抗A型肉毒毒素的人源单链抗体D2-scFv及其应用

抗A型肉毒毒素的人源单链抗体D2-scFv及其应用
【专利摘要】本发明提供了抗A型肉毒毒素的人源单链抗体D2?scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontAL，及筛选抗A型肉毒毒素的人源单链抗体的底物GFP?HIS6?SNAP25（62）?VAMP（57）?C，在人源化抗A型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（6.89±0.65）×106L/mol，为生产抗A型肉毒毒素特效救治药物及快速检测A型肉毒毒素奠定了基础。
【专利说明】
抗A型肉毒毒素的人源单链抗体D2-SCFV及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属生物技术领域，具体设及抗A型肉毒毒素的人源单链抗体D2-SCFV，及其 在生产治疗A型肉毒毒素中毒药物方面、检测A型肉毒毒素方面的应用。
【背景技术】
[0002] 肉毒毒素是一种嗜神经蛋白毒素，能致使人及动物毒，少至0.1~1.化g含量可致人 中毒身亡。它已被美国疾病控制和预防中屯、指定为对人类的威胁类似于炭痘的生物武器， 被列为六个最主要的生物战剂之一。依据毒素进入体内途径的不同分为四个类型，一、食源 性中毒;二、婴儿感染性肉毒中毒;S、创伤性肉毒中毒;四、吸入性中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到 环境或培养液中，运种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 W)a到900 kDa。前 体毒素通常W复合体的形式存在，由神经毒素(Bont),由一个或多个能够包围和保护毒素 的非毒性蛋白组成，包括血凝素(HA)，非毒素非血凝素(NTNH)。临床上所说的肉毒毒素通常 指具有神经毒性作用的神经毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在屯种血清型(4、8、(：、0、6、。、6、），近年来又 发现第八种血清型。尽管屯种血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是 它们有着相近的分子量和相似结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肤组成，蛋白质 成熟时通过细菌介导的蛋白酶将ISOkDa的单链多肤切割裂解成两个不相等的多肤片段，两 个片段由一个二硫键连接，形成一个分子量为SOkDa的轻链片段（LC)和一个分子量为 100W)a的重链片段(HC)。其中轻链有一个催化功能域，重链由同轻链并列的a-螺旋转导域 化区，激发转导的Hcn功能区和神经节巧脂结合区也細成。与化区紧邻是一个含有54个氨基 酸肤段，即所谓的带区，具有封闭轻链酶活性区，防止轻链折叠构象改变。轻链为锋离子肤 链内切酶活性功能区，由Q-螺旋和e-折叠共同组成球形结构。单独的轻链和重链均无毒性， 只有双链才具有生物学毒性。
[0005] 轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锋离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释 放。肉毒毒素的活性区埋藏(~20 A深)于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状神 经毒素的活性位点包括一个单一的锋原子，运个锋原子历来被认为有功能，但是不起结构 性作用。可W通过用金属馨合剂去除锋，但是通过在二级结构上加入游离的锋原子来重新 获得锋，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当于 原来的30%。位于轻链中屯、有一个高度保守的锋结合模块肥xxH (X是任意的氨基酸)序列。 皿XXH序列中含有一个由3个组氨酸整合的锋离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性蛋白 水解活性，运个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。
[0006] 在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉毒 毒素轻链上的化S 222, Glu223和化S226残基共同组成了锋结合模块肥X址序列的一部 分，并且在协调活性区锋(His 222和化S226)和一个水分子(Glu223残基）的作用机制中起 了直接的作用。G1U261是协调锋的第=配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机理与嗜 热菌蛋白酶是相似的，运是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也是相似 的。从G1U223到Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除化S226使A型肉毒毒素失去了催化 活性。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显降低，但是不影响锋结合和底物结 合，人们提出，运些残基在过渡态稳定中发挥了作用。
