用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定的制作方法

文档序号：18323246发布日期：2019-08-03 10:42阅读：716来源：国知局

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序列表

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本文描述的技术涉及用于确定神经毒素(例如肉毒杆菌毒素)的活性的方法和组合物。

背景技术：

肉毒杆菌神经毒素(bont)是一种由于生物恐怖主义问题以及治疗应用而受到关注的试剂。传统上，通过大剂量地向小鼠施用导致它们死亡的样品来进行bont的检测和表征。已经探索了可以用细胞或在体外进行的测定，但是受到缺乏灵敏度或特异性的影响，经常由于与临床样品的常见组分反应而引起阳性信号。

技术实现要素：

本文描述了经开发用于检测和测量体外和体内bont活性的新测定法。该测定使用独特的单链多肽，其特征在于例如通过bont的底物来连接的分裂荧光素酶，所述bont的底物被工程化以用作bont活性的传感器。在bont存在下，接头区域被毒素切割，导致荧光素酶活性降低，这很容易检测到。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其从n-末端到c-末端包含：a)报告蛋白的n-末端片段；b)包含神经毒素切割位点的接头；c)报告蛋白的c-末端片段；其中n-末端和c-末端片段共同包含功能性报告蛋白序列；并且其中接头在功能上连接n-末端片段和c-末端片段以产生功能性报告融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，报告蛋白是荧光素酶蛋白。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)n-末端结构域，其包含与seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有至少90％序列同一性的序列(n-nano1-159)；b)包含位于n-nano1-159的c-末端的神经毒素切割位点的接头；c)具有seqidno：1荧光素酶的氨基酸160-170至少90％序列同一性的序列的c-末端结构域(c-nano160-170)，其位于接头的c-末端；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何实施方案的一个方面，本文描述了单链多肽，其包含：a)n-末端结构域，其包含相对于seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有少于10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列(n-nano1-159)；b)包含位于n-nano1-159的c-末端的神经毒素切割位点的接头；c)相对于seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170具有少于3个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列的c-末端结构域(c-nano160-170)，其位于接头的c-末端；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何方面的一些实施方案中，n-末端结构域具有seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159的序列(n-nano1-159)并且c-末端结构域具有seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170的序列(c-nano160-170)。在任何方面的一些实施方案中，神经毒素切割位点是肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)和/或破伤风神经毒素切割位点。

在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于bont切割位点与n-末端片段或结构域之间、神经毒素切割位点与结构域的c-末端片段之间或其组合的一个或多个间隔区。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含bont和/或破伤风神经毒素的受体的结合片段。在任何方面的一些实施方案中，结合片段位于n-末端片段或结构域与bont切割位点之间。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于结合片段与bont切割位点之间的间隔区。在任何方面的一些实施方案中，至少一个间隔区由甘氨酸和丝氨酸组成。在任何方面的一些实施方案中，至少一个间隔区是5至15个氨基酸。在任何方面的一些实施方案中，至少一个间隔区选自seqidno：4-9。

在任何方面的一些实施方案中，bont是a、e、c、b、d、f或g。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点来自snare蛋白。在任何方面的一些实施方案中，snare蛋白是snap-25、突触小泡蛋白(vamp)或突触融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点是人snap-25b的氨基酸141-206。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点是人vamp1的氨基酸35-96。在任何方面的一些实施方案中，受体是人sv2c。在任何方面的一些实施方案中，结合片段是人sv2c的氨基酸529-566，或与人sv2c的氨基酸529-566具有至少90％同一性的序列，或相对于人sv2c的氨基酸529-566，具有不超过10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列。

在任何方面的一些实施方案中，多肽还包含多组氨酸亲和标签。在任何方面的一些实施方案中，多组氨酸亲和标签位于多肽的c-末端。

在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于n-末端片段或结构域与bont切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。在任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶多肽是萤火虫荧光素酶(例如，北美萤火虫(photinuspyralis))，细菌荧光素酶(例如，费氏弧菌(vibriofischeri)，哈维氏弧菌(vibrioharveyi))，海肾萤光素酶(海洋腔肠(renillareniformis))，甲藻萤光素酶，长腹水蚤(gaussia)荧光素酶或桡足类荧光素酶。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于第二荧光素酶多肽与bont切割位点之间的间隔区。在任何方面的一些实施方案中，间隔区为5至15个氨基酸。在任何方面的一些实施方案中，间隔区是gssggggsggggssg(seqidno：4)，gssggggsgggssg(seqidno：5)或ggggs(seqidno：6)。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)第一个5至15个氨基酸的间隔区；ii)位于第一个间隔区c-末端的由sv2c的氨基酸529-566组成的结合片段；iii)位于结合片段c-末端的第二个间隔区；iv)位于第二间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人snap25b的氨基酸141-206；v)位于bont切割位点的c-末端的5至15个氨基酸的第三个间隔区；c)位于接头的c-末端的seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)5至15个氨基酸的第一间隔区；ii)位于第一间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人snap25b的氨基酸141-206；iii)位于bont切割位点的c-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区；c)位于接头的c-末端的seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)第一个5至15个氨基酸的间隔区；ii)位于第一间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人vamp1的氨基酸35-96；iii)位于bont切割位点c-末端的5-15个氨基酸的第二个间隔区；c)位于接头的c-末端的seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)第二功能性荧光素酶多肽；ii)位于第二荧光素酶多肽c-末端的5-15个氨基酸的第一间隔区；iii)位于第一间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人snap25b的氨基酸1-206；iv)位于bont切割位点的c-末端的第二个5至15个氨基酸的间隔区；c)位于接头的c-末端的seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何方面的一些实施方案中，一个或多个间隔区是gssggggsggggssg(seqidno：4)，gssggggsgggssg(seqidno：5)或ggggs(seqidno：6)。在任何方面的一些实施方案中，多肽还包含位于c-末端的his6序列(seqidno：12)。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是包含编码本文所述单链多肽的核苷酸序列的核酸。在任何实施方案的一个方面，本文描述了核酸载体，其包含核酸，所述核酸包含编码本文所述单链多肽的核苷酸序列。在任何方面的一些实施方案中，载体是表达载体并且包含可表达形式的核酸序列。在任何方面的一些实施方案中，载体选自由病毒表达载体、原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体组成的组。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是包含前述段落的核酸或载体的细胞。在任何方面的一些实施方案中，细胞表达如本文所述的单链多肽。在任何方面的一些实施方案中，细胞是原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。

在任何实施方案的一个方面，本文描述了用于确定肉毒杆菌神经毒素效力的方法，包括：在适合于bont活性的条件下，将神经毒素与本文所述的单链多肽接触；与参考相比，确定多肽的荧光素酶活性，从而确定效力。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是用于检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：在适合于bont活性的条件下使样品与如本文所述的单链多肽接触；与在不存在样品的情况下多肽的荧光素酶活性相比，确定多肽的荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低表明样品中的bont活性。

在任何方面的一些实施方案中，体外进行该方法。在任何方面的一些实施方案中，接触发生在50mmhepes，20μmzncl2，2mmdtt，1mg/mlbsa，ph7.1的缓冲液中。在任何方面的一些实施方案中，与样品接触的单链多肽的浓度为约30nm至300nm。在任何方面的一些实施方案中，与样品接触的单链多肽的浓度为约30nm。

在任何方面的一些实施方案中，通过向单链多肽添加荧光素酶底物并定量测量产生的发光信号来确定荧光素酶活性。在任何方面的一些实施方案中，所述条件包括在约37℃下孵育约1小时至约36小时的时间。在任何方面的一些实施方案中，所述条件包括在约37℃下孵育约1小时至约24小时的时间。在任何方面的一些实施方案中，所述条件包括在约37℃下孵育约4小时至约24小时的时间。

在任何方面的一些实施方案中，接头包含5至15个氨基酸的第一间隔区，位于第一间隔区的c-末端和bont切割位点的n-末端的人sv2c的氨基酸529-566的结合片段，和位于bont切割位点c-末端的5-15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人snap25的氨基酸141-206。在任何方面的一些实施方案中，接头包含位于bont切割位点n-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，和位于bont切割位点c-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人snap25的氨基酸141-206。在任何方面的一些实施方案中，接头包含位于bont切割位点n-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，位于bont切割位点c-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人vamp1的氨基酸35-96。

在任何方面的一些实施方案中，单链多肽由神经元细胞表达，并且该方法在接触步骤后进一步包括：将神经元细胞孵育约12小时至约60小时的时间并从神经元细胞中收集裂解物。

在任何实施例的一个方面，本文描述了一种用于检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)使样品与表达单链多肽的神经元细胞接触，所述单链多肽包含：seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)，seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)，其通过接头分离和功能性连接，所述接头位于n-nano1-159的c-末端和c-nano160-170的n-末端，包含bont切割位点；b)将神经元细胞孵育约12小时至约60小时的时间；c)从神经元细胞中收获裂解物；和d)与在不存在样品的相同处理的神经元细胞中的荧光素酶活性相比，测量裂解物中荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低表明样品中的bont活性。

在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于n-nano1-159和切割位点之间的完整的第二荧光素酶多肽。在任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶多肽萤火虫荧光素酶(北美萤火虫(photinuspyralis))，细菌荧光素酶(费氏弧菌(vibriofischiri)，哈维氏弧菌(vibrioharveyi))，海肾萤光素酶(海洋腔肠(renillareniformis))，甲藻萤光素酶，长腹水蚤(gaussia)荧光素酶或桡足类荧光素酶。在任何方面的一些实施方案中，测定样品中第二荧光素酶多肽的荧光素酶活性，并用作收获的裂解物中存在的总单链多肽的指示物。在任何方面的一些实施方案中，神经元细胞表达来自病毒表达载体的单链多肽。在任何方面的一些实施方案中，单链多肽在步骤a)之前表达6天。在任何方面的一些实施方案中，病毒表达系统是慢病毒表达系统。

在任何方面的一些实施方案中，孵育步骤为约48小时。在任何方面的一些实施方案中，收获步骤是通过添加裂解缓冲液。

在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点来自snap-25、突触小泡蛋白(vamp)或突触融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点被bonta、e和c特异性识别，或者被bontb、d、f和g特异性识别。在任何方面的一些实施方案中，使用具有不同bont切割位点的单链多肽的组合。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点是人snap-25的a.a.141-206，或人vamp1的

a.a.35-96，人snap35的a.a.1-206，或vamp1的a.a.1-96。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含bont受体的结合片段。在任何方面的一些实施方案中，受体是sv2c。在任何方面的一些实施方案中，结合片段包含人sv2c的氨基酸529-566。

在任何方面的一些实施方案中，接头包含第二荧光素酶多肽，位于第二荧光素酶多肽的c-末端和bont切割位点的n-末端的5-15个氨基酸的第一间隔区，位于bont切割位点c-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人snap25的氨基酸1-206，并位于第一个间隔区的c-末端。

在任何方面的一些实施方案中，荧光素酶活性的测量通过添加对荧光素酶特异的底物和定量检测所得发光信号来实现。在任何方面的一些实施方案中，seqidno：1的荧光素酶的底物是腔肠素类似物(2-呋喃基甲基-脱氧-腔肠素)。

在一个方面，本文描述了试剂盒，其包含：a)如本文所述的一种或多种单链多肽，其中单链多肽中的每一种或其组合包装在单独的容器中；b)如本文所述的一种或多种核酸或核酸载体，其中核酸或核酸载体中的每一种或其组合包装在单独的容器中；和/或c)如本文所述的一种或多种细胞，其中每种细胞或细胞的组合包装在单独的容器中。在任何方面的一些实施方案中，所述试剂盒还包含包装在单独容器中的荧光素酶底物。

附图说明

图1描绘了基于分裂荧光素酶的毒素传感器的示意图。左图：nanoluc^tm荧光素酶分为两个互补片段，n-nano和c-nano。这两个片段通过基于毒素底物(snap-25(也称为p25)或vamp1/2/3(例如，突触小泡蛋白))的接头连接在一起。右图：通过bont切割接头区域将nanoluc^tm荧光素酶的两部分分开并消除发光信号。

