一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法与流程

本发明属于病原体检测领域，具体涉及一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法。

背景技术：

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,简称Cpn)是一种常见的人畜共患病原体，为专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，是1989年确立的衣原体新种。肺炎衣原体经呼吸道传播，全球至少有50％以上的人感染过肺炎衣原体，是呼吸道感染的常见病原体，如肺炎、支气管炎、鼻窦炎，近年来发现，肺炎衣原体或为动脉粥样硬化的病因之一。由于肺炎衣原体在临床症状无特异检测症状，需要进一步进行实验室检测确诊病因，而且其对外界环境敏感,是衣原体属中公认较难培养的一种衣原体。因此，肺炎衣原体检测方法的研究，一直受到国内外学者的关注。

目前临床上的肺炎衣原体样品，通常用拭子采集肺深部分泌液或咽部分泌物样品，以及采集一定量的血清。而临床检测肺炎衣原体的方法，主要有PCR法、酶联免疫法、免疫组化法、原位杂交法、胶体金免疫层析试纸及环介导等温扩增(LAMP)法。

对于肺深部分泌液或咽部分泌物样品，通常用PCR方法检测是否有肺炎衣原体的DNA或16SRNA，或用酶联免疫法检测感染人或动物的血清中的CP-IgM抗体或CP-IgG抗体或CP-IgA抗体，来判定是否有肺炎衣原体感染。对于细胞或组织样品，也可用免疫组化方法或原位杂交方法来鉴定是否有肺炎衣原体感染。这些方法都是传统的生物检测DNA或抗原的方法，需要将样品取回实验室进行处理检测，对环境要求严格，耗时长。也有报道用免疫层析试纸条可快速检测血清中的肺炎衣原体的IgM抗体。但这个方法有一个很大的缺点：灵敏度低，信噪比低，不准确。环介导等温扩增(LAMP)法来快速检测肺炎衣原体，此方法需要先PCR扩增样品中肺炎衣原体的保守DNA片段，然后用扩增的DNA溶液与基因芯片杂交，观察芯片上是否有杂交信号。这种方法准确、比较快速(约3.5小时)，但需要PCR仪器、点样仪、基因芯片及荧光扫描设备，还需要荧光探针，价格比较贵，不适宜在养殖现场大规模筛查。用LAMP法直接加荧光染料可在60分钟内检测肺炎衣原体。这种方法操作简单、灵敏、快速，不需要昂贵的仪器。但LAMP方法有个严重的缺点：一旦开盖容易形成气溶胶污染，假阳性问题比较严重。因此需要采用实时浑浊仪，另外，LAMP方法对引物设计要求比较高，有些疾病的基因不适合LAMP方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于建立一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法，该方法能够对环境中的肺炎衣原体进行快速诊断和检测，缩短检测周期，简化检测过程，提高检测手段的普遍适用性，利于实地现场检测，从而快速、准确、敏感、简便地检测肺炎衣原体的存在，及时防控，意义重大。

本发明首先将抗体和金纳米颗粒进行偶联，构建具有特异性捕获肺炎衣原体的金探针。此探针利用抗原抗体的特异性反应，可紧密结合肺炎衣原体，该复合物经高速离心，从而达到分离肺炎衣原体的作用，在暗场显微镜下可形成清晰为肉眼所见的金黄色衣壳状结构。

本发明采用的技术方案如下：

一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法，该方法是将商品化肺炎衣原体抗体和商品化包被有蛋白A的金纳米颗粒进行亲和偶联获得金探针，然后以此探针对环境中肺炎衣原体进行捕获，然后在暗场显微镜下观察结果。

本发明中，所述金纳米颗粒大小为15nm。

本发明具体的步骤如下：

(1)金纳米颗粒的清洗：将包被有蛋白A的金纳米颗粒进行清洗，获得分散性较均一的纳米级金纳米颗粒；

(2)抗体的偶联：将肺炎衣原体抗体和步骤(1)中清洗后的金纳米颗粒混合，亲和偶联后获得具有特异性捕获肺炎衣原体的金探针；

(3)将步骤(2)中金探针与待测样本孵育一段时间，得混合液；

(4)离心分离上述混合液，用PBS重悬混合物后，滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

优选地，所述方法，步骤如下：

(1)金纳米颗粒的清洗：将包被有蛋白A的金纳米颗粒与含有BSA的PBS溶液进行混合，离心分离后静置，弃上清，重悬于含有BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的金纳米颗粒；