[0007] 另外，在LC活性中屯、还有一些氨基酸残基，如化e266、Glu350Arg363和Tyr366。它 们的功能主要是维持和稳定轻链活性中屯、的结构和/或它与被结合底物的相对位置，W此 保证轻链最佳的酶解能力。
[0008] LC通过二硫键与肥的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链化结构域形成一 条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn2+催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在双链 毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锋离子内肤酶活性，催化部位 能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锋离子除同4个组氨酸残基的咪挫环、1个结合 于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸簇基形成配位键，1个色氨酸 分子很可能也参与锋离子的配位。毒素轻链的运种独特锋离子配位形式、空间结构与其他 所有已知的金属蛋白酶的=维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病机理 1、祀细胞的识别与结合 前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会 受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是W扩散的方式，而是W"内 凹"和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠 的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋己循环，在运动神经和交 感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官，但不能穿透血脑屏障， 其惟一的亲和祀点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制神经 递质乙酷胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻搏。在运一毒性作用过程中，神经毒素 的各功能域都有参与，具体的过程可分为=个阶段。
[0010] 祀细胞的结合与内化在祀细胞的识别与结合运一过程中，肉毒毒素重链的结合域 发挥了作用。结合域能够识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动 神经元的神经节巧脂和位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的 GD化，GHb和GQ化类神经节巧脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节巧脂连接到神 经酷胺。通过对神经节巧脂分布及对其亲和结合力的研究，可W确定，神经节巧脂不是唯一 能促进肉毒毒素结合的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已 经结合到了蛋白受体上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了A、B和E型的内化 作用，但是梭菌属家族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是 特异性同源的，B型肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神 经毒素与神经节巧脂结合的一个"锁和钥匙"原理。运个观察成功说明了一个观点，那就是 神经节巧脂结合使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。
[0011] -旦结合到神经元表面，母体分子裂解，重链和轻链通过锋原子结合到达神经元 细胞膜，并且被内化进入细胞囊泡，形成一个包裹着毒素分子的酸性小囊泡。即内化过程。 运一受体介导的内吞过程与时间，溫度及突触活动均有关。