图2a-图2b展示了bont/a的体外检测测定。设计并研究了两种传感蛋白用于bont/a毒素检测。一个是nnano-sv2c-l4-p25-cnano而另一个是nnano-p25-cnano。它们以30ul的体积以30nm制备，而bont/a以因数10从1nm稀释至1fm。阴性对照是在传感蛋白质溶液中添加的bont/b。基于nanoluc^tm荧光素酶的发光百分比绘制曲线(图2a)。在37℃下，对于bont/a使用nnano-sv2c-p25-cnano的ec50在4h后为9.73pm，24h后为7.86pm，同时使用nnano-p25-cnano的ec50在4h后为48.26pm，24h后为35.87pm。含有作为bont/a结合结构域的sv2c-l4的传感蛋白质显示出ec50的约5倍增加(图2b)。

图3a-图3b显示了4h和24h后bont/b的体外检测测定。传感蛋白nnano-vamp1-cnano以30ul的体积以30nm制备，而bont/a以因数10从10nm稀释至1fm。阴性对照是在传感蛋白质溶液中添加的bont/a。基于nanoluc^tm荧光素酶的发光百分比绘制曲线(图3a)。在37℃下，bont/b的ec50在4h后为75.7pm，24h后为3.9pm(图3b)。

图4显示了使用病毒感染的神经元细胞的bont/a的体内检测测定。对于每个神经元细胞裂解物样品，测量萤火虫和nanoluc^tm荧光素酶信号并计算比率(nanoluc^tm/萤火虫)。然后，使用无毒素暴露作为参考对照产生每个样品比例的百分比。在用毒素蛋白质攻击48h后，ec50＝2.9pm等于ld50的30倍。

具体实施方式

本文描述了涉及测量和/或检测酶活性的组合物和方法。特别地，所述组合物和方法涉及神经毒素的检测和/或测量，例如，肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)。

如本文所用，“肉毒芽孢梭菌神经毒素“或”bont“是指可以执行整体细胞机制的任何多肽，其中肉毒芽孢梭菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放并包含肉毒芽孢梭菌毒素结合至低或高亲和力受体复合物，毒素内化，毒素轻链易位到细胞质中和酶促修饰肉毒芽孢梭菌毒素底物。

肉毒芽孢梭菌(clostridiumbotulinum)菌株产生七种抗原性不同类型的肉毒杆菌毒素(bont)，这些毒素通过调查人类(bont/a、/b、/e和/f)、动物(bont/c1和/d)的肉毒杆菌中毒或来自土壤的分离物(bont/g)来鉴定。虽然所有七种bont血清型都具有类似的结构和药理学性质，但各自还显示异源的细菌学特征。肉毒芽孢梭菌菌株的遗传多样性在hill等人(journalofbacteriology，第189卷，第3期，第818-832页(2007))中有详细描述，其内容通过引用并入本文。在本文所述任何方面的一些实施方案中，bont是菌株a、e、c、b、d、f或g。各种非自然发生的肉毒芽孢梭菌神经毒素也是本领域已知的，并且描述于例如国际专利公开wo95/32738、wo96/33273、wo98/07864和wo99/17806中，其各自通过引用并入本文。

来自各种肉毒芽孢梭菌菌株的毒素共享相同的功能域组织和整体结构架构。肉毒芽孢梭菌毒素各自被翻译为约150kda的单链多肽，其随后通过天然存在的蛋白酶(例如内源性肉毒芽孢梭菌毒素蛋白酶或在环境中产生的天然存在的蛋白酶)在二硫环内被蛋白水解剪切而裂解。这种翻译后加工产生双链分子，其包含约50kda轻链(lc)和约100kda重链(hc)，二者通过单个二硫键和非共价相互作用结合在一起。每个成熟的双链分子包含三个功能不同的结构域：1)位于lc中的蛋白水解结构域，其包括含有锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区，其特异性靶向神经递质释放装置的核心组分；2)包含在hc的氨基末端半部内的易位结构域(hn)，其促进lc从细胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中；3)在hc的羧基末端半部内发现的结合结构域，其确定毒素与位于靶细胞表面的受体复合物的结合活性和结合特异性。

这三个功能结构域的结合、易位和蛋白酶活性都是毒性所必需的。肉毒芽孢梭菌毒素进入神经元并抑制神经递质的释放的整体细胞中毒机制是相似的，无论血清型或亚型如何。不希望受理论束缚，中毒机制涉及至少四个步骤：1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链易位，和4)蛋白酶靶修饰。当肉毒芽孢梭菌毒素的hc结构域与位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体结合时，启动该过程。认为受体复合物的结合特异性部分地通过神经节苷脂和蛋白质受体的特定组合来实现。一旦结合，毒素/受体复合物就通过内吞作用内化且内化的囊泡被分选至特定细胞内途径。易位步骤由囊泡室的酸化触发。易位后，毒素的轻链内肽酶从细胞内囊泡释放到细胞溶质中，在那里它特异性地靶向被称为神经递质释放装置的核心组分的三种蛋白质(囊泡相关膜蛋白(vamp)/突触小泡蛋白、25kda的突触体-相关蛋白(snap-25)和突触融合蛋白)中的一种。

这些核心组分是神经末梢的突触小泡对接和融合所必需的，并且构成可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子-附着蛋白-受体(snare)家族的成员。bont/a和bont/e在羧基端区中裂解snap-25，从而分别释放含九或二十六个氨基酸的链段，且bont/c1也在羧基末端附近裂解snap-25。肉毒杆菌血清型bont/b、bont/d、bont/f和bont/g以及破伤风毒素作用于vamp的保守中心部分，并将vamp的氨基末端部分释放到细胞溶质中。bont/c1在胞浆质膜表面附近的单个位点切割突触融合蛋白。突触snare的选择性蛋白水解导致由体内肉毒芽孢梭菌毒素引起的神经递质释放阻滞。肉毒芽孢梭菌毒素的snare蛋白靶标常见于各种非神经元类型的胞吐作用中；在这些细胞中，如在神经元中，轻链肽酶活性抑制胞吐作用，参见，例如，yannhumeau等，howbotulinumandtetanusneurotoxinsblockneurotransmitterrelease,82(5)biochimie.427-446(2000)；kathrynturton等，botulinumandtetanusneurotoxins:structure,functionandtherapeuticutility,27(11)trendsbiochem.sci.552-558.(2002)；giovannalalli等人，thejourneyoftetanusandbotulinumneurotoxinsinneurons,11(9)trendsmicrobiol.431-437，(2003)。

本文描述了单链多肽，其中报告蛋白在其序列中被接头区段分裂或中断。分裂的报告蛋白是功能性的。

如本文所用，术语“单链”在涉及多肽时是指具有一系列氨基酸残基的单个多肽分子，所述残基通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接。也就是说，单链多肽的每个列举的元件通过肽键与其他元件连接。这与包含多个单链多肽的多链多肽形成对比，所述多个单链多肽可通过例如氢键或二硫键彼此结合以形成多肽复合物。

本文所述的单链多肽可包含荧光素酶和/或其部分，例如，报告蛋白可以是荧光素酶。如本文所用，“荧光素酶”是指催化生物发光反应的酶，例如通过催化荧光素的氧化，从而发光和释放氧化荧光素。荧光素酶可以是天然存在的或工程化的。如本文所用，“功能性”荧光素酶是能够在合适的底物存在下催化反应的荧光素酶。可获得荧光素酶的许多变化形式和实施方案，包括例如萤火虫荧光素酶(北美萤火虫(photinuspyralis))(参见，例如，seqidno：13)，细菌荧光素酶(费氏弧菌(vibriofischeri)，哈维氏弧菌(vibrioharveyi))，海肾萤光素酶(海洋腔肠(renillareniformis))，甲藻萤光素酶，海萤(cypridina)荧光素酶，鞘翅目(coleoptera)荧光素酶，长腹水蚤(gaussia)荧光素酶(参见，例如，heise，k.等，“dualluciferaseassayforsecretedluciferasebasedongaussiaandnanoluc”assaydrugdev.technol.(2013)；其通过引用整体并入本文)，桡足类荧光素酶(参见，例如，takenaka，y.等，“computationalanalysisandfunctionalexpressionofancestralcopepodluciferase”gene(2013)；其通过引用整体并入本文)和nanoluc^tm荧光素酶。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，荧光素酶可以是nanoluc^tm荧光素酶。如本文所用，“nanoluc荧光素酶”是指衍生自细角刺虾(oplophorusgracilirostris)荧光素酶的19.1kda荧光素酶，其可以利用腔肠素类似物或腔肠素作为底物并且具有seqidno：1的序列。nanoluc^tm荧光素酶的变体也可以用于本文方法和组合物的任何方面和实施方案中，并且描述于例如美国专利号8,557,970中；该文献的全部内容通过引用并入本文。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其从n-末端到c-末端包含：报告蛋白的n-末端片段；包含神经毒素切割位点的接头；和报告蛋白的c-末端片段。如本文所用，“片段”是指分子的一部分或区段，例如多肽的一部分或区段。在本文所述的单链多肽中，报告蛋白的n-末端片段和c-末端片段共同包含功能性报告蛋白序列，但不单独包含功能性报告蛋白序列。当存在于同一个单链多肽中，例如，通过接头序列功能性连接时，报告蛋白的n-末端和c-末端片段产生功能性报告融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，报告蛋白是荧光素酶蛋白。在任何方面的一些实施方案中，片段可以是天然存在的序列的变体或衍生物，本文所述的报告蛋白序列，和/或本领域已知的报告蛋白序列，例如，它们可具有报告蛋白序列的至少90％的序列同一性，或相对于报告蛋白序列，具有不超过10个氨基酸残基取代、缺失或添加。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含n-末端结构域，所述n-末端结构域包含与seqidno1)的荧光素酶的氨基酸1-159具有至少90％序列同一性的序列(n-nano1-159)；位于n-nano1-159的c-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；和位于接头的c-末端的c-末端结构域，其具有seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170至少90％序列同一性的序列(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何方面的一些实施方案中，报告蛋白的结构域或片段可以与报告蛋白序列具有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性，例如，与seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)或seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)。在任何方面的一些实施方案中，变体氨基酸可以是保守的取代变异。

在任何实施方案的一个方面，本文描述了单链多肽，其包含：n-末端结构域，其包含相对于seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有少于10个氨基酸残基的取代、缺失或添加的序列(n-nano1-159)；位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；和位于接头的c-末端的c-末端结构域，其相对于seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170具有少于3个氨基酸残基的取代、缺失或添加的序列(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在任何方面的一些实施方案中，报告蛋白的结构域或片段可以是相对于报告蛋白序列具有10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个缺失、插入或取代的序列，例如，相对于seqidno：1的荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)或seqidno：1的荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)。在任何方面的一些实施方案中，取代的氨基酸可以是保守的取代变异。在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159的c-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；c)位于接头的c-末端的nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

如本文所证明的，荧光素酶蛋白可以被接头序列中断，同时仍然提供功能性荧光素酶。在本文所述任何方面的一些实施方案中，在对应于seqidno：1的残基159和160的残基之间提供接头。在本文所述任何方面的一些实施方案中，在seqidno：1的残基159和160之间提供接头。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，如本文所述的单链多肽可包含n-末端结构域和c-末端结构域，所述n-末端结构域包含对应于seqidno：1的残基1-159的序列，所述c-末端结构域包含对应于seqidno：1的残基160-170的序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，如本文所述的单链多肽可包含n-末端结构域和c-末端结构域，所述n-末端结构域基本上由对应于seqidno：1的残基1-159的序列组成，所述c-末端结构域基本上由对应于seqidno：1的残基160-170的序列组成。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，如本文所述的单链多肽可包含含有seqidno：1的残基1-159的n-末端结构域和含有seqidno：1的残基160-170的c-末端结构域。在本文所述任何方面的一些实施方案中，如本文所述的单链多肽可包含基本上由seqidno：1的残基1-159组成的n-末端结构域和基本上由seqidno：1的残基160-170组成的c-末端结构域。在本文所述任何方面的一些实施方案中，如本文所述的单链多肽可包含由seqidno：1的残基1-159组成的n-末端结构域和由seqidno：1的残基160-170组成的c-末端结构域。

在本文所述的单链多肽中，在n-末端和c-末端结构域之间发现接头结构域。如本文所用，“接头”是指报告蛋白(例如荧光素酶)外源的序列，并且其被工程化以功能性地连接报告蛋白的n-末端和c-末端结构域。接头可包含例如一个或多个切割位点、一个或多个间隔区、一个或多个结合片段，和一个或多个另外的荧光素酶。

