本发明涉及黄曲霉毒素b1的检测，具体涉及一种检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条及其制备方法和应用。
技术背景
粮食在储存、运输和加工过程中由于温度和湿度的影响，容易滋生黄曲霉，进而产生黄曲霉毒素(aflatoxin)。黄曲霉毒素(aft)是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒代谢产物，目前已发现20余种，它们都有致癌作用，其中黄曲霉毒素b1(afb1)的毒性、致癌性、污染频率均居于首位，主要作用靶器官是肝脏，有强烈的致癌作用，在1993年被世界卫生组织(who)国际癌症研究机构认定为一级致癌物。afb1主要存在于谷物、坚果、花生、动物饲料等相关产品中，目前有报道水中也含有黄曲霉毒素。因此，对黄曲霉毒素b1进行快速灵敏检测是保证食品安全和人们身体健康的有效措施。
目前，黄曲霉毒素b1的检测方法主要包括酶联免疫吸附法(elisa)、免疫亲和柱-荧光分光光度计法(sfb)、免疫亲和柱-高效液相色谱法(iac-hplc)以及高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)等。其中，hplc法测定准确，分辨率高，可同时测定多种黄曲霉毒素成分，完成定性、定量测定而被广泛应用，但由于食品样品中含有大量化合物，需要对测量样品进行净化处理以及对毒素进行富集，操作步骤繁琐，耗时费力，并且仪器价格昂贵，需要专业人员操作，不适合于大批量样品的检测；elisa检测方法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、能进行批量检测等优点，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。因此急需开发新的快速简单灵敏的黄曲霉毒素b1检测方法。
纳米金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测。目前通常将抗体作为生物识别因子，利用抗原抗体的特异性识别进行检测，但是抗体成本较高，不方便保存，而且制备抗体时需要活体中产生免疫，批次稳定性较差。核酸适配体作为一种新型识别分子，是通过selex技术从1014-1018文库中筛选出来的，具有极高的亲和力和特异性，与抗体相比，具有易于合成制备、性能稳定、便于修饰等优点，已被用于多种物质的检测。因此，研制快速、灵敏、高效的黄曲霉毒素b1核酸适配体试纸条对于保障食品安全具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条。
本发明所提供的检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、支撑层及配套试剂；
所述配套试剂为纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液，所述黄曲霉毒素b1适配体的核苷酸序列为：5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，其3’端采用巯基修饰；
所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液，所述探针1的核苷酸序列为：5’-gtgggcctagcgaagggcacgagacacagagagacaacacgtgcccaac-3’，其3’端标记生物素；所述质控线包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液，所述探针2的核苷酸序列为：5’-tttttttttttttttttt-3’，其3’端标记生物素。
所述链霉亲和素为巯基化链霉亲和素。
所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在所述支撑层上。
所述支撑层为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫为吸油纸；所述吸水垫为吸水纸。
本发明的另一个目的是提供一种上述检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条的制备方法，其包括步骤：
1)制备纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液；
2)制备具有包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液的检测线和包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液的质控线的硝酸纤维素膜；
3)将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在支撑层上。
具体地说，步骤包括：
1)黄曲霉毒素b1适配体、检测线处的探针1、质控线处的探针2的选择及合成；