[0012] 2、易位肉毒毒素的轻链必须从囊泡小室或者胞内体中出来，并且在H链N-末端作 用下的通过膜运输能够成功进入细胞溶质的祀蛋白，运一过程是称为轻链易位； 与其它梭菌毒素一样，肉毒毒素进入细胞内的酸性小泡后，会因 pH的变化而发生结构 重组。尽管进入突触小泡和胞内小泡是显而易见，但是肉毒毒素易位进入胞内小泡的特性 尚未断然确定。抑的降低使肉毒毒素结构发生变化，从而导致其在分子中有较大的疏水性， 并且增加了脂双层的渗透性。运样毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双层内，一旦嵌入， 就会在憐脂双层和PC12膜上形成离子通道。运个通道是具有选择性的，分子量大的分子无 法通过，所W目前普遍认为毒素轻链可W通过离子通道从小泡腔内转运到神经细胞胞质。 据此有S种轻链跨膜转运假说模型，即管道模型（tunnel model),裂缝模型山16的model) 和裂解模型（lysis model)。其中裂缝模型理论认为，在低抑时，蛋白质的分子构想发生了 改变，此时HC可形成一个亲水性的裂隙，并且在轻链穿膜过程中将其亲水表面包围。在此模 式中形成了亲水性和疏水性的相互作用。轻链的簇基端因为二硫键与重链氨基端相连而最 先进入到胞质。实现易位后，由于胞质的抑高于酸性小泡，使轻链结构重新折叠，重新回到 具有催化活性。
[0013] 在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域发生构象上的变化，最终跨越人工膜形成离 子通道，并且在体内抑的环境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成的 离子通道与白喉毒素形成的相似，并且也是只在低pH下形成。肉毒毒素离子通道只允许阳 离子通过，但是可W在体外阻止氯哇。然而对于小孔径离子通道的研究，我们尚未清楚肉毒 毒素形成的通道是不是毒素轻链进入细胞溶质的必经之路。数据显示，在低抑下轻链的结 构有一个戏剧性的变化，就是可能产生一个选择性的LC结构并且更适合于易位。尽管运在 体内还没被证实，但是通过低P出秀导结构变化是完全可逆的。
[0014] 肉毒毒素能够在神经传递发挥作用，就必须通过蛋白水解使LC与HN接头处暴露的 表面产生缺口，从而使非活性的单链分子量为150-kDa的毒素活化。少数的细菌和组织蛋白 酶能够实现运个裂解反应，并产生有活性的双链神经毒素。产生切口后，轻链和重链仍然通 过非共价键相互作用，并且由一个单一的二硫键连接。运种链间的二硫键(A型肉毒毒素中 的切S430-切S454)的减少是轻链活化的第二阶段，运是轻链自由进入运动神经元胞质溶胶 和与底物间相互作用必不可少的阶段。正如前面提到的，在低抑情况下，轻链有一个戏剧性 的变化。运种结构的变化有助于易位带(如果在易位点HN域确实是靠近轻链)的重组和导致 轻链的最终活化。神经元信号转导通路可W与肉毒毒素-LC活动密切联系在一起的。因此， 轻链活化的完成最终可能是发生在胞质溶胶中的，紧接着从低抑的小室中易位。
[00巧]3、抑制神经递质释放 神经小结处有突触小囊泡，其中包含乙酷胆碱，它是能穿过神经肌肉接头刺激肌肉收 缩的一种神经递质。该乙酷胆碱的小囊泡被一个叫做SNARE复合体的蛋白聚合物所结合。为 了穿过神经肌肉交界处实现信号的传递，突触前神经小结中的乙酷胆碱小囊泡必须被释放 到突触间隙中。在运里，神经递质在肌肉板上结合到特定受体上，触发离子通道打开，从而 导致相邻横纹肌的去极化和收缩。乙酷胆碱的释放，需要有SNARE蛋白的参与，它能够介导 突触小泡与神经元细胞膜的融合。
[0016] SNARE复合体蛋白参与突触小泡上质膜融合，而肉毒毒素轻链的作用是阻碍胞吐 作用。更具体地说，就是在肌肉接头处，神经毒素通过切割SNARE蛋白（乙酷胆碱分子胞吐作 用所必须的物质)阻断了囊泡内容物释放到细胞外环境中，抑制乙酷胆碱的释放，从而抑制 神经传递。据证实，单独的SNARE蛋白裂解不会妨碍SNARE复合体形成，但是却会导致非功能 性复合物在化h内流和融合之间的禪合被破坏。毒素在抑制神经递质释放时，需要化h的参 与，而在突触末梢化浓度增加会影响肉毒毒素的作用效果。
[0017]轻链作为锋肤链内切酶蛋白切割致使SNARE复合物不稳定，成为非功能性，从而抑 制乙酷胆碱释放到突触间隙。囊泡释放到突触间隙的数量越少，动作电位传播的概率就越 低，从而引起肌肉纤维的收缩。结果导致肌肉自身的化学去神经术而引起弛缓性麻搏。现有 研究表明SNARE复合物由VAMP、SNAP-25和syntaxinS种蛋白质组成，下表所示为不同类型 的肉毒毒素的祀蛋白及其切割位点。
[001 引
隧菌体展示技术的基本原理是把外源DNA插入隧菌体编码外壳蛋白pin或pVIiI的基 因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在隧菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白（fusion protein),呈现在隧菌体表面。隧菌体展示技术的显著优点是:建立了基因型(genotype)和 表型(phenotype)之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。将外源蛋白或多肤表达于隧 菌体表面，就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对含目的基因的隧菌 体进行筛选。W隧菌体抗体库的筛选为例，将化Mfragment antigen binding)表达在隧菌 体表面，W相应的抗原为亲和性配体筛选，可W快速高效地从大量克隆中筛选表达特异性 抗体的隧菌体。因此，用隧菌体展示技术制备高亲和性抗体与传统的杂交瘤单克隆抗体技 术相比具有明显的优势。