如本文所用，“功能性连接”是指连接报告蛋白，例如荧光素酶的两个片段，使得插入序列不阻止两个片段形成活性和功能性三级结构。功能性连接的两个片段将表现出在不存在接头序列的情况下表征蛋白质的活性。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含一个或多个切割位点，例如，通过一种或多种酶的作用特异性切割的氨基酸序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，切割位点可以是神经毒素切割位点。因此，神经毒素切割位点包含被至少一种神经毒素特异性切割的序列。神经毒素是抑制神经组织功能和/或杀死神经组织的化合物。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经毒素可以是突触小泡释放的抑制剂。示例性的非限制性神经毒素切割位点可包括肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)和/或破伤风神经毒素切割位点。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含多个神经毒素切割位点，例如，其可被多种神经毒素切割，从而允许检测和/或测量多种神经毒素。

bont通过切割snare蛋白起作用。因此，bont切割位点可以来自snare蛋白。如本文所用，“snare蛋白”是指介导囊泡融合的蛋白质超家族，包括神经元中突触前膜的突触小泡的融合。作为非限制性实例，snare蛋白包括snap-25(例如，ncbi基因id：6616，还参见人类snap25b的ncbi参考序列：np_570824.1和大鼠snap25b的ncbi参考序列：np_112253.1)，突触小泡蛋白(vamp)(例如，ncbi基因id号：6843；6844；6845；8673；8674；9341；9554；10652；10791；和26984)和突触融合蛋白(例如，ncbi基因id号2054；6804；6809；6810；6811；8417；8675；8676；8677；9482；10228；23673；53407；55014；112755；和415177)。由梭菌神经毒素切割的snare易断裂键例如描述于binz，th.等“clostridialneurotoxins:mechanismofsnarecleavageandoutlookonpotentialsubstratespecificityreengineering.”toxins2.4(2010)：665-682。优选地，bont切割位点来自人snare蛋白。表1中提供了人snare易断裂键的实例。

表1-由梭菌神经毒素切割的人snare易断裂键

在一个实施方案中，接头包含至少一个梭菌神经毒素切割位点，优选人神经毒素切割位点。梭菌神经毒素切割位点可以定义为包含snare，优选人snare的至少氨基酸残基p3p2p1p1'p2'p3'的序列，其中p1和p1'是位于由梭菌神经毒素切割的易断裂肽键任一侧上的残基，例如，用于bont/a的人snap25中的gln197和arg198。

在优选的实施方案中，梭菌神经毒素切割位点至少包含snare的氨基酸残基p4p3p2p1p1'p2'p3'p4'。在更优选的实施方案中，梭菌神经毒素切割位点至少包含snare的氨基酸残基p5p4p3p2p1p1'p2'p3'p4'p5'，更优选至少氨基酸残基p6p5p4p3p2p1p1'p2'p3'p4'p5'p6'。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/a切割位点，其中所述bont/a切割位点包含人snap25(seqidno：23)的残基195至200，优选194至201,193至202或192至203。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/b切割位点，其中所述bont/b切割位点包含人vamp-1(seqidno：24)的残基76至81，优选75至82，74至83或73至84。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/b切割位点，其中所述bont/b切割位点包含人vamp-2(seqidno：25)的残基74至79，优选73至80，72至81或71至82。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/b切割位点，其中所述bont/b切割位点包含人vamp-3(seqidno：26)的残基57至62，优选56至63，55至64或54至65。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/c1切割位点，其中所述bont/c1切割位点包含人snap25(seqidno：23)的残基196至201，优选195至202，194至203或193至204。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/c1切割位点，其中所述bont/c1切割位点包含人类突触融合蛋白1a(seqidno：27)的残基251至256，优选250至257，249至258或148至259。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/c1切割位点，其中所述bont/c1切割位点包含人类突触融合蛋白1b(seqidno：28)的残基252至257，优选251至258，249至259或149至260。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/d切割位点，其中所述bont/d切割位点包含人vamp-1(seqidno：24)的残基59至64，优选58至65，57至66或56至67。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/d切割位点，其中所述bont/d切割位点包含人vamp-2(seqidno：25)的残基57至62，优选56至63，55至64或54至65。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/d切割位点，其中所述bont/d切割位点包含人vamp-3(seqidno：26)的残基40至45，优选39至46，38至47或37至48。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/e切割位点，其中所述bont/e切割位点包含人snap25(seqidno：23)的残基178-183，优选177-184，176-185或175-186。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/f切割位点，其中所述bont/f切割位点包含人vamp-1(seqidno：24)的残基58至63，优选57至64，56至65或55至66。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/f切割位点，其中所述bont/f切割位点包含人vamp-2(seqidno：25)的残基56至61，优选55至62，54至63或53至64。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/f切割位点，其中所述bont/f切割位点包含人vamp-3(seqidno：26)的残基39至44，优选38至45，37至46或36至47。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/g切割位点，其中所述bont/g切割位点包含人vamp-1(seqidno：24)的残基81至86，优选80至87，79至88或78至89。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/g切割位点，其中所述bont/g切割位点包含人vamp-2(seqidno：25)的残基79至84，优选78至85，77至86或76至87。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/g切割位点，其中所述bont/g切割位点包含人vamp-3(seqidno：26)的残基62至67，优选61至68，60至69或59至70。

在一个实施方案中，接头包含至少一个bont/b切割位点，其中所述tent切割位点包含人vamp-1(seqidno：24)的残基76至81，优选75至82，74至83或73至84。

在一个实施方案中，接头包含至少一个tent切割位点，其中所述tent切割位点包含人vamp-2(seqidno：25)的残基74至79，优选73至80，72至81或71至82。

在一个实施方案中，接头包含至少一个tent切割位点，其中所述bont/b切割位点包含人vamp-3(seqidno：26)的残基57至62，优选56至63，55至64或54至65。

作为非限制性实例，snare蛋白中合适的bont切割位点的实例包括人snap-25b(例如，seqidno：10)的氨基酸141-206；和人vamp1(例如，ncbi基因id：6843)的氨基酸35-96。在本文所述任何方面的一些实施方案中，人vamp1的35-96位氨基酸可以是seqidno：16的氨基酸35-96。snare蛋白中bont切割位点的其他非限制性实例包括人vamp2的氨基酸60-87，人vamp3的氨基酸43-70和人vamp1的氨基酸62-89。在任何方面的一些实施方案中，人vamp2的氨基酸60-87可以是seqidno：19的序列。在任何方面的一些实施方案中，人vamp3的氨基酸43-70可以是seqidno：20的序列。在任何方面的一些实施方案中，人vamp1的氨基酸62-89可以是seqidno：21的序列

在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可以是本文所述的任何特定序列的变体，例如snare蛋白中发现的天然bont切割位点的变体。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可以是seqidno：10的氨基酸141-206或seqidno：16的氨基酸35-96的变体。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可与snare蛋白中发现的天然bont切割位点具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可与seqidno：10的氨基酸141-206或seqidno：16的氨基酸35-96具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。在任何方面的一些实施方案中，变体可以是保守的替代变体。

在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可以是相对于在snare蛋白中发现的天然bont切割位点具有10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个缺失、插入或取代的序列。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可以是相对于snare蛋白中发现的天然bont切割位点具有变化的10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个残基的序列。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可以是相对于seqidno：10的氨基酸141-206或seqidno：16的氨基酸35-96具有10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个缺失、插入或取代的序列。在任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可以是具有相对于seqidno：10的氨基酸141-206或seqidno：16的氨基酸35-96而变化的10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个残基的序列。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可包含人snap-25b(例如，seqidno：10)的氨基酸141-206；人vamp1的氨基酸35-96；vamp1的氨基酸1-96；人类snap25；和/或人snap25b(seqidno：14)的氨基酸1-206。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可被bonta、b、c、d、e、f和/或g特异性识别(例如切割)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可被bonta、e和c特异性识别(例如切割)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，bont切割位点可被bontb、d、f和g特异性识别(例如，切割)。

在本文描述的任何方面的一些实施方案中，接头可包含一个或多个间隔区。如本文所用，“间隔区”是指用于分离同一肽链中的两个其他序列的结构目的的氨基酸序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区序列可以是柔性肽序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区可包含甘氨酸和丝氨酸残基。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区可基本上由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区可由甘氨酸和丝氨酸残基组成。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区的长度可为约2至约30个氨基酸。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区的长度可为2至30个氨基酸。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区的长度可为约3至约20个氨基酸。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区的长度可为3至20个氨基酸。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区的长度可为约5至约15个氨基酸。在本文所述任何方面的一些实施方案中，间隔区的长度可为5至15个氨基酸。

示例性的非限制性间隔区可包括gssggggsggggssg(seqidno：4)；gssggggsgggssg(seqidno：5)；ggggs(seqidno：6)；(ggggs)n(n＝1-3)(seqidno：7)；kesgsvsseqlaqfrsld(seqidno：8)；和egkssgsgseskst(seqidno：9)。接头设计、选择和其他示例性接头在本领域中是公知的，并且例如在chen，x.等人，“fusionproteinlinkers:proterty,designandfunctionality”adv.drugdeliv.rev.(2013)中描述；该文献的全部内容通过引用并入本文。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含神经毒素结合片段，例如，与神经毒素结合和/或结合神经毒素并且不被神经毒素切割的序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经毒素结合片段可以是神经毒素受体的片段，例如bont和/或破伤风神经毒素的受体。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经毒素受体可以是人、小鼠、大鼠或灵长类动物神经毒素受体。在优选的实施方案中，神经毒素受体是人神经毒素受体。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经毒素受体可以是sv2c，例如人sv2c(ncbi基因id：22987；genbank：aai00828.1)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，受体的神经毒素结合片段可包含对应于人sv2c(sv2c-l4，例如，seqidno：11)的氨基酸529-566的序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经毒素结合片段可包含人sv2c(sv2c-l4，例如，seqidno：11)的氨基酸529-566。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经毒素受体可以是syti(ncbi基因id：6857)或syt2(ncbi基因id：127833)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，受体的神经毒素结合片段可包含对应于syti(例如，seqidno：17)的氨基酸32-52或syt2(seqidno:18)的氨基酸40-60的序列。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含完整的第二荧光素酶多肽。在本文所述任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶在例如通过神经毒素来切割单链多肽之前和/或之后是活性的。在本文所述任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶可与第一荧光素酶区分开，例如其作用于不同的底物和/或产生不同波长的光。例如，如果第一荧光素酶是nanoluc，第二荧光素酶可以是萤火虫荧光素酶(例如，北美萤火虫(photinuspyralis))，细菌荧光素酶(例如，费氏弧菌(vibriofischieri)，哈维氏弧菌(vibrioharveyi))，海肾萤光素酶(例如，海洋腔肠(renillareniformis))，甲藻萤光素酶，或长腹水蚤(gaussia)荧光素酶。在本文所述任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶可包含对应于seqidno：13的序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶可包含seqidno：13。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含位于n-末端报告蛋白结构域和至少一个切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含位于n-nano1-159和bont切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，结合片段可位于至少一个切割位点的n-末端。在本文所述任何方面的一些实施方案中，结合片段可位于n-nano1-159和bont切割位点之间。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可以从n-末端到c-末端包含至少一个结合片段、至少一个间隔区和至少一个切割位点。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可以从n-末端到c-末端包含至少一个结合片段、至少一个间隔区和至少一个bont切割位点。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可以从n-末端到c-末端包含一个或多个间隔区和至少一个切割位点。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可以从n-末端到c-末端包含一个或多个间隔区、至少一个切割位点和一个或多个间隔区。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可从n-末端到c-末端包含至少一个切割位点和一个或多个间隔区。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含位于bont切割位点与n-nano1-159之间、神经毒素切割位点与c-nano160-170之间，或其组合的一个或多个间隔区。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含位于第二荧光素酶多肽和切割位点之间的间隔区。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可以从n-末端到c-末端包含第二荧光素酶多肽、至少一个间隔区和至少一个切割位点。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头可包含位于第二荧光素酶多肽和bont切割位点之间的间隔区。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽可进一步包含多组氨酸亲和标签，例如his6(seqidno：12)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，多组氨酸亲和标签位于多肽的c-末端，例如，报告蛋白c-末端结构域的c-末端。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159的c-末端的接头，其包含：i)第一个5至15个氨基酸的间隔区；ii)位于第一个间隔区c-末端的由sv2c的氨基酸529-566组成的结合片段；iii)位于结合片段c-末端的第二个间隔区；iv)位于第二间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人snap25b的氨基酸141-206；iv)位于bont切割位点的c-末端5至15个氨基酸的第三个间隔区；和c)位于接头的c-末端的nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述多肽还包含nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)的c-末端的多组氨酸亲和标签。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)5至15个氨基酸的第一间隔区；ii)位于第一间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人snap25b的氨基酸141-206；iii)位于bont切割位点的c-末端5至15个氨基酸的第二间隔区；和c)位于接头的c-末端的nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述多肽还包含nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)的c-末端的多组氨酸亲和标签。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)第一个5至15个氨基酸的间隔区；ii)位于第一间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人vamp1的氨基酸35-96；iii)位于bont切割位点c-末端的5-15个氨基酸的第二个间隔区；和c)位于接头的c-末端的nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述多肽还包含nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)的c-末端的多组氨酸亲和标签。