2)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备纳米金；
3)将合成的黄曲霉毒素b1适配体与制备的纳米金自组装，得到纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液；
4)分别将生物素修饰的探针1和生物素修饰的探针2与链霉亲和素溶液混合、反应，得到生物素化探针1-链霉亲和素溶液和生物素化探针2-链霉亲和素溶液；
5)分别将生物素化探针1-链霉亲和素溶液和生物素化探针2-链霉亲和素溶液包被于硝酸纤维素膜的检测线(t)和质控线(c)；
6)将样品垫置于含质量百分数为1％牛血清白蛋白、2％蔗糖和0.5％吐温-20的10mmol/lpbs缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h；
7)在支撑层上按顺序粘贴上样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
上述检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条在检测黄曲霉毒素b1中的应用也是本发明保护的范围。
本发明试纸条的检测原理：将样品和纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液混合、反应，如果样品中有黄曲霉毒素b1，则黄曲霉毒素b1就会和纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体结合形成复合物，滴入到样品垫上后，在层析作用下一起向硝酸纤维素膜扩散。当移动到检测线时，未被样品中黄曲霉毒素b1结合的游离的纳米金标记的适配体就会和检测线上的互补dna探针结合而显色。样品中黄曲霉毒素b1越多，剩余游离的纳米金标记的适配体就会越少，检测线处的显色强度越低，以此来检测样品中的黄曲霉毒素b1的含量。
本发明具有以下有益效果：
(1)灵敏度高。本发明的试纸条以纳米金标记适配体制备而成，适配体对目标靶分子具有更高的亲和力；同时去掉了传统的结合垫，让适配体和目标靶分子先预混反应，两者结合更充分，使得试纸条检测的视觉灵敏度达到0.01μg/ml，仪器检测的灵敏度可达到1.05ng/ml；
(2)特异性强。本发明的试纸条通过选择特异性强的适配体，与其他霉菌毒素基本没有交叉，因此避免了其他霉菌毒素的干扰；
(3)操作简单。使用本发明的试纸条检测黄曲霉毒素b1时无需其他任何试剂，只要将处理后的样品溶液与纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液混合后滴入样品垫，20min内即可获得实验结果，可以大大提高检测效率，实现黄曲霉毒素b1的现场快速检测；
(4)第一次采用巯基化链霉亲和素(gsa)代替传统野生链霉亲和素(sa)，具有更好的吸附力、高灵敏度和强稳定性。链霉亲和素是阿维丁链霉菌(streptomycesavidinii)表达的一种小分子蛋白，与生物素具有很高的亲和力。巯基化链霉亲和素含sa的127aa最佳核心结构，每分子gsa结合4个生物素分子，国际标准比活性12-15iu/mg。由于gsa不含糖基，而且等电点接近于中性，因此gsa在检测应用中具有更低的非特异性背景。
附图说明
图1为试纸条剖面结构示意图。
图2为试纸条俯视图。
图3为试纸条检测结果判定图。
图4为试纸条标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入本发明的保护范围。
实施例1：检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条的构成
所述试纸条是由支撑层6、样品垫1、硝酸纤维素膜2、吸水垫3组成(图1)，还包括配套试剂；
所述配套试剂为纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液，所述黄曲霉毒素b1适配体的核苷酸序列为：5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’，其3’端采用巯基修饰；
所述样品垫1、硝酸纤维素膜2、吸水垫3顺次固定在支撑层6上，样品垫1与硝酸纤维素膜2的叠压宽度为2mm；吸水垫3与硝酸纤维素膜2的叠压宽度为2mm；样品垫1的始端与支撑层6的始端对齐，吸水垫3的末端与支撑层6的末端对齐；
所述硝酸纤维素膜上有检测线4和质控线5，均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，两者间距5mm，检测线4位于靠近样品垫1的一侧，质控线5位于远离样品垫1的一侧，检测线4包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液，所述探针1的核苷酸序列为：5’-gtgggcctagcgaagggcacgagacacagagagacaacacgtgcccaac-3’，其3’端标记生物素；质控线5包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液，所述探针2的核苷酸序列为：5’-tttttttttttttttttt-3’，其3’端标记生物素；