[0019] 隧菌体抗体在膜表面表达，是通过化b段或ScFv与单链隧菌体外壳蛋白形成融合 蛋白而完成。其特点是"它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行再扩 增"。利用其可再扩增的特性，W祀抗原通过亲和吸附-洗脱-扩增，可筛选到祀分子的配体 肤链。再经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终便获得高亲和力的特异性抗体。隧菌体 抗体库的筛选包括两个主要步骤:淘筛和鉴定。淘筛是将隧菌体抗体库与选择用的抗原共 同解育，通过几轮洗脱，收集结合的隧菌体。将获得的隧菌体感染细菌并扩增，再进行下一 轮的淘筛。经几轮淘筛后，便可富集到与抗原特异性结合的隧菌体感染的多克隆菌株。鉴定 过程是从隧菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株。即将淘筛出的隧菌体感染细菌、 铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株。
[0020] 从隧菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的隧菌体的经典方法主要有两种：（1)将 纯抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的隧菌体， 洗去非亲和性或低亲和性的隧菌体，回收高亲和性的隧菌体。（2)将抗原与生物素基团相 连，再将其固定在包被有Streptavidin的顺磁珠上对隧菌体进行筛选。两种方法中均需加 脱脂牛奶(或BSA，其效果较差)封闭未被抗原占据的位点，W避免隧菌体非特异性的结合。 对于前一方法，回收与抗原特异性结合的隧菌体可用碱性溶液（如S乙基胺，Uriethy- Iamine)或酸性溶液(如甘氨酸一盐酸，glycine_HCl)洗脱，或用可溶的抗原或半抗原洗脱； 对于后一方法，用二琉基苏糖醇(dithiothret01，DTT)通过破坏抗原与生物素之间的二硫 键来洗脱。回收的隧菌体感染宿主菌，增殖后进行下一轮筛选。一般经过3-5轮运样的筛选 可得到表达高亲和性的目的抗体的克隆。每一轮筛选都需要进行检测，W证实筛选的有效 性。
[0021] 英国MRC HGMP资源中屯、创建的Human Single Fold scFv Libraries I+J( Tomlinson I + J)是当今成熟的全人源隧菌体抗体库，其库容超过IO8全人源隧菌体单链 抗体，本研究利用该隧菌体库淘选特异性抗A型肉毒毒素单链抗体，并对阳性单链抗体进行 系统分析，W期创制A型肉毒毒素中毒治疗抗体类药物奠定物质基础。
[0022] 本发明人通过对肉毒毒素的作用机理的了解及研究，确定肉毒毒素能够引起人畜 共患病，且主要攻击体内的神经突触系统，其致病机理为，肉毒毒素通过其重链C端结构域 结合于胆碱能神经元的突触前膜，形成毒素受体复合物内化进入细胞囊泡，然后轻链锋内 肤酶酶活性区从细胞内的酸性空间释放进入细胞质。一旦从囊泡中释放出来，轻链通过切 害化NARE复合物蛋白来阻止乙酷胆碱的释放，引起肌肉麻搏。因此轻链为主要的致病部位。 目前，世界上中毒还是WA型居多，运是由于A型毒素在美容领域和医学领域应用的增加，其 中毒的风险和几率也相应增加。

【发明内容】

[0023] 本发明的目的是为解决异源性血清抗体在治疗A型肉毒毒素中毒，存在引起免疫 反应或传染疾病的问题，而提供一种全人源的单链抗体ScFv,抗A型肉毒毒素的人源单链抗 体D2-scFv。
[0024] 抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体02-scFv，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 5所 示； 抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体02-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示； 抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体D2-SCFV在生产治疗A型肉毒毒素酶中毒药物方面的 应用； 抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体D2-SCFV在检测A型肉毒毒素方面的应用。
[0025] 本发明提供了抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体D2-SCFV，它是利用人工合成的重 组蛋白BontA轻链蛋白，及筛选抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体的底物GFP-HIS6-SNAP25 (62)-VAMP(57)-C，人源化抗A型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（6.89± 0.65) X 106IVmo 1，为生产抗A型肉毒毒素特效救治药物及快速检测A型肉毒毒素奠定了基 础。