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)；b)位于n-nano1-159c-末端的接头，其包含：i)第二功能性荧光素酶多肽；ii)位于第二荧光素酶多肽c-末端的5-15个氨基酸的第一间隔区；iii)位于第一间隔区c-末端的bont切割位点，其包含人snap25b(例如seqidno：14)的氨基酸1-206；iv)位于bont切割位点的c-末端第二个5至15个氨基酸的间隔区；和c)位于接头的c-末端的nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)；其中接头在功能上连接n-nano1-159和c-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述多肽还包含nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170)的c-末端的多组氨酸亲和标签。

表2

在任何实施方案的一个方面，本文描述的是包含编码如本文所述的单链多肽的核苷酸序列的核酸。在本文所述任何方面的一些实施方案中，核酸可包含seqidno：15、29、30或31。

本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸分子的核酸载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。此类表达载体在本文中称为表达构建体，并且包含本文公开的核酸分子，其可操作地连接至可用于在细胞或无细胞提取物中表达核酸分子的表达载体。多种表达载体可用于表达编码本发明单链多肽的核酸分子，包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，例如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。还应理解，用于实施这些方法的方面的表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达单链多肽的表达载体。表达载体的非限制性实例，以及用于制备和使用来自此类表达载体的表达构建体的公认试剂和条件，可容易地从商业供应商获得，包括但不限于bdbiosciences-clontech,paloalto,calif.；bdbiosciencespharmingen,sandiego,calif.；invitrogen,inc,carlsbad,calif.；emdbiosciences-novagen,madison,wis.；qiagen，inc.，valencia，calif.；和stratagene，lajolla，calif。适当表达载体的选择、制备和使用为完全在本领域的技术人员的技能范围内且可根据本文的教义获得的常规程序。

在任何实施方案的一个方面，本文描述了核酸载体，其包含核酸，所述核酸包含编码如本文所述的单链多肽的核苷酸序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，核酸可包含seqidno：15。在本文所述任何方面的一些实施方案中，载体可以是表达载体并包含可表达形式的核酸序列。在本文所述任何方面的一些实施方案中，载体可以是病毒表达载体、原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体。

如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至细胞或在不同细胞之间转移的核酸构建体。可用于将外源基因转移到靶细胞中的许多载体是可获得的，例如载体可以是游离型的，例如质粒，病毒衍生的载体或可以通过同源重组或随机整合来整合到靶细胞基因组中。在本文描述的任何方面的一些实施方案中，载体可以是表达载体。如本文所用，术语“表达载体”是指具有在细胞中掺入和表达异源核酸片段的能力的载体。表达载体可包含其他元件。当表达控制序列控制和调节该多核苷酸序列的转录和翻译时，掺入载体中的核酸可以与表达控制序列可操作地连接。

本发明的另一方面涉及包含本文所述的核酸分子或表达构建体的细胞。细胞可以用于核酸的繁殖或用于核酸的表达，或两者。在任何实施方案的一个方面，本文描述的是包含如本文所述的核酸和/或载体的细胞。在本文所述任何方面的一些实施方案中，细胞表达如本文所述的单链多肽。在本文所述任何方面的一些实施方案中，细胞可以是原核细胞、大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、小鼠细胞、灵长类动物细胞和/或神经元细胞。在任何方面的一些实施方案中，细胞是神经元细胞，特别是对bont具有高敏感性的细胞。

对bont具有高敏感性的细胞是易受bont中毒影响的细胞。在一些实施方案中，对bont具有高敏感性的细胞是对bont中毒敏感的细胞，例如，约500pm或更小，约400pm或更小，约300pm或更小，约200pm或更小，约100pm或更小，约90pm或更小，约80pm或更小，约70pm或更小，约60pm或更小，约50pm或更小，约40pm或更小，约30pm或更小，约20pm或更小，约10pm或更小，约9pm或更小，约8pm或更小，约7pm或更小，约6pm或更小，约5pm或更小，约4pm或更小，约3pm或更小，约2pm或更小，约1pm或更小，约0.9pm或更小，约0.8pm或更小，约0.7pm或更小，约0.6pm或更小，约0.5pm或更小，约0.4pm或更小，约0.3pm或更小，约0.2pm，约0.1pm或更小的bont，约90fm或更小的bont，约80fm或更小的bont，约70fm或更小的bont，约60fm或更小的bont，约50fm或更小的bont，约40fm或更小的bont，约30fm或更小的bont，约20fm或更小的bont，或约10fm或更小的bont。

在一些实施方案中，细胞是对bont具有高度敏感性的原代神经元细胞，例如皮质神经元、海马神经元和/或脊髓神经元。

在一些实施方案中，细胞来自对bont具有高敏感性的神经元细胞系，例如be(2)-m17、kelly、la1-55n、n1e-115、n4tg3、n18、neuro-2a、ng108-15、pc12、sh-sy5y、sima和/或sk-n-be(2)-c。

在一些实施方案中，细胞是源自干细胞的神经元细胞，特别是来自诱导的多能干细胞(ips细胞)的神经元细胞，例如神经元，dopaneuronsicell谷氨酸能神经元，icellmotoneurons(cellulardynamicsinc)大脑皮质神经元，神经干细胞(axolbiosciences)，peri.4u神经元，cns.4u神经元，dopa.4uneurons(axiogenesis)mnp细胞(lonza)，皮层神经元，运动神经元(istem)和/或ipsc衍生神经元细胞(mti-globalstem)。

在任何方面的一些实施方案中，细胞可以是原核细胞，包括但不限于需氧，微需氧，嗜二氧化碳，兼性，厌氧，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，例如衍生自例如以下的细菌细胞：大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)，产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)，艰难梭菌(clostridiumdifficile)，新月形杆菌(caulobactercrescentus)，乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)，脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningirulls)，脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)，荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)；和真核细胞，包括但不限于酵母菌株，例如衍生自以下的酵母菌株：毕赤巴斯德酵母(pichiapastoris)，甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)，安格斯毕赤酵母(pichiaangusta)，粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)；来自昆虫的昆虫细胞或细胞系，例如衍生自以下昆虫的昆虫细胞或细胞系草地夜蛾(spodopterafrugiperda)，粉纹夜蛾(trichoplusiani)，黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)和烟草天蛾(manducasexta)；或哺乳动物细胞或源自哺乳动物细胞的细胞系，例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人的细胞或细胞系。细胞系可从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)、欧洲细胞培养物保藏中心(europeancollectionofcellcultures)和德国微生物与细胞培养物保藏中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)获得。用于选择、制造和使用合适细胞系的特定方案的非限制性实例描述于例如insectcellcultureengineering(mattheusf.a.goosen等人编辑，marceldekker，1993)；insectcellcultures:fundamentalandappliedaspects(j.m.vlak等人编辑，kluweracademicpublishers，1996)；maureena.harrison&ianf.rae,generaltechniquesofcellculture(cambridgeuniversitypress,1997)；cellandtissueculture:laboratoryprocedures(alandoyle等编辑，johnwileyandsons，1998)；r.ianfreshney,cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique(wiley-liss,4.sup.thed.2000)；animalcellculture:apracticalapproach(johnr.w.masters编辑，oxforduniversitypress,3.sup.rded.2000)；molecularcloningalaboratorymanual，同上，(2001)；basiccellculture:apracticalapproach(johnm.davis,oxfordpress,2.sup.nded.2002)；andcurrentprotocolsinmolecularbiology，同上，(2004)。所述方案为在本领域技术人员的技能范围内和可根据本文的教义获得的常规程序。

本文所述的组合物可用于检测和/或测量例如神经毒素(例如bont)的存在、效力和/或活性的方法中。在bont存在下，具有bont切割位点的单链多肽将在接头序列中被切割，从而破坏分裂的报告蛋白(例如荧光素酶)的活性。因此，报告蛋白活性的降低表明存在bont。在任何实施例的一个方面，本文描述了一种用于检测在样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)在适合于bont活性的条件下使样品与如本文所述的单链多肽接触；与在不存在样品的情况下多肽的荧光素酶活性相比，确定多肽的荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低表明样品中的bont活性。在任何实施方案的一个方面，本文描述了用于确定肉毒杆菌神经毒素的效力的方法，其包括：a)在适合于bont活性的条件下使神经毒素与本文所述的单链多肽接触；b)与参考相比，确定多肽的荧光素酶活性，从而确定效力。在任何方面的一些实施方案中，所述方法适用于批量释放，例如用于批量释放测试和/或批次释放测试。在本文描述的任何方面的一些实施方案中，可以体外进行本文描述的方法。

在任何实施例的一个方面，本文描述了一种用于检测在样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)在适合于bont活性的条件下使样品与如本文所述的单链多肽接触；b)与不存在样品时多肽的荧光素酶活性相比，确定多肽的荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低表明样品中的bont活性。在任何实施方案的一个方面，本文描述了用于检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)在适合于bont活性的条件下，使样品与单链多肽接触，所述单链多肽包含：nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)，nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170，其通过接头来分离和功能性连接，所述接头位于n-nano1-159c-末端；和c-nano160-170n-末端，包含bont切割位点；b)与不存在样品时多肽的荧光素酶活性相比，确定多肽的荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低表明样品中的bont活性。

在任何实施例的一个方面，本文描述了一种用于检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)在适合于bont活性的条件下，使样品与单链多肽接触，所述单链多肽包含：nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)，nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170，其通过接头来分离和功能性连接，所述接头位于n-nano1-159c-末端；和c-nano160-170n-末端，包含bont切割位点；b)与不存在样品时多肽的活性相比，确定多肽的荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低是样品中bont活性的指示。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头包含5至15个氨基酸的第一间隔区，位于第一间隔区的c-末端和bont切割位点的n-末端的人sv2c的氨基酸529-566的结合片段，和位于bont切割位点c-末端的5-15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人snap25的氨基酸141-206。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头包含位于bont切割位点n-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，和位于bont切割位点的c-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人snap25的氨基酸141-206。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头包含位于bont切割位点n-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，位于bont切割位点c-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中bont切割位点包含人vamp1的氨基酸35-96。

在任何实施方案的一个方面，本文描述了用于测定bont的ec50的方法，其包括：a)在适合于bont活性的条件下，将如本文所述的单链多肽与第一浓度的bont接触；与不存在样品时的多肽的荧光素酶活性相比，确定多肽的荧光素酶活性；b)在不同浓度的bont下重复步骤a)，直到可以确定ec50。在本文所述任何方面的一些实施方案中，不同浓度的bont包含至少一个数量级的差异。

如本领域已知的，“半数最大有效浓度(ec50)”是指在一些特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的中间响应的药物、抗体或毒物的浓度。它通常用作衡量药物效力的指标。因此，分级剂量响应曲线的ec50代表观察到其最大效应的50％的化合物的浓度。量子剂量响应曲线的ec50表示在特定的暴露持续时间后50％的群体表现出响应的化合物的浓度。