所述支撑层6为pvc底板；所述样品垫1为吸油纸；所述吸水垫3为吸水纸。
上述检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条在2～8℃环境中保存，有效期12个月。
实施例2：实施例1中所述试纸条的制备
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液；
2)制备具有包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液的检测线和包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液的质控线的硝酸纤维素膜；
3)将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在支撑层上。
下面分步详细叙述：
(一)各部件的制备
1.黄曲霉毒素b1适配体、检测线处的探针1、质控线处的探针2的选择及合成
黄曲霉毒素b1适配体的核苷酸序列为：5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(sequenceidno.1)，该序列参考专利wo2011020198(dnaligandsforaflatoxinandzearalenone)，其3’端采用巯基修饰，以便于和纳米金结合，此过程由上海生工公司合成。
检测线处的探针1的核苷酸序列为：5’-gtgggcctagcgaagggcacgagacacagagagacaacacgtgcccaac-3’(sequenceidno.2)，该序列与黄曲霉毒素b1适配体的部分碱基序列互补配对，其3’端标记生物素，以便于和链霉亲和素结合，此过程由上海生工公司合成。
质控线处的探针2的核苷酸序列为：5’-tttttttttttttttttt-3’，该序列与黄曲霉毒素b1适配体的另一部分碱基序列互补配对，其3’端标记生物素，以便于和链霉亲和素结合。
2.黄曲霉毒素b1适配体与纳米金的自组装
(1)纳米金的制备
于250ml三口烧瓶中分别加入99ml过膜水和1ml1％氯金酸溶液，使其成为0.01％氯金酸溶液，用恒温电磁搅拌器加热，温度100℃，搅拌速率100r/min；保持温度和搅拌速率不变，待溶液沸腾后，调节转速为350r/min，快速准确地加入38.8mmol/l柠檬酸三钠溶液1ml。随着反应的深入，溶液颜色逐渐由灰变紫，再逐渐变成鲜亮的酒红色，待溶液颜色稳定为鲜亮的酒红色不变后，调节转速为300r/min，保持沸腾时间10min；停止加热，搅拌至冷却，转至洁净棕色试剂瓶中，4℃避光保存，制备出粒径在28nm左右的纳米金。
(2)适配体的标记前处理
取适配体干粉，开盖前先离心，12r/min、60s，因为oligodna呈很轻的干膜状附在管壁上，打开前离心可防止散失；离心后慢慢打开管盖，加入适量水，使适配体最终浓度为100μmol/l；振荡器上振荡10min使其充分溶解。
(3)适配体的活化
取若干2ml离心管，分别加入25μl的100μmol/l的适配体，再向其中加入1μl的10μmol/l的tcep溶液，将离心管置于振荡器上反应振荡，室温反应1h后，使用超滤膜(截留分子量3000)进行超滤，除去多余的tcep溶液，加入无酶水复溶至原体积。
(4)适配体与纳米金的自组装
取上述2ml离心管，加入500μl纳米金(浓度约为1nmol/l)，混匀；再加入2mol/l的柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠最终浓度为500mmol/l，并调节溶液的ph为3；之后加入2μl的100μmol/l的适配体，使得纳米金和适配体的比例为1:100，并调节最终溶液的ph为7；之后离心20min，除去未反应的适配体，最终沉淀加重悬液复溶至原体积，即为纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液。
重悬液为含质量百分数为0.25％牛血清白蛋白、2％蔗糖和0.5％吐温-20的10mmol/lpbs缓冲液。
3.样品垫的制备
将样品垫置于含质量百分数为1％牛血清白蛋白、2％蔗糖和0.5％吐温-20的10mmol/lpbs缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。
4.硝酸纤维素膜的制备
检测线包被：用10mmol/lph8的pbs缓冲液配制1mg/ml的链霉亲和素溶液；取30μl上述链霉亲和素溶液和50μl浓度为60μmol/l的生物素修饰的探针1搅拌混合，在常温下反应2h；利用胶体金点样系统为硝酸纤维素膜划线，37℃烘干。