【附图说明】
[00%] 图1为双酶切重组质粒祀T-28(a)-BoNT/AL质粒鉴定结果；1.3.5.7为祀T-28(a)- 8〇饥'/41^切前;2.4.6.8质粒酶切后;]\1.0臟111曰'1?5'01^2000; 图2为重组蛋白表达形式鉴定其中：1.3.5.7分别为37°(：、阴性对照、25°(：、30°(：诱导上 清;2、4、6、8:37 °C、阴性对照、25 °C、30°C诱导沉淀;M:蛋白质Marker; 图3为重组蛋白包涵体洗涂的SDS-PAGE结果分析;其中：1-3:0.5%、1%、2%Trition洗涂 上清;4-9: Imol、2mol、3mol、4mol、6mol、SmolUrea洗涂上清；10-12: 4mol、6moUSmolUrea 洗涂沉淀样品;M:蛋白质Marker; 图4为重组蛋白纯化产物SDS-PAGE结果分析；1:0.1mol/LNaOH ; 2:200mmol/L咪挫洗脱 样品；3-4:50 mmol/L咪挫洗脱峰2、峰1; 5-6:20 mmol/L咪挫洗脱峰2、峰1; 7:流川;8:原样； M:蛋白Marker; 图5重组蛋白复性结果分析，1:复性蛋白；M:蛋白Marker; 图6纯化后E3-scFvSDS-PAGE结果分析；l:流穿2:55%硫酸锭原样3:纯化后scFv。
【具体实施方式】 [0027] 实施例1: A型肉毒毒素轻链基因与PET-2fe载体连接 WpGEM-BontA质粒为模板，设计特异性引物如下： PIa:5' -CATGCATATGAATAAACAATTTAATTATAAAGATC-3' P2a:5' - CGGAATTCTTAATTGTATCCTTTATCTAATGATT-3' PCR合成两端插入Eco昭和Me；[酶切位点的BontAL基因，产物经琼脂糖凝胶电泳分析后 回收目的片段。经测序其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[002引将EcoR!和Nde!双酶切的载体阳T-2姑大片段与目的基因 BontAL小片段回收，并用 T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒阳T-28a-BontAL，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan 抗性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒 提取质粒。
[0029] 用限制性内切酶进行双酶切鉴定，并送检测序鉴定。琼脂糖凝胶电泳分析酶切前 后条带位置变化，并且在预期目的条带位置处有相应大小的片段(见图1)。证明目的基因已 连接至载体上，成功构建阳T-28a-BontAL。
[0030] 实施例2:重组蛋白阳T-28a-BontAL表达产物的SDS-PAGE结果分析 将重组质粒阳T-28a-BontAL转化至表达菌-大肠杆菌化2UDE3)，不同溫度条件下IPTG 诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：37 °C、30 °C沉淀中重组蛋白阳T-28a-BontAL在50邸左右处 有一明显表达带，大小与理论值相符;见图2;并且绝大部分蛋白位于沉淀中，因此此目的蛋 白为包涵体表达。
[0031] 实施例3:包涵体蛋白BontAL的洗涂 包涵体的纯化处理，首先对包涵体进行洗涂，除去部分杂质，然后溶解打开包涵体，使 聚合在一起的蛋白彼此在裂解液的条件下打开分离，然后进一步纯化目的蛋白。
[0032] 用不同含量的化ition对包涵体进行洗涂，Trition变形能力弱，只能起到初步洗 涂的作用。随后逐步增加尿素浓度，渐进的洗涂打开包涵体，SDS-PAGE分析得到，2%的 Trition能够去除部分杂质，2M尿素也有此作用，4M尿素开始目的蛋白开始分离，8M尿素能 够完全打散包涵体，如图3。
[0033] 实施例4:包涵体蛋白BontAL的纯化和复性 经8M尿素溶解的包涵体，上清经金属馨合层析Cu2+柱，收集200mmol咪挫洗脱蛋白。 SDS-PAGE分析如图4，除去了大部分杂质。
[0034]用逐步透析复性的方法，每隔12个小时更换透析液，直至完全透析至化is中，用金 属馨合层析化进行浓缩。蛋白透析至PBS中。SDS-PAGE鉴定如图5,复性蛋白纯度W达到。 [0(X3日]实施例5:全人源抗Bont-AkscFv抗体的筛选 纯化的重组蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4°C过夜。次日弃上清，用2%的Milk-PBS 37°C封闭化，加入隧菌体抗体库(隧菌体库原始来源:Source Moscience(英国），中国经销 商：北京西美科技有限公司），滴度为I.OXIOU，室溫下剧烈晃动解育60min，静置60min。后 弃去液体，用含0.1%Twenn-20的PBS洗涂10次，洗涂后将每孔中残留的液体轻轻拍干，每孔 加入5化L洗脱液巧mg/mL的膜酶-PBS)，室溫下剧烈晃动lOmin，洗脱隧菌体，收集4°C保存。