如本文所用，“适合于bont活性的条件”是指bont可特异性切割bont切割位点的条件(例如温度、ph、辅因子等)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，适合于bont活性的条件可包含hepes，20μmzncl2，2mmdtt，1mg/mlbsa，ph7.1的缓冲液。在本文所述任何方面的一些实施方案中，适合于bont活性的条件可包含hepes，10-30μmzncl2，1-3mmdtt，0.5-2mg/mlbsa，ph6.5-7.5的缓冲液。在本文所述任何方面的一些实施方案中，适合于bont活性的条件可包含hepes，5-50μmzncl2，0.1-10mmdtt，0.1-10mg/mlbsa，ph6.5-7.5的缓冲液。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述条件可包括在约37℃下孵育约1小时至约36小时的时间。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述条件可包括在约37℃下孵育1小时至36小时的时间。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述条件可包括在约37℃下孵育约1小时至约24小时的时间。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述条件可包括在约37℃下孵育1小时至24小时的时间。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述条件可包括在约37℃下孵育约4小时至约24小时的时间。在本文所述任何方面的一些实施方案中，所述条件可包括在约37℃下孵育4小时至24小时的时间。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽以约3nm至约300nm的浓度存在。在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽以3nm至300nm的浓度存在。在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽以约30nm至约300nm的浓度存在。在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽以30nm至300nm的浓度存在。在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽以约30nm的浓度存在。在本文所述任何方面的一些实施方案中，单链多肽以30nm的浓度存在。

还可以在细胞中检测bont活性，例如在神经元细胞中。在任何实施例的一个方面，本文描述了一种用于检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)使样品与表达如本文所述的单链多肽的神经元细胞接触；b)将神经元细胞孵育约12小时至约60小时的时间；c)从神经元细胞中收获裂解物；和d)与在没有样品的情况下，相同处理的神经元细胞中的nanoluc^tm荧光素酶活性相比，测量裂解物中的nanoluc^tm荧光素酶活性，其中nanoluc^tm荧光素酶活性减少表明样品中的bont活性。在任何实施例的一个方面，本文描述了一种用于检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(bont)活性的方法，包括：a)使样品与表达单链多肽的神经元细胞接触，所述单链多肽包含：nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸1-159(n-nano1-159)，nanoluc^tm荧光素酶的氨基酸160-170(c-nano160-170，其通过接头来分离和功能性连接，所述接头位于n-nano1-159c-末端和c-nano160-170n-末端，包含bont切割位点；b)将神经元细胞孵育约12小时至约60小时的时间；c)从神经元细胞中收获裂解物；和d)与在没有样品的情况下，相同处理的神经元细胞中的nanoluc^tm荧光素酶活性相比，测量裂解物中的nanoluc^tm荧光素酶活性，其中nanoluc^tm荧光素酶活性减少表明样品中的bont活性。在本文所述任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于n-nano1-159和切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经元细胞表达来自病毒表达载体的单链多肽。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经元细胞在接触步骤之前从病毒表达载体表达单链多肽至少3天。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经元细胞在接触步骤之前从病毒表达载体表达单链多肽至少4天。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经元细胞在接触步骤之前从病毒表达载体表达单链多肽至少6天。在本文所述任何方面的一些实施方案中，神经元细胞在接触步骤之前从病毒表达载体表达单链多肽6天。在本文所述任何方面的一些实施方案中，病毒表达系统是慢病毒表达系统。在本文所述任何方面的一些实施方案中，孵育步骤b)为约12小时至约72小时。在本文所述任何方面的一些实施方案中，孵育步骤b)为约48小时。在本文所述任何方面的一些实施方案中，孵育步骤b)是48小时。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，收获裂解物的步骤可包括添加裂解缓冲液。在本文所述任何方面的一些实施方案中，收获裂解物的步骤可包括离心和/或沉降。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，方法可包括使用单链多肽的组合，每种多肽具有不同的bont切割位点和/或bont切割位点的组合。

如本文所用，“确定荧光素酶活性”是指在荧光素酶底物存在下，定量或定性地检测由荧光素酶(或可含有功能性荧光素酶的样品)产生的光的水平。可以通过本领域已知的任何方法检测发光，例如通过发光显微镜、光度计、发光板读数器、光电倍增管检测器等。

荧光素酶底物可包括天然存在的荧光素以及工程化底物。例如，荧光素包括萤火虫荧光素，海萤[也称为弯喉海萤(vargula)]荧光素[腔肠素]，细菌荧光素，以及这些底物的合成类似物。在本文所述任何方面的一些实施方案中，荧光素是腔肠素及其类似物，其包括美国专利号6,436,682中的分子，其全部内容通过引用并入本文，并且例如参见zhao等，(2004),molimaging,3；43-54。另外的底物描述于，例如，美国专利号5374534；5098828；6436682；5004565；5455357；和4,950,588，其每一个通过引用整体并入本文。

在任何方面的一些实施方案中，荧光素酶活性可以通过向单链多肽添加荧光素酶底物并定量测量产生的发光信号来确定。在本文所述任何方面的一些实施方案中，nanoluc^tm荧光素酶的底物可以是腔肠素类似物(2-呋喃甲基-脱氧-腔肠素)。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，该方法可以进一步包括测量单链多肽包含的第二荧光素酶的活性。在本文所述任何方面的一些实施方案中，可以在细胞裂解物中测量第二荧光素酶的活性。在本文所述任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶的活性可允许单链多肽在各个样品、细胞、细胞群和/或孔中的表达得以标准化。在本文所述任何方面的一些实施方案中，测定样品中第二荧光素酶多肽的荧光素酶活性，并用作收获的裂解物中存在的总单链多肽的指示物。

在任何实施方案的一个方面，本文描述了试剂盒，其包含：a)如本文所述的一种或多种单链多肽，其中单链多肽中的每一种或其组合包装在单独的容器中；如本文所述的一种或多种核酸或核酸载体，其中核酸或核酸载体中的每一种或其组合包装在单独的容器中；和/或如本文所述的一种或多种细胞，其中每种细胞或细胞的组合包装在单独的容器中。

试剂盒是包含至少一种试剂的任何制品(例如，包装或容器)，例如单链多肽，编码单链多肽的核酸，或包含编码如本文所述的单链多肽的核酸的细胞，所述制品作为用于执行本文所述的方法或测定的单元被促销、分发或出售。

本文描述的试剂盒包括允许测定报告分子活性水平的试剂和/或组分，所述报告分子例如一种或多种类型的荧光素酶。此类试剂除单链多肽外还包含缓冲溶液、底物或洗涤液等。此外，试剂盒可包含一定量的神经毒素，例如bont，或荧光素酶，其可用于校准试剂盒或作为内部控制。另外，该试剂盒可以包括说明书和/或可以提供关于所获得的结果的相关性的信息

为方便起见，说明书、实施例和随附权利要求书中所用的一些术语和短语的含义提供如下。除非另外指出或从上下文暗示，否则下列术语和短语包括以下所提供的含义。提供定义是为了有助于描述特定实施方案，并且不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅受权利要求限制。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果本领域中术语的使用与本文所提供的其定义之间存在明显差异，那么应以说明书内所提供的定义为准。

为了方便起见，这里集中了在说明书、实例和附加权利要求书中采用的某些术语。

术语“减少”、“减轻”、“降低”或“抑制”在本文所有均用于意指减少统计上显著的量。在本文所述任何方面的一些实施方案中，“减少”、“降低”或“抑制”通常意指与参考水平(例如，没有给定的治疗或试剂)相比降低至少10％，并且可以包括例如减少至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约98％，至少约99％或更多。

术语“增加的”、“增加”、“增强”或“激活”在本文所有均意指增加统计上显著的量。在本文所述任何方面的一些实施方案中，术语“增加的”、“增加”、“增强”或“激活”可意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比，增加至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或至多并且包括100％增加或10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比，增加至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍或至少约10倍，或2倍至10倍的任何增加或更多。在标记物的情况下，“增加”是这种标志物水平的统计学显著增加。

如本文所用，“受试者”意指人类或动物。通常动物为脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔子和仓鼠。家畜和野生动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫物种(例如，家猫)、犬物种(例如，狗、狐狸、狼)、鸟物种(例如，雏鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和大麻哈鱼)。在本文所述任何方面的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。

优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作代表肉毒杆菌活性动物模型的受试者。受试者可为雄性或雌性。

如本文所用，术语“结合活性”是指一个分子通过至少一个分子间或分子内力与另一个分子接触，包括但不限于共价键、离子键、金属键、氢键、疏水相互作用、范德华相互作用等，或其任何组合。“结合(bound)”和“结合(bind)”被认为是用于结合的术语。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，可以分离或纯化单链多肽。“分离的”是指在不同程度上与在其天然状态下发现的通常伴随其的组分分离的材料。“分离”表示与原始来源或周围环境的分离程度，例如与细胞或细胞裂解物的分离程度。

术语“纯化的”用于指相对于制剂的其他组分(例如，其他多肽)，“基本上纯”的物质，诸如多肽。它可以指相对于其他组分，至少约50％、60％、70％或75％，优选至少约85％，更优选至少约90％，最优选至少约95％纯的多肽。重述一下，关于多肽，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的一种或多种其他组分(例如，其他多肽或细胞组分)的制剂。

如本文所用，“接触”是指用于将样品或试剂递送或暴露于如本文所述的单链多肽(或包含所述多肽的细胞)的任何合适的手段。示例性递送方法包括但不限于直接递送至样品或细胞培养基、灌注、注射或本领域技术人员熟知的其他递送方法。

如本文所用的术语“样品”或“测试样品”表示从任何来源(例如生物、环境、工业或其他来源)采集或分离的样品。术语还包括上述样品的混合物。术语“测试样品”还包括未处理或预处理(或预加工)的样品。可以通过从来源中移除样品来获得测试样品，但也可以通过使用先前分离的样品(例如在先前时间点分离并由相同或另一个人分离)来完成。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，测试样品可以是未处理的测试样品。如本文所用，短语“未处理的测试样品”是指除了在溶液中稀释和/或悬浮之外没有任何先前样品预处理的测试样品。用于处理测试样品的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声处理、均质化、加热、冷冻和解冻，以及它们的组合。在本文所述任何方面的一些实施方案中，测试样品可以是冷冻测试样品，例如冷冻环境样品、冷冻工业样品或冷冻组织。在采用本文所述的方法、测定和系统之前，可以解冻冷冻的样品。解冻后，可以将冷冻的样品离心，然后进行本文所述的方法、测定和系统。在本文所述任何方面的一些实施方案中，测试样品是澄清的测试样品，例如通过离心和收集上清液制备。在本文所述任何方面的一些实施方案中，测试样品可以是预处理的测试样品，例如，选自由离心、过滤、解冻、纯化和其任何组合组成的组的处理产生的上清液或滤液。在本文所述任何方面的一些实施方案中，可以用化学和/或生物试剂处理测试样品。化学和/或生物试剂可用于在加工过程中保护和/或维持样品的稳定性，包括其中的生物分子(例如蛋白质)。技术人员充分了解适合于预处理用于确定如本文所述的表达产物水平所需的生物样品的方法和过程。

如本文所用，术语“神经元细胞”或“神经元”是指在神经系统中发现的细胞，其专门接收、处理和传递作为神经信号的信息。神经元可以包括中央细胞体或体细胞，以及两种类型的突起：树突，通常，大部分神经元信号通过树突传递到细胞体；和轴突，通常，大部分神经元信号通过轴突从细胞体传递到效应细胞，例如靶神经元或肌肉。神经元可以将信息从组织和器官传递到中枢神经系统(传入神经元或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传出神经元或运动神经元)。其他神经元，称为中间神经元，连接神经系统内的神经元。

如本文所用，术语“特异性”是指两个分子之间的特定相互作用(例如结合和/或切割)，其中第一实体与第二靶标实体相互作用，其具有比其与作为非靶标的第三实体相互作用更大的特异性和亲和力。在本文描述的任何方面的一些实施方案中，特异性可以指第一实体与第二靶标实体的相互作用，其比与第三非靶标实体的相互作用大至少10倍，至少50倍，至少100倍，至少500倍，至少1000倍或更大。对给定靶标特异的试剂是在所利用的测定条件下显示例如针对该靶标的特异性结合或在所用测定条件下特异性切割靶序列的试剂。

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换用于指定通过相邻残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括修饰氨基酸(例如，磷酸化氨基酸、糖化氨基酸、糖基化氨基酸等)和氨基酸类似物，不管其大小或功能。“蛋白质”和“多肽”常用于指相对大的多肽，而术语“肽”常用于指小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用有重叠。当指代基因产物和其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、前述的片段和其他等效物、变体、片段、和类似物。