(2)抗体的偶联：将商品化肺炎衣原体抗体和步骤(1)中清洗后的金纳米颗粒按照个数比为1:100-1:200混合，常温孵育1-6h；然后离心分离洗涤未结合抗体，最后用含BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获肺炎衣原体的金探针；

(3)用步骤(2)构建好的金探针对待测样品中的肺炎衣原体进行捕获，所述金探针添加量为每200μL样本溶液加入50-100μL金探针；

(4)取步骤(3)中的混合液滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

本发明中，步骤(1)所述金纳米颗粒是直径为纳米级的金颗粒。

步骤(1)所述金纳米颗粒清洗所用的BSA的浓度为1％，每次清洗的时间为5min，清洗次数为3次。

步骤(2)所述抗体和金纳米颗粒偶联时间为30-60min。

步骤(3)所述样品，为人呼吸道分泌物。

步骤(3)所述金探针捕获肺炎衣原体的时间为30-60min。

更优选地，所述方法，具体步骤如下：

(1)金纳米颗粒的清洗：将商品化包被有蛋白A的金纳米颗粒与含1％BSA的PBS溶液进行混合，离心分离后，弃上清，重悬于含1％BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的金纳米颗粒；

(2)抗体的偶联：将商品化鼠抗肺炎衣原体抗体和步骤(1)中清洗后的金纳米颗粒按照质量比为1:160混合，进行亲和偶联，混合溶液在Mixer中室温下旋转振荡孵育1-6h，离心分离后，弃上清，然后用含1％BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异性捕获肺炎衣原体能力的金探针；

(3)利用步骤(2)中偶联了肺炎衣原体抗体的金探针对样品中的肺炎衣原体进行捕获，所述金探针添加量为每200μL捕获体系中添加50-100μL金探针，混合溶液在Mixer中室温下旋转振荡孵育30-60min，离心分离后，弃上清，然后用含1％BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中；

(4)取步骤(3)中的10μL混合液滴加到载玻片上，暗场显微镜下观察。

本发明中，探针类型和大小的选择对观察效果有重要影响。例如：透射电镜下观察肺炎衣原体与50nm磁探针结合(图6)，效果不理想。研究过程中，推测采用金纳米颗粒时，30nm的效果会优于15nm，因为暗场下，金颗粒比较大的话形成的包围结构会更亮一些，利于暗场显微镜下观察；但是透射电镜下观察肺炎衣原体与30nm金探针结合的效果却如图7，产生了一定程度聚团现象，反而不如15nm好。

本发明提供的基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法，核心技术为金探针构建及暗场显微镜显示。利用金探针检测肺炎衣原体，不需要特殊的实验仪器，只需要廉价的暗场显微镜就可完成实验；在检测过程中，只需要包被有肺炎衣原体的特异性抗体，利用抗原抗体间特异性结合就能完成实验，室温下就可以操作，不要特殊的实验条件；在短时间内就可完成检测，且具有较高的灵敏度，适用于实地现场作业。

附图说明

图1免疫金纳米颗粒检测肺炎衣原体原理示意图；

图2验证金纳米颗粒与鼠抗肺炎衣原体多克隆抗体结合的SDS-PAGE图；其中M为预染蛋白标记，1为25uL金纳米颗粒和8ug抗体结合后的上样量；2为2ug肺炎衣原体抗体上样量；3为2uL15nm金纳米颗粒；