[0036] 用洗脱下的隧菌体侵染E. COli TGl，并涂布于TYE平板上(含10化g/mLAmp和1%的 葡萄糖）37°C过夜培养。利用辅助隧菌体KM13扩增隧菌体库，通过PEG/化Cl回收隧菌体。重 复W上过程3次，共4轮筛选，收集筛选的隧菌体库。
[0037] 实施例6:抗Bont-AkscFv阳性菌株鉴定 筛选后的隧菌体侵染凡皿2151，诱导表达后，利用化ISA鉴定，置酶标仪测定OD值 (波长为490nm)，每个样品做双孔测定，取OD平均值。W2%MUk-PBS为阴性对照，阳性克隆菌 株确定标准为:〇D值为阴性对照的3倍W上，共获得27株阳性克隆菌株。
[0038] 阳性菌株生物活性检测，将GFP-SNAP25-VAMP(氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2 所示，其基因序列SEQ ID NO. 3所示）用包被液稀释，每孔包被30yg于检测板（Pierce Maleimide Activated 96-well Plates,Black, 15153)中，4°C过夜，用Wash buffer洗涂3 次，将27株阳性菌株，诱导表达离屯、后，将10化L上清和6 yg Bont-AL混匀，加入到检测板 中，37°C作用化，每份样品做双孔测定，再用Wash buffer洗涂3次，在多功能酶标仪上检测 巧光强度，得出2株活性较好的菌株。按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2载体的基因序 列，合成两条特异性PCR引物扩增SCFv全基因片段。
[0039] Pl LMB3: 5'一CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' P2 P肥N: 5' 一CTA TGC GGC CCC ATT CA-3' 经检测2株阳性菌株，均能够出现明显867bp条带，含有完整的scFv。
[0040] 测序鉴定其序列并经Blast数据库分析得出：得出2株阳性菌株均为人源单链抗 体，分析如下：



实施例7:抗Bont-AkscFv纯化W及抗体亲和常数KD值测定 2株强阳性克隆菌株在37°C培养，至0D600到0.9,加入诱导剂30°C培养过夜（1化），过夜 培养物4°C，3500 X g离屯、30min，上清为表达的SCFv，大小为31000。诱导上清先后经过55%饱 和度硫酸锭沉淀和巧rotein-A亲和层析后，得到纯度在90%W上的样品。
[0041 ]利用非竞争酶免疫法测定D2和E3单链抗体的亲和常数，分别W4 yg/mL、化g/mL、l yg/mL和0.5 yg/血包被Bont-AL，将单链抗体浓度调整到10-6 mol/L，倍比稀释1: 2~1:512， 用1: 5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定0D49化m吸光值，每个样品 做双孔测定，取OD平均值。根据抗原抗体结合反应的S形曲线图，能够求解出在不同抗原浓 度下板书吸光值的抗体浓度，带入到公式KA=(n-l)/2(nAb'-Ab)计算亲和常数，其中Ab'和 Ab表示当抗原为Ag'和Ag时，产生半数吸光值的抗体浓度(mol/L)，n=Ag/Ag'，当n=2时可W 得到3个KA值，n=4时可得2个KA值，n=8时得1个KA值，把六个KA值取平均数就是最终的亲和 常数数值。
[0042] 从下表可看出D2单链抗体的亲和常数为(6.89±0.65) X IO6IVmol，E3的亲和常数 为（1.92±0.47)Xl〇7L/mol。
【主权项】
1. 抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体似，其特征在于:碱基序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。2. 抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体D2-SCFv，其特征在于：氨基酸序列如序列表SEQ ID NO .6所示。3. 根据权利要求1所述的抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体D2-SCFV在生产治疗A型肉 毒毒素酶中毒药物方面的应用。4. 根据权利要求1所述的抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体D2-SCFV在检测A型肉毒毒 素方面的应用。
【文档编号】A61K39/40GK105924520SQ201610520548
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】岳玉环, 徐艳玲, 张国利, 田园, 吴广谋, 刘雨玲, 李泽鸿, 周博, 田多, 王冬冬, 马洪媛, 吉元刚, 李健
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所