在本文所述的各种实施方案中，进一步预期涵盖任何所述特定多肽的变体(天然存在的或其他的)、等位基因、同源物、保守修饰的变体和/或保守的取代变体。关于氨基酸序列，技术人员将认识到，改变所编码序列中的单个氨基酸或较小百分比氨基酸的对于核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸并保留所需的多肽活性。此类保守修饰变体附加于并且不排除与本公开一致的多态变体、种间同源物和等位基因。

给定氨基酸可以被具有类似生理化学特征的残基代替，例如，用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基(诸如用ile、val、leu或ala取代另一个)，或用一个极性残基取代另一个极性残基(诸如在lys与arg；glu与asp；或gln与asn之间)。其他这样的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代是众所周知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以证实保留了天然或参考多肽的所需活性，例如多肽结合活性和特异性。

氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(在a.l.lehninger，生物化学，第二版，第73-75页，worthpublishers，newyork(1975)中):(1)非极性：ala(a)，val(v)，leu(l)，ile(i)，pro(p)，phe(f)，trp(w)，met(m)；(2)不带电的极性：gly(g)，ser(s)，thr(t)，cys(c)，tyr(y)，asn(n)，gln(q)；(3)酸性：asp(d)，glu(e)；(4)碱性：lys(k)，arg(r)，his(h)。或者，可以基于共同的侧链性质将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性：asp，glu；(4)碱性：his，lys，arg；(5)影响链取向的残基：gly，pro；(6)芳香族：trp，tyr，phe。非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。特别保守的取代包括，例如；ala取代gly或取代ser；arg取代lys；asn取代gln或取代his；asp取代glu；cys取代ser；gln取代asn；glu取代asp；gly取代ala或取代pro；his取代asn或取代gln；ile取代leu或取代val；leu取代ile或取代val；lys取代arg，取代gln或取代glu；met取代leu，取代tyr或取代ile；phe取代met，取代leu或取代tyr；ser取代thr；thr取代ser；trp取代tyr；tyr取代trp；和/或phe取代val，取代ile或取代leu。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是肽的片段或区段，其根据本文下文所述的测定保留至少50％的野生型参考多肽的活性。功能片段可包含本文公开的序列的保守取代。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，本文描述的多肽可以是本文描述的序列的变体。在本文描述的任何方面的一些实施方案中，变体是保守修饰的变体。例如，可以通过天然核苷酸序列的突变获得保守的取代变体。如本文所提及的“变体”是与天然或参考多肽基本上同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代，其具有与天然或参考多肽不同的氨基酸序列。编码变体多肽的dna序列包括当与天然或参考dna序列比较时包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代的序列，但编码保留活性的变体蛋白或其片段。多种基于pcr的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可由普通技术人员应用。

变体氨基酸或dna序列可以是与天然或参考序列至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更多相同的。可以确定天然序列和突变序列之间的同源程度(同一性百分比)，例如，通过使用在万维网上免费可获得的通常用于此目的的计算机程序来比较两个序列(例如具有默认设置的blastp或blastn)。

天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的许多技术中的任何一种来完成。例如，通过合成含有突变序列的寡核苷酸，可以在特定基因座处引入突变，所述突变序列的侧翼是能够连接天然序列片段的限制性位点。在连接之后，所得重建序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可替代地，寡核苷酸定向位点特异性诱变程序可用于提供具有根据所需取代、缺失或插入来改变的特定密码子的改变核苷酸序列。用于进行这种改变的技术已经很好地建立，并且包括例如由以下公开的技术：walder等(gene42:133,1986)；bauer等(gene37:73,1985)；craik(biotechniques,1985年1月,12-19)；smith等(geneticengineering:principlesandmethods,plenumpress,1981)；和美国专利号4,518,584和4,737,462，其全部内容通过引用并入本文。通常还可用丝氨酸取代不涉及维持多肽正确构象的任何半胱氨酸残基，以改进分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反地，可以向多肽添加半胱氨酸键以改进其稳定性或促进低聚化。

如本文所述，术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选为聚合物分子。核酸可为单链或双链的。单链核酸可为变性双链dna的一个核酸链。可替代地，其可为不是来源于任何双链dna的单链核酸。在一个方面中，核酸可为dna。在另一个方面中，核酸可为rna。合适的dna可包括例如基因组dna或cdna。合适的rna可包括例如mrna。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，可以工程化如本文所述的多肽、核酸或细胞。如本文所述，“工程化”是指通过人手部来操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面(例如其序列)已被人工操纵以与天然存在的方面不同时，认为多肽被“工程化”。如通常的做法并且被本领域技术人员理解，即使实际操作是对于先前实体进行的，工程化细胞的后代通常仍被称为“工程化”。

如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。

如本文所用，术语“表达载体”是指指导rna或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列来进行表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包含其他元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而允许其保持在两个生物体中，例如在人细胞中用于表达，并且在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生rna和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，包括在适用的情况下，但不限于，例如，转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，和通过从基因转录的mrna的翻译来获得的多肽。术语“基因”是指当与适当的调节序列可操作地连接时，在体外或体内转录(dna)成rna的核酸序列。该基因可以包括或不包括编码区之前和之后的区域，例如5'非翻译(5'utr)或“前导”序列和3'utr或“尾随”序列，以及个别编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含至少一种来源于病毒的元件并且具有包装至病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可含有编码本文所述多肽的核酸代替非必需病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中。许多形式的病毒载体是本领域已知的。

“重组载体”是指包含异源核酸序列或能够体内表达的“转基因”的载体。应当理解，在本文所述的任何方面的一些实施方案中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在本文描述的任何方面的一些实施方案中，载体是附加型的。使用合适的附加型载体提供了在高拷贝数的染色体外dna中维持受试者或细胞中所关注的核苷酸的方法，从而消除了染色体整合的潜在影响。

术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且一般意指两个标准偏差(2sd)或更大差异。

除了在操作实施例中之外或在另有说明的情况下，本文所用的表示成分量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以意指±1％。

如本文中所用，术语“包括(comprising/comprises)”是在提到组合物、方法和所述方法或组合物所必不可少的其相应组分时使用的，并且可以包括未指定的元素，无论所述元素是否必不可少。

术语“由…组成”是指如本文所述的组合物、方法和其相应组分不包括实施方案的描述中未描述的任何要素。

如本文中所用，术语“基本上由......组成”是指指定实施方案所需的那些要素。该术语容许不实质上影响该实施方案的基本和新颖性或功能性特征的要素存在。

如本文所用，术语“对应于”是指第一多肽或核酸中所列举位置的氨基酸或核苷酸，或等同于第二多肽或核酸中所列举的氨基酸或核苷酸的氨基酸或核苷酸。等同的所列举的氨基酸或核苷酸可以通过使用本领域已知的同源程度程序(例如blast)对候选序列进行比对来确定。

除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另外明确指出，否则词“或”旨在包括“和”。尽管在实施或测试本公开时可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁文例如(exempligratia)，并在本文中用于指非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(forexample)”同义。

除非本文另外定义，否则结合本申请使用的科学术语和技术术语将具有由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。应了解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范畴，所述范围仅由权利要求限定。免疫学和分子生物学中常见术语的定义可以在以下文献中找到：themerckmanualofdiagnosisandtherapy，第19版，由mercksharp&dohmecorp.出版，2011(isbn978-0-911910-19-3)；roberts.porter等(编)，theencyclopediaofmolecularcellbiologyandmolecularmedicine，由blackwellscienceltd.出版，1999-2012(isbn9783527600908)；和roberta.meyers(编),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference，由vchpublishers，inc.出版，1995(isbn1-56081-569-8)；wernerluttmann的immunology，由elsevier出版，2006；janeway的immunobiology，kennethmurphy，allanmowat，caseyweaver(编辑)，taylor&francislimited，2014(isbn0815345305,9780815345305)；lewin的genesxi，由jones&bartlettpublishers出版，2014(isbn-1449659055)；michaelrichardgreen和josephsambrook，molecularcloning：alaboratorymanual，第4版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,usa(2012)(isbn1936113414)；davis等，basicmethodsinmolecularbiology，elseviersciencepublishing，inc.，newyork，usa(2012)(isbn044460149x)；laboratorymethodsinenzymology：dna，jonlorsch(编辑)elsevier，2013(isbn0124199542)；currentprotocolsinmolecularbiology(cpmb)，frederickm.ausubel(编辑)，johnwileyandsons，2014(isbn047150338x，9780471503385)，currentprotocolsinproteinscience(cpps)，johne.coligan(编辑)，johnwileyandsons，inc.，2005；和currentprotocolsinimmunology(cpi)(johne.coligan，adamkruisbeek，davidhmargulies，ethanmshevach，warrenstrobe，(编辑)johnwileyandsons，inc.，2003(isbn0471142735,9780471142737)，其全部内容通过引用并入本文。

其它术语在本文在本发明各个方面的描述中有定义。

本申请全篇引用的所有专利和其它出版物；包括参考文献、颁发的专利、发表的专利申请和共同待决专利申请明确地通过引用并入本文用于描述和公开例如在此类出版物中描述的可能结合本文所述技术一起使用的方法的目的。这些出版物仅由于其在本申请申请日之前公开而提供。就此而言，决不应解释为承认发明人因现有发明或任何其它原因而无权将此公开提前。所有关于日期的陈述或关于这些文件内容的说明均基于申请人可获得的信息，并且不应构成有关这些文件日期或内容的正确性的任何承认。

本公开的实施方案的描述不意图是详尽的或将本公开限于所公开的确切形式。虽然本文描述本公开的具体实施方案和实例是为了说明的目的，但是正如相关领域的技术人员将认识到那样，在本公开的范围内各种等效修改也是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以指定顺序呈现，但是替代实施方案可按不同顺序执行功能，或可基本上同时执行功能。本文提供的公开的教导可视情况而定适用于其它程序或方法。可组合本文描述的各个实施方案以提供另外的实施方案。如有必要，可修改本公开的方方面面，以采用以上参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开另外的实施方案。而且，由于生物功能等效性因素，可在蛋白质结构上做一些变化，在种类或量上不影响生物或化学作用。可根据详细描述对本公开做这些和其它变化。旨在将所有此类修改包括在所附权利要求书的范围之内。

任何前述实施方案的具体要素可以组合或替换为其它实施方案中的要素。此外，虽然与本公开的某些实施方案相关的优点已经在这些实施方案的上下文中有描述，但是其它实施方案也可表现出此类优点，并非所有实施方案都必须表现出此类优点才属于本公开的范围。

通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，所述实施例不应解释为进一步限制。

实施例

实施例1：用于测量肉毒杆菌神经毒素的活性的新颖体外和基于细胞的测定

肉毒杆菌神经毒素是七种细菌毒素(bont/a-g)的家族。它们是六种a类潜在生物恐怖主义试剂之一。这些毒素也被广泛用于治疗越来越多的医学病状，市场规模超过20亿美元。bont的检测和表征依赖于经典的小鼠致死剂量(ld50)测定。出于生物防御目的并且为了开发医疗产品，迫切需要用更方便、更灵敏、更准确的体外和基于细胞的分析来取代动物实验。

目前已开发出用于检测和表征毒素活性的体外试验，具有各种灵敏度。存在两种主要的商业化测定，两者都基于通过毒素的酶促结构域切割底物的荧光检测。这些测定中的第一种是snaptide^tm(listbiologics)，涉及使用含有bont的天然切割位点并用两种荧光染料来标记的合成肽。荧光信号通常在两种染料之间猝灭，一旦肽被bont切割，信号就会上升。第二种测定是botest^tm(biosentinelllc)。青色荧光蛋白(cfp)通过肽序列与黄色荧光蛋白(yfp)连接。通过bont切割接头消除了可以检测的cfp和yfp之间的荧光共振能量转移(fret)。

这两种检测方法都提供了检测毒素和表征毒素活性的灵敏和方便的方法，现在已广泛用于实验室。这些测定的显著缺点是这些荧光测定易于受到来自毒素和临床样品的药物产品中高水平存在的血清白蛋白蛋白的干扰。目前的解决方案是在这些荧光测定之前用特定的毒素抗体从这些样品中纯化毒素，但是它增加了测定的显著成本并且需要不易获得的特殊试剂(毒素抗体)。