图3(A)肺炎衣原体的透射电镜图；

图3(B)金探针与肺炎衣原体结合的透射电镜图；

图4金探针与肺炎衣原体结合的暗场显微镜图。

图5金探针与肺炎衣原体结合效率的PCR结果核酸电泳图；其中，M为100bp的标记，1为PCR中样品为ddH2O的空白对照组，2为PCR中样品为肺炎衣原体培养物的阳性组，3为PCR中样品为肺炎衣原体经金探针结合分离组，4为PCR中样品为肺炎衣原体经金探针结合分离后的上清组，5为PCR中样品为磁珠的对照组。

图6是透射电镜下观察肺炎衣原体与50nm磁探针结合。

图7是透射电镜下观察肺炎衣原体与30nm金探针结合。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做更进一步地解释，但本发明不受实施例的限制。

对肺炎衣原体的检测，包括如下步骤：

一、材料

包被有蛋白A的金纳米颗粒购自美国Creative Diagnostics公司；兔抗肺炎衣原体多克隆抗体购自美国Fitzgerald公司；肺炎衣原体为实验室保存菌种，血清型为CWL029；离心机购自德国Eppendorf公司；Hula Mixer购自挪威life technology公司；超声仪购自中国昆山市超声仪器有限公司。

二、实验方法

实验具体流程如附图1所示，具体步骤如下：

1.金纳米颗粒的清洗

将50μL商品化包被有蛋白A的直径为15nm金纳米颗粒加入500μL含1％BSA的PBS的1.5mL离心管中，超声振荡5min，混匀，放入离心机，14000rpm离心10min，弃去上清；再向离心管中加入500μL含1％BSA的PBS，重复操作三次；再次加入100μL含1％BSA的PBS，超声振荡，充分混匀，待用；

2.抗体的偶联

将15μL商品化鼠抗肺炎衣原体抗体和步骤1中清洗后的100μL金纳米颗粒混合，进行亲和偶联，超声振荡混匀后，在Mixer中室温下旋转振荡孵育2h；结合反应完成后，放入离心机中，14000rpm离心10min，弃去上清，然后用含1％BSA的PBS溶液洗涤，重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获能力的金探针；

3.抗体偶联效率的测定

取与包被蛋白A的金纳米颗粒偶联前后的抗体溶液，SDS-PAGE法检测金纳米颗粒与抗体偶联效率：置于95℃左右的沸水中变性5min，离心10s，120V SDS-PAGE电泳，结果如附图2所示，金纳米颗粒能较高效率捕获肺炎衣原体抗体。

4.金探针对肺炎衣原体的捕获

取100μL鼠抗肺炎衣原体抗体包被的金探针与100μL待测样品在Mixer中室温下旋转振荡孵育60min；结合反应完成后，放入离心机中，14000rpm离心10min，吸取上清液到1.5mL的离心管中用于结合效率的检测，加入500μL的PBS洗涤探针，重复操作三次，加入50μL PBS重悬金探针。

5.结果观察

在普通明场显微镜下观察肺炎衣原体，由于其大小仅有380nm左右，难以看到，需到透射电镜下观察，如同附图3中所示。

将步骤4中的混合液10μL，滴加到载玻片上，如附图4所示，在暗场显微镜下，可清晰看到肺炎衣原体周围或者部分区域呈现出金黄色光亮。

6.结合效率检测

将步骤(4)中的收集的上清液、洗涤重悬后金纳米颗粒和肺炎衣原体混合液以及肺炎衣原体培养物进行PCR鉴定，检测金探针的结合效率。根据肺炎衣原体全基因序列(GenBank accession no.:AE001363)，利用Primier 5.0软件设计该基因的特异性引物，上游引物(F)：5′-GGGGTTGTAGGGTCGATAACATGGGATC-3′(SEQ ID No.1)；下游引物(R)：5′-CTTGGAGAGTGGTCTCCCCAGATTCA-3′(SEQ ID No.2)，扩增产物的长度为172bp。PCR反应体系具体如下：

配制总体积为50μL的PCR反应体系

PCR反应程序：95℃5min，95℃5s，55℃20s，72℃30s，72℃10min，共计30个循环，13℃50min。

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳参数为电压80V，时间为40min。

结果显示(如图5)，金探针结合肺炎衣原体效率较高，经金探针分离后的上清中未检测到衣原体。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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