测定进行定量。作为相对于抗体的质量的质量以ppm表示。

结果如图7所示。

(实施例23)

实施例23中，使用crl12445抗体，不进行缓冲液更换地实施亲和层析工序、阳离子交换层析工序、和阴离子交换层析工序这一系列的工序。

(亲和层析工序)

实施例23的亲和层析工序中，以流速20ml/分钟进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))150ml将填充有mabselectsure58ml的柱子平衡化，添加含有crl12445抗体的培养上清液，吸附抗体1.22g。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))300ml，进而流通tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/l(ph8.0))180ml进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph3.4)300ml，由柱子洗脱抗体。仅采集抗体洗脱的级分。向洗脱液中加入1摩尔/ltris缓冲液，将ph调整为6.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有1.7ms/cm的电导率。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换层析工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为1.35％、聚集体(2)的比率为0.77％、单体的比率为97.87％。另外，hcp的含量为230ppm、蛋白a的含量为3ppm。结果如图8所示。

(阳离子交换层析工序)

实施例23的阳离子交换层析工序中，使用阳离子交换膜1(体积：0.3ml)。施加到阳离子交换膜1的抗体溶液的量为50ml(6.5mg/ml的浓度)、流速为1.8ml/分钟。向阳离子交换膜1流通抗体溶液后，以流速1.8ml/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(ph6.0)12ml，洗涤阳离子交换膜1。通过流通工序和洗涤工序回收60ml的溶液。重复相同的操作2次，将所回收的溶液通过尺寸排阻层析(sec：sizeexclusionchromatography)和elisa进行分析，结果聚集体成分、hcp和蛋白a的含量减少。结果如图8所示。

(阴离子交换层析工序)

实施例23的阴离子交换层析工序中，使用体积0.25ml的阴离子交换膜(qyuspeedd、asahikaseimedicalco.,ltd)。向阳离子交换层析工序中回收的抗体溶液中加入1摩尔/l的tris缓冲液，使ph为7.8，结果电导率为1.7ms/cm。然后使抗体溶液与qyuspeedd接触。加入到qyuspeedd的抗体溶液的量为165ml(4.5mg/ml的浓度)、流速为1.5ml/分钟。在qyuspeedd流通抗体溶液后，以流速1.5ml/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(ph7.8)10ml，洗涤qyuspeedd。通过流通工序和洗涤工序回收总计175ml的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻层析(sec：sizeexclusionchromatography)和elisa进行分析，结果聚集体成分、hcp和蛋白a的含量减少。结果如图8所示。

(实施例24)

实施例24中，使用crl12445抗体，不进行缓冲液更换地实施亲和层析工序、利用低ph进行的病毒灭活工序、阳离子交换层析工序、和阴离子交换层析工序这一系列的工序。

(亲和层析工序)

实施例24的亲和层析工序中，以流速20ml/分钟进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))150ml将填充有mabselectsure58ml的柱子平衡化，添加含有crl12445抗体的培养上清液，吸附抗体1.22g。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))300ml，进而流通tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/l(ph8.0))180ml进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph3.4)300ml，由柱子洗脱抗体。仅采集抗体洗脱的级分。向所得到的抗体溶液中加入1摩尔/l的盐酸、使ph为2.7，静置2小时实施病毒灭活处理。然后加入1摩尔/ltris缓冲液，将ph调整为6.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有2.7ms/cm的电导率，作为后述的阳离子交换层析工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为1.70％、聚集体(2)的比率为1.89％、单体的比率为96.41％。另外，hcp的含量为307ppm、蛋白a的含量为3ppm。结果如图8所示。

(阳离子交换层析工序)

实施例24的阳离子交换层析工序中，使用阳离子交换膜1(体积：0.72ml)。施加到阳离子交换膜1的抗体溶液的量为125ml(7.2mg/ml的浓度)、流速为4.4ml/分钟。向阳离子交换膜1流通抗体溶液后，以流速4.4ml/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(ph6.0)15ml，洗涤阳离子交换膜1。通过流通工序和洗涤工序回收135ml的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻层析(sec：sizeexclusionchromatography)和elisa进行分析，结果聚集体成分、hcp和蛋白a的含量减少。结果如图8所示。

(阴离子交换层析工序)

实施例24的阴离子交换层析工序中，使用体积0.25ml的阴离子交换膜(qyuspeedd、asahikaseimedicalco.,ltd)。向阳离子交换层析工序中回收的抗体溶液中加入1摩尔/l的tris缓冲液，使ph为8.0，结果电导率为2.7ms/cm。然后使抗体溶液与qyuspeedd接触。加入到qyuspeedd的抗体溶液的量为132ml(5.6mg/ml的浓度)、流速为1.5ml/分钟。在qyuspeedd流通抗体溶液后，以流速1.5ml/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(ph8.0)10ml，洗涤qyuspeedd。通过流通工序和洗涤工序回收总计142ml的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻层析(sec：sizeexclusionchromatography)和elisa进行分析，结果聚集体成分、hcp和蛋白a的含量减少。结果如图8所示。

(实施例25)

实施例25中，在阴离子交换层析工序中使用体积0.18ml的mustangq(pallcorporation)，以流速0.9ml/分钟进行处理，除此之外进行与实施例24相同的操作。结果如图8所示。

(实施例26)

实施例26中，使用crl12445抗体，在亲和层析工序和利用低ph的病毒灭活工序后，在阳离子交换层析载体和阴离子交换层析载体直接流通，在阳离子交换层析工序与阴离子交换层析工序之间不进行ph调整地实施。

(亲和层析工序)

实施例26的亲和层析工序中，以流速20ml/分钟进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))150ml将填充有mabselectsure58ml的柱子平衡化，添加含有crl12445抗体的培养上清液，吸附抗体1.35g。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/l磷酸钠+150毫摩尔/lnacl(ph8.0))300ml，进而流通tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/l(ph8.0))180ml进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/l乙酸缓冲液(ph3.4)300ml，由柱子洗脱抗体。仅采集抗体洗脱的级分。向所得到的抗体溶液中加入1摩尔/l的盐酸、使ph为2.7，静置2小时实施病毒灭活处理。然后加入1摩尔/ltris缓冲液，将ph调整为5.0。该抗体溶液的组成如图9所示。进而除了ph5.0之外，还得到调整到6.0、7.0、和8.0的抗体溶液。所得到的抗体溶液分别为7.1mg/ml、7.1mg/ml、7.1mg/ml、7.0mg/ml的浓度、具有2.6、2.7、2.7、2.7ms/cm的电导率，作为后述的离子交换层析工序中使用的抗体溶液。

(离子交换层析工序)

实施例26的离子交换层析工序中，将体积0.30ml的阳离子交换膜1、和体积0.25ml的阴离子交换膜(qyuspeedd、asahikaseimedicalco.,ltd)串联连接来使用。以流速1.5ml/分钟流通亲和层析工序后的各ph的抗体溶液后，使用组成与抗体溶液相同的缓冲液15ml以流速1.5ml/分钟进行洗涤。纯化结果如图9所示。