目前，制药公司每年都用许多小鼠来量化毒素活性。迫切需要开发基于细胞的测定来代替小鼠生物测定，以在bont生产中减少动物使用。基于细胞的分析提供了检查毒素活性的所有方面的能力，包括受体结合、膜转运和酶活性。任何体外试验都没有掌控这些方面。目前，只有一种基于细胞的测定法由一家大型制药公司(allergan)很好地建立。该测定是基于使用识别由bont/a切割的snap-25蛋白的单克隆抗体的elisa型测定。简而言之，将细胞暴露于bont/a，并通过特异性抗体将切割的snap-25拉下并固定，所述特异性抗体仅识别切割的snap-25，但不识别全长蛋白质。然后通过第二种snap-25抗体检测固定的snap-25。该测定提供了良好的灵敏度并且可以替代小鼠测定。它被fda批准用于量化毒素产品。主要缺点是它依赖于allergan产生的专门抗体。

正在开发的替代测定包括使用cfp-snap-25-yfp作为细胞中的底物(biosentinelllc)。细胞中该融合蛋白的切割消除了cfp和yfp之间的fret信号。主要缺点是该测定还需要复杂的设备，例如荧光显微镜。

本文描述了经开发用于在体外和体内检测和测量bont活性的新测定法。该测定基于分裂形式的荧光素酶的开发。nanoluc^tm荧光素酶是新一代荧光素酶，具有卓越的蛋白质稳定性和大大增加的发光信号(比经典萤火虫荧光素酶高>100倍)。这种荧光素酶可以分成两部分。当这两个部分彼此靠近时，它们可以重建为产生发光信号的完整活性形式。当这两个部分彼此分开时，发光信号被消除。在图1中描绘的说明性实施方案中，将来自毒素底物(对于bont/a、e和c，所述底物为snap-25，对于bont/b、d、f、g，所述底物为突触小泡蛋白)的接头区域插入到nanoluc^tm荧光素酶的两个片段之间。通过bont来切割该接头区域使nanoluc^tm荧光素酶的两个片段分离并消除其活性，导致发光信号的减少。为了证明这种方法的可行性，设计并测试了以下毒素传感器。

体外毒素传感器：创建并测试三种不同的体外原型毒素传感器(图2a-图2b，图3a-图3b)。第一种传感器在两个分裂nanoluc^tm片段(分别为n-nano和c-nano，图2a-图2b)之间含有snap-25片段，其可以被bont/a、e和c切割。第二种传感器含有另一个作为毒素受体的sv2c片段，它可以通过增强毒素和传感器之间的相互作用来提高切割效率。第三种形式含有可被bont/b、d、f和g切割的突触小泡蛋白片段(图3a-图3b)。

将这些传感蛋白作为重组蛋白来纯化。将含有snap-25的两种形式的传感器与梯度浓度的bont/a一起孵育4或24小时。测量其余的荧光素酶活性并如图2a所示绘制。作为对照，发现bont/b不影响这两种传感器的荧光素酶活性，证明了这两种传感器对bont/a的特异性。如图2b所示，含有sv2c片段的传感器在孵育4小时后具有9.7pm的ec50。这比没有sv2c的传感器灵敏约5倍，表明包含毒素受体片段可能导致更敏感的毒素传感器。

将第三种传感蛋白与bont/b梯度一起孵育。测量其余的荧光素酶活性并如图3a所示绘制。列于图3b中的ec50在孵育4小时后约为75.7pm。将毒素与传感器一起孵育24小时，将ec50显著提高到3.9pm。

与可用的体外传感器相比的优势：这些基于荧光素酶的毒素传感器提供与基于荧光的传感器类似的灵敏度。这些基于分裂荧光素酶的传感器的主要优点是它们不受血清白蛋白蛋白质的影响。

基于细胞的测定：用于基于细胞的测定的传感器的说明性实施方案示于图4中。它包含分裂的nanoluc^tm荧光素酶片段之间的全长snap-25。此外，它还含有n-nano和snap-25之间的萤火虫荧光素酶，它为细胞中传感蛋白的表达水平提供内部控制。该传感蛋白通过慢病毒介导的感染在神经元中表达。然后将神经元暴露于各种浓度的bont/a。48小时后收获细胞裂解物，测量萤火虫荧光素酶和nanoluc^tm荧光素酶的荧光素酶活性。使用萤火虫荧光素酶信号来将nanoluc^tm荧光素酶的水平标准化，然后将其相对于未暴露于任何毒素的对照神经元来标准化(图4)。将神经元与毒素一起孵育减少了nanoluc^tm荧光素酶的信号(图4)，ec50为2.9pm。

与可获得的基于细胞的分析相比的优势：本文描述的测定提供类似于allergan建立的基于elisa的测定的灵敏度。本测定的主要优点是它不需要任何特殊抗体。它比elisa测定更容易、更便宜和更快。

本文特别考虑的是，如本文所述的毒素传感器和基于细胞的测定为制药公司提供测量和量化bont/a和bont/b的活性的更快、更便宜和更容易的方法，可能替代小鼠生物测定。

用于bont检测的体外和体内构建体。对于bont/a检测，将构建体克隆到具有noci/noti的pet28a载体中，并且插入物是nnano-sv2c(529-566)-g4s-snap25(141-206)-cnano和nnano-snap25(141-206)-cnano(“g4s”公开为seqidno：6)。分裂nanoluc^tm荧光素酶序列可从promega获得。使用重叠pcr获得完整插入物，然后将插入物连接到切割载体中。对于bont/b检测，构建体是nnano-vamp(35-96)-cnano。

对于bont/a体内检测，使用分裂的萤火虫或分裂的nanoluc来设计构建体，然后分别应用作为内部对照的海肾和萤火虫。内部控制位于snap25(全长)的正前方。载体基于pcdna3.1和syn-lox慢病毒载体。

克隆体外测定构建体

传感器1：nnano-sv2c-p25-cnano

ncoi-nnano(1-159)-gssggggsggggssg-saci-sv2c(529-566)-ggggs-p25(141-206)-ecori-gssggggsgggssg-cnano(160-170)-noti-his6-终止(“gssggggsggggssg”公开为seqidno：4，“ggggs”公开为seqidno：6，“gssggggsgggssg”公开为seqidno：5，“his6”公开为seqidno：12)

传感器2：nnano-p25-cnano

ncoi-nnano-(1-159)-gssggggsggggssg-saci-p25(141-206)-ecori-gssggggsgggssg-cnano(160-170)-noti-his6-终止(“gssggggsggggssg”公开为seqidno：4，“gssggggsgggssg”公开为seqidno：5，”his6”公开为seqidno：12)

传感器3：nnano-hvamp1-cnano

ncoi-nnano-(1-159)-gssggggsggggssg-saci-人vamp1(35-96)-ecori-gssggggsgggssg-cnano(160-170)-noti-his6-终止(“gssggggsggggssg”公开为seqidno：4，“gssggggsgggssg”公开为seqidno：5，”his6”公开为seqidno：12)

克隆体内测定构建体

bamhi-nnano-(1-159)-gssggggsgggssg-saci-firefly(全长)-ggggs-p25(全长)-ecori-gssggggsgggssg-cnano(160-170)-noti(终止密码子)(“ggggs”公开为seqidno：6和“gssggggsgggssg”公开为seqidno：5)

imac纯化传感蛋白用于体外测定。使用固定化金属亲和柱(imac)纯化传感蛋白的不同构建体。将his6标签(seqidno：12)克隆到pet28a载体中的c-末端。将含有体外构建体的正确质粒的bl21接种过夜，并在37℃培养至o.d.约0.6-0.8，然后在20℃下用0.25mmiptg(终浓度)诱导过夜。通过以4500g离心10分钟收获细胞。之后，将细胞沉淀溶解于50mmhepes，150mmnacl，ph7.4缓冲液中，然后超声处理3分钟。保存细胞裂解物的上清液并在4℃下，伴以旋转与ni2+珠混合1小时。然后，将混合物装入柱中，用20mm咪唑在50mmhepes，150mmnacl，ph7.4缓冲液中的床柱洗涤树脂。最后，将蛋白质在50mmhepes，150mmnacl，ph7.4缓冲液中的4倍床柱500mm咪唑中洗脱。将纯化的传感蛋白质透析到50mmhepes，ph7.1缓冲液中以立即进行测定。

体外测定毒素检测。通过sds-page用标准bsa作为参考估计传感蛋白浓度。在50mmhepes，20μmzncl2，2mmdtt，1mg/mlbsa，ph7.1缓冲液中制备30nm传感蛋白。将肉毒杆菌毒素a稀释并加入到传感蛋白质溶液中，浓度系列为1nm至1fm，稀释倍数为10。在37℃孵育4h和24h后，将nano-glo^tm底物(promega)以相等的体积加入每个样品中。在读板器中测量发光信号。一式两份进行测定。还设计并执行了阴性对照。将bont/a与nnano-vamp-cnano传感蛋白混合或将bont/b与nnano-sv2c-p25-cnano传感蛋白混合。

毒素检测的体内测定(基于细胞的测定)。将双荧光素酶构建体(作为内部对照的萤火虫和用于切割检测的分裂nanoluc^tm)的病毒添加到7天的神经元细胞中，然后将具有300pm至1pm的系列浓度的肉毒杆菌毒素a一式三份添加到13天的神经元细胞中。用毒素攻击48h后，通过加入200μl被动裂解缓冲液(promega)来裂解神经元细胞，并在室温下孵育20分钟。将50μl细胞裂解物与50μl萤火虫荧光素酶底物(one-glo(tm)ex试剂)混合并测量光发射。随后，添加50μlnanoluc^tm荧光素酶底物(nanodlr^tmstop&glo(r)试剂)并测量光发射。

序列表

<110>presidentandfellowsofharvardcollege

<120>用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定

<130>0342941-0630

<140>

<141>

<150>62/410,558

<151>2016-10-20

<160>32

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>170

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成多肽"

<400>1

metvalphethrleugluaspphevalglyasptrpgluglnthrala

151015

alatyrasnleuaspglnvalleugluglnglyglyvalserserleu

202530

leuglnasnleualavalservalthrproileglnargilevalarg

354045

serglygluasnalaleulysileaspilehisvalileileprotyr

505560

gluglyleuseralaaspglnmetalaglnileglugluvalphelys

65707580

valvaltyrprovalaspasphishisphelysvalileleuprotyr

859095

glythrleuvalileaspglyvalthrproasnmetleuasntyrphe

100105110

glyargprotyrgluglyilealavalpheaspglylyslysilethr

115120125

valthrglythrleutrpasnglyasnlysileileaspgluargleu

130135140

ilethrproaspglysermetleupheargvalthrileasnserval

145150155160

thrglytyrargleupheglugluileleu

165170

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<211>159

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成多肽"

<400>2

metvalphethrleugluaspphevalglyasptrpgluglnthrala

151015

alatyrasnleuaspglnvalleugluglnglyglyvalserserleu

202530

leuglnasnleualavalservalthrproileglnargilevalarg

354045

serglygluasnalaleulysileaspilehisvalileileprotyr

505560

gluglyleuseralaaspglnmetalaglnileglugluvalphelys

65707580

valvaltyrprovalaspasphishisphelysvalileleuprotyr

859095

glythrleuvalileaspglyvalthrproasnmetleuasntyrphe

100105110

glyargprotyrgluglyilealavalpheaspglylyslysilethr

115120125

valthrglythrleutrpasnglyasnlysileileaspgluargleu

130135140

ilethrproaspglysermetleupheargvalthrileasnser

145150155

<210>3

<211>11

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

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glyserserglyglyglyglyserglyglyglyglysersergly

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

<400>5

glyserserglyglyglyglyserglyglyglysersergly

1510

<210>6

<211>5

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

<400>6

glyglyglyglyser

<210>7

<211>15

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>source

<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(15)

<223>/注="此序列可包涵1-3'glyglyglyglyser'

重复单元"

<400>7

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>8

<211>18

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

<400>8

lysgluserglyservalsersergluglnleualaglnpheargser

151015

leuasp

<210>9

<211>14

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

<400>9

gluglylysserserglyserglysergluserlysserthr

1510

<210>10

<211>66

<212>prt

<213>未知（unknown）

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成肽"