质控线包被：用10mmol/lph8的pbs缓冲液配制1mg/ml的链霉亲和素溶液；取30μl上述链霉亲和素溶液和50μl浓度为60μmol/l的生物素修饰的探针2搅拌混合，在常温下反应2h；利用胶体金点样系统为硝酸纤维素膜划线，37℃烘干。
(二)各部件的组装
将所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在支撑层上，样品垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm；吸水垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm；样品垫的始端与支撑层的始端对齐，吸水垫的末端与支撑层的末端对齐。
实施例3：实施例1中所述试纸条的使用
1.试纸条检测
取5μl黄曲霉毒素b1标准品溶液和2.5μl纳米金标记的黄曲霉毒素b1适配体溶液混合，加入流动缓冲液至溶液体积为60μl，室温反应30min后，将其滴入到样品垫上，观察试纸条显色情况，并于17min时用免疫色谱读数仪(c10066-10)进行检测。
流动缓冲液为含质量百分数为1％牛血清白蛋白的10mmol/lpbs缓冲液。
2.检测结果分析
(1)定性判定
阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)显色明显弱于质控线(c)或不显色，判为阳性，如图3a、3b所示；
阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)显色强于质控线(c)或与质控线(c)显色无差异，判为阴性，如图3c、3d所示；
无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效，如图3e、3f所示。
(2)定量检测
用免疫色谱读数仪测定检测线的颜色强度，读取吸光度abs(1/1000abs)，记为b，将不含afb1的吸光度记为b0，计算b/b0值；制作黄曲霉毒素b1标准品的浓度对应b/b0的一元线性回归曲线，计算回归方程。
3.样品检测
将上述步骤1中的黄曲霉毒素b1标准品溶液替换为待测样品，用试纸条进行检测，记录吸光度b，根据步骤2的回归方程，得到待测样品中黄曲霉毒素b1的浓度。
实施例4：实施例1中所述试纸条检测黄曲霉毒素b1灵敏度、线性范围、特异性研究
1.灵敏度与线性范围研究
取1mg/ml的afb1标准储备液，用pbs溶液配制表1所示的不同浓度标准品溶液，范围从0到50μg/ml，分别用实施例1所述的试纸条进行检测。
结果显示，随着afb1浓度的增加，检测线处颜色强度逐渐变弱；利用标准品检测线处吸光度与不含标准品检测线处吸光度比值(表1)，绘制检测黄曲霉毒素b1的标准曲线如图4所示，结果表明，该试纸条检测黄曲霉毒素b1的线性范围为0.01～50μg/ml，而且检测的视觉灵敏度为0.01μg/ml，仪器检测的灵敏度可达到1.05ng/ml(按照国际法3σ准则计算)。
表1黄曲霉毒素b1标准品的检测结果
2.特异性研究
配制浓度为10μg/ml的黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、t-2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a溶液和空白样品(自来水)，分别用实施例1所述的试纸条进行检测。
结果显示，只有黄曲霉毒素b1检测线显色明显弱于质控线显色，为阳性，说明该试纸条对黄曲霉毒素b1具有高度特异性。
实施例5：实施例1中所述试纸条在检测自来水中黄曲霉毒素b1中的应用
1.标准曲线绘制
同实施例4中检测黄曲霉毒素b1灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为：y＝-9.5439x+70.63927，r2＝0.98831，为黄曲霉毒素b1标准曲线一元回归方程。
2.样品检测
将自来水过膜后添加黄曲霉毒素b1标准品，使其浓度分别为0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml，用实施例1所述的试纸条按实施例3的步骤进行检测，最终得到添加回收率为107.26％～116.59％，相对标准偏差为2.95％～4.73％，说明此方法可用于检测实际样品中的黄曲霉毒素b1。
序列表
<110>北京勤邦生物技术有限公司
北京化工大学
<120>一种检测黄曲霉毒素b1的核酸适配体试纸条及其制备方法和应用
<141>2018-01-18
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>70
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccacaaaaaaaaaaa60
aaaaaaaaaa70
<210>2
<211>49
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gtgggcctagcgaagggcacgagacacagagagacaacacgtgcccaac49