<400>10

alaarggluasnglumetaspgluasnleugluglnvalserglyile

151015

ileglyasnleuarghismetalaleuaspmetglyasngluileasp

202530

thrglnasnargglnileaspargilemetglulysalaaspserasn

354045

lysthrargileaspglualaasnglnargalathrlysmetleugly

505560

sergly

<210>11

<211>38

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>11

asnthrtyrphelysasncysthrpheileaspthrvalpheaspasn

151015

thraspphegluprotyrlyspheileaspsergluphelysasncys

202530

serphephehisasnlys

<210>12

<211>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<223>/注="人工序列的描述：合成6xhis标签"

<400>12

hishishishishishis

<210>13

<211>550

<212>prt

<213>北美萤火虫（photinuspyralis）

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metgluaspalalysasnilelyslysglyproalaprophetyrpro

151015

leugluaspglythralaglygluglnleuhislysalametlysarg

202530

tyralaleuvalproglythrilealaphethraspalahisileglu

354045

valaspilethrtyralaglutyrpheglumetservalargleuala

505560

glualametlysargtyrglyleuasnthrasnhisargilevalval

65707580

cyssergluasnserleuglnphephemetprovalleuglyalaleu

859095

pheileglyvalalavalalaproalaasnaspiletyrasngluarg

100105110

gluleuleuasnsermetglyileserglnprothrvalvalpheval

115120125

serlyslysglyleuglnlysileleuasnvalglnlyslysleupro

130135140

ileileglnlysileileilemetaspserlysthrasptyrglngly

145150155160

pheglnsermettyrthrphevalthrserhisleuproproglyphe

165170175

asnglutyraspphevalprogluserpheaspargasplysthrile

180185190

alaleuilemetasnserserglyserthrglyleuprolysglyval

195200205

alaleuprohisargthralacysvalargpheserhisalaargasp

210215220

proilepheglyasnglnileileproaspthralaileleuserval

225230235240

valprophehishisglypheglymetphethrthrleuglytyrleu

245250255

ilecysglypheargvalvalleumettyrargphegluglugluleu

260265270

pheleuargserleuglnasptyrlysileglnseralaleuleuval

275280285

prothrleupheserphephealalysserthrleuileasplystyr

290295300

aspleuserasnleuhisgluilealaserglyglyalaproleuser

305310315320

lysgluvalglyglualavalalalysargphehisleuproglyile

325330335

argglnglytyrglyleuthrgluthrthrseralaileleuilethr

340345350

progluglyaspasplysproglyalavalglylysvalvalprophe

355360365

pheglualalysvalvalaspleuaspthrglylysthrleuglyval

370375380

asnglnargglygluleucysvalargglyprometilemetsergly

385390395400

tyrvalasnasnproglualathrasnalaleuileasplysaspgly

405410415

trpleuhisserglyaspilealatyrtrpaspgluaspgluhisphe

420425430

pheilevalaspargleulysserleuilelystyrlysglytyrgln

435440445

valalaproalagluleugluserileleuleuglnhisproasnile

450455460

pheaspalaglyvalalaglyleuproaspaspaspalaglygluleu

465470475480

proalaalavalvalvalleugluhisglylysthrmetthrglulys

485490495

gluilevalasptyrvalalaserglnvalthrthralalyslysleu

500505510

argglyglyvalvalphevalaspgluvalprolysglyleuthrgly

515520525

lysleuaspalaarglysilearggluileleuilelysalalyslys

530535540

glyglylysilealaval

545550

<210>14

<211>206

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>14

metalagluaspalaaspmetargasngluleugluglumetglnarg

151015

argalaaspglnleualaaspgluserleugluserthrargargmet

202530

leuglnleuvalglugluserlysaspalaglyileargthrleuval

354045

metleuaspgluglnglygluglnleugluargileglugluglymet

505560

aspglnileasnlysaspmetlysglualaglulysasnleuthrasp

65707580

leuglylysphecysglyleucysvalcysprocysasnlysleulys

859095

serseraspalatyrlyslysalatrpglyasnasnglnaspglyval

100105110

valalaserglnproalaargvalvalaspgluarggluglnmetala

115120125

ileserglyglypheileargargvalthrasnaspalaarggluasn

130135140

glumetaspgluasnleugluglnvalserglyileileglyasnleu

145150155160

arghismetalaleuaspmetglyasngluileaspthrglnasnarg

165170175

glnileaspargilemetglulysalaaspserasnlysthrargile

180185190

aspglualaasnglnargalathrlysmetleuglysergly

195200205

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>source

<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"

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atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactgggaacagacagccgcctacaacctg60

gaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgctgcagaatctcgccgtgtccgta120

actccgatccaaaggattgtccggagcggtgaaaatgccctgaagatcgacatccatgtc180

atcatcccgtatgaaggtctgagcgccgaccaaatggcccagatcgaagaggtgtttaag240

gtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgccctatggcacactggta300

atcgacggggttacgccgaacatgctgaactatttcggacggccgtatgaaggcatcgcc360

gtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatc420

gacgagcgcctgatcacccccgacggctccatgctgttccgagtaaccatcaacagtggg480

agttccggtggtggcgggagcggaggtggaggctcgagcggtggagctcagaacacctac540

ttcaagaactgcacatttattgacactgtttttgacaacacagattttgagccatataaa600

ttcattgacagtgaatttaaaaactgctcgttttttcacaacaaggggggcggaggttcc660

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atcatggagaaggctgactccaacaaaaccagaattgatgaagccaaccaacgtgcaaca840

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gggtcgtcaggtgtgaccggctaccggctgttcgaggagattctggcggccgcactcgag960

caccaccaccaccaccactga981

<210>16

<211>118

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>16

metseralaproalaglnproproalagluglythrgluglythrala

151015

proglyglyglyproproglyproproproasnmetthrserasnarg

202530

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argvalasnvalasplysvalleugluargaspglnlysleuserglu

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serseralaalalysleulysarglystyrtrptrplysasncyslys

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metmetilemetleuglyalailecysalaileilevalvalvalile

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valiletyrphephethr

115

<210>17

<211>21

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>17

glygluglylysgluaspalapheserlysleulysglnlysphemet

151015

asngluleuhislys

<210>18

<211>21

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>18

glygluserglngluaspmetphealalysleulysglulysphephe

151015

asngluileasnlys

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<211>28

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>19

leusergluleuaspaspargalaaspalaleuglnalaglyalaser

151015

glnphegluthrseralaalalysleulysarglys

2025

<210>20

<211>28

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>20

leusergluleuaspaspargalaaspalaleuglnalaglyalaser

151015

glnphegluthrseralaalalysleulysarglys

2025

<210>21

<211>28

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>21

leusergluleuaspaspargalaaspalaleuglnalaglyalaser

151015

glnphegluserseralaalalysleulysarglys

2025

<210>22

<400>22

000

<210>23

<211>206

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>23

metalagluaspalaaspmetargasngluleugluglumetglnarg

151015

argalaaspglnleualaaspgluserleugluserthrargargmet

202530

leuglnleuvalglugluserlysaspalaglyileargthrleuval

354045

metleuaspgluglnglygluglnleugluargileglugluglymet

505560

aspglnileasnlysaspmetlysglualaglulysasnleuthrasp

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leuglylysphecysglyleucysvalcysprocysasnlysleulys

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serseraspalatyrlyslysalatrpglyasnasnglnaspglyval

100105110

valalaserglnproalaargvalvalaspgluarggluglnmetala

115120125

ileserglyglypheileargargvalthrasnaspalaarggluasn

130135140

glumetaspgluasnleugluglnvalserglyileileglyasnleu

145150155160

arghismetalaleuaspmetglyasngluileaspthrglnasnarg

165170175

glnileaspargilemetglulysalaaspserasnlysthrargile

180185190

aspglualaasnglnargalathrlysmetleuglysergly

195200205

<210>24

<211>118

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>24

metseralaproalaglnproproalagluglythrgluglythrala

151015

proglyglyglyproproglyproproproasnmetthrserasnarg

202530

argleuglnglnthrglnalaglnvalglugluvalvalaspileile

354045

argvalasnvalasplysvalleugluargaspglnlysleuserglu

505560

leuaspaspargalaaspalaleuglnalaglyalaserglnpheglu

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serseralaalalysleulysarglystyrtrptrplysasncyslys

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metmetilemetleuglyalailecysalaileilevalvalvalile

100105110

valiletyrphephethr

115

<210>25

<211>116

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>25

metseralathralaalathralaproproalaalaproalaglyglu

151015

glyglyproproalaproproproasnleuthrserasnargargleu

202530

glnglnthrglnalaglnvalaspgluvalvalaspilemetargval

354045

asnvalasplysvalleugluargaspglnlysleusergluleuasp

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aspargalaaspalaleuglnalaglyalaserglnphegluthrser

65707580

alaalalysleulysarglystyrtrptrplysasnleulysmetmet

859095

ileileleuglyvalilecysalaileileleuileileileileval

100105110

tyrpheserthr

115

<210>26

<211>100

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>26

metserthrglyprothralaalathrglyserasnargargleugln

151015

glnthrglnasnglnvalaspgluvalvalaspilemetargvalasn

202530

valasplysvalleugluargaspglnlysleusergluleuaspasp

354045

argalaaspalaleuglnalaglyalaserglnphegluthrserala

505560

alalysleulysarglystyrtrptrplysasncyslysmettrpala

65707580

ileglyilethrvalleuvalilepheileileileileilevaltrp

859095

valvalserser

100

<210>27

<211>288

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>27

metlysaspargthrglngluleuargthralalysaspseraspasp

151015

aspaspaspvalalavalthrvalaspargaspargphemetaspglu

202530

phephegluglnvalglugluileargglypheileasplysileala

354045

gluasnvalglugluvallysarglyshisseralaileleualaser

505560

proasnproaspglulysthrlysglugluleuglugluleumetser

65707580

aspilelyslysthralaasnlysvalargserlysleulysserile

859095

gluglnserilegluglnglugluglyleuasnargserseralaasp

100105110

leuargilearglysthrglnhisserthrleuserarglyspheval

115120125

gluvalmetserglutyrasnalathrglnserasptyrarggluarg

130135140

cyslysglyargileglnargglnleugluilethrglyargthrthr

145150155160

thrserglugluleugluaspmetleugluserglyasnproalaile

165170175

phealaserglyileilemetaspserserileserlysglnalaleu

180185190

sergluilegluthrarghissergluileilelysleugluasnser

195200205

ilearggluleuhisaspmetphemetaspmetalametleuvalglu

210215220

serglnglyglumetileaspargileglutyrasnvalgluhisala

225230235240

valasptyrvalgluargalavalseraspthrlyslysalavallys

245250255

tyrglnserlysalaargarglyslysilemetileileilecyscys

260265270

valileleuglyilevalilealaserthrvalglyglyilepheala

275280285

<210>28

<211>288

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>28

metlysaspargthrglngluleuargseralalysaspseraspasp

151015

gluglugluvalvalhisvalaspargasphisphemetaspgluphe

202530

phegluglnvalglugluileargglycysileglulysleuserglu

354045

aspvalgluglnvallyslysglnhisseralaileleualaalapro

505560

asnproaspglulysthrlysglngluleugluaspleuthralaasp

65707580

ilelyslysthralaasnlysvalargserlysleulysalaileglu

859095

glnserilegluglnglugluglyleuasnargserseralaaspleu

100105110

argilearglysthrglnhisserthrleuserarglysphevalglu

115120125

valmetthrglutyrasnalathrglnserlystyrargaspargcys

130135140

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145150155160

asnglugluleugluaspmetleugluserglylysleualailephe

165170175

thraspaspilelysmetaspserglnmetthrlysglnalaleuasn

180185190

gluilegluthrarghisasngluileilelysleugluthrserile

195200205

arggluleuhisaspmetphevalaspmetalametleuvalgluser

210215220

glnglyglumetileaspargileglutyrasnvalgluhisserval

225230235240

asptyrvalgluargalavalseraspthrlyslysalavallystyr

245250255

glnserlysalaargarglyslysilemetileileilecyscysval

260265270

valleuglyvalvalleualaserserileglyglythrleuglyleu

275280285

<210>29

<211>852

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>source

<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400>29