本发明是关于一种检测套组的制备方法及一种加速有机分子附着至载体的方法，尤指一种使用同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量的检测套组的制备方法及加速有机分子附着至载体的方法。
背景技术：
目前市面上有各种感测方法，常见的感测方法例如酵素连结免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，其为一种被广泛应用的感测方法，已有多年的历史，其至少包括待测样品为抗原或抗体两种方式，分别论述如下：
当待测样品为抗原时，酵素连结免疫吸附法包括如下的操作步骤：将具有专一性的抗体固着(coating)于塑料孔盘上，固着时间约需12-18小时，固着完成后洗去多余抗体；加入待测物和固着的抗体进行反应，反应时间约需0.5-2小时，待测物中若含有和固着的抗体具有反应性的抗原，则其会与固着于塑料孔盘上的抗体进行专一性键结；洗去多余待测物，加入带有酵素且和该抗原具有反应性的抗体与该抗原键结，键结时间约需0.5-1小时；洗去多余未键结的带有酵素的抗体，加入酵素受质使酵素呈色，呈色时间约需0.5小时，以光谱仪读取呈色结果(即吸光值(od值))，实验完成总共约需1-2天。
当待测样品为抗体时，酵素连结免疫吸附法包括如下的操作步骤：将已知的抗原固着(coating)于塑料孔盘上，固着时间约需12-18小时，完成后洗去多余的抗原；加入待测物和固着的抗体进行反应，反应时间约需0.5-2小时，检体中若含有和固着的抗体具有反应性的一次抗体，则其会与固着于塑料孔盘上的抗原进行专一性键结；洗去多余待测物，加入带有酵素的二次抗体，与待测的一次抗体键结，键结时间约需0.5-2小时；洗去多余未键结的二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，呈色时间约需0.5小时，以光谱仪读取呈色结果(即吸光值(od值))，实验完成总共约需1-2天。
酵素连结免疫吸附法虽然用途广泛，但操作费时，尤其是固着时间长达12-18小时，为了提升效率，改进现有的酵素连结免疫吸附法，为本领域技术人士的重要课题。
技术实现要素：
本发明的第一方面提供一种检测套组的制备方法，包括：提供载体，所述载体包含基材；以硅烷(silane)固着于所述基材的表面；提供有机分子；将所述有机分子加至所述载体上；以同轴电缆输出微波能量；以及透过辐射器均匀发射所述微波能量来微波所述载体及所述有机分子，以将所述有机分子固着于含有所述硅烷的所述载体上。
本发明的第二方面提供一种加速有机分子附着至载体的方法，包括：提供所述载体，所述载体包含基材；以硅烷(silane)固着于所述基材的表面；将所述有机分子加至所述载体上；以及在所述载体上，以特定功率提升含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子的碰撞机率，从而加速所述有机分子附着至含有所述硅烷的所述载体。
附图说明
图1显示以corning的cor-9018孔盘固着(coating)转化生长因子beta1(tgf-beta1)隔夜(overnight)与以微波炉微波固着的比较。
图2显示以corning的cor-9018孔盘固着tgf-betal隔夜与以微波治疗仪固着tgf-beta1的比较。
图3a及图3b显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波炉微波固着il-15的比较。
图4a及图4b显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波炉微波固着tgf-beta1的比较。
图5显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体固着tgf-beta1隔夜与以微波治疗仪固着tgf-beta1的比较。
图6a及图6b显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体使用微波治疗仪与市售微波炉进行微波固着tgf-beta1的比较。
图7显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪固着tgf-beta1的比较。
图8a及图8b显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪固着干扰素-gamma(interferon-gamma，ifn-gamma)的比较。
图9a及图9b显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪固着gm-csf的比较。
图10a及图10b显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪固着il-12的比较。
图11显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪不同时间固着肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)的比较。
图12显示本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪固着tgf-beta1的比较。
图13显示本发明的具金纳米粒子的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪tgf-beta1的比较。
具体实施方式
有关本发明的技术内容、特点及功效，由以下优选实施方式的详细说明将可清楚的呈现。
本发明第一实施方式提供一种检测套组的制备方法，该方法包括：提供包含基材的载体；以硅烷(silane)固着于该基材的表面；再提供有机分子；并将所述有机分子加至所述载体上；以同轴电缆输出微波能量；以及透过辐射器均匀发射所述微波能量来微波所述载体及所述有机分子，以将所述有机分子固着于含有所述硅烷的所述载体上。
本实施方式的载体可为基片、孔条(strip)或孔盘，但不限于此。所述基片可为微阵列基片(microarray)或实验室基片(lab-on-a-chip)。所述微阵列基片可为蛋白质基片或基因基片；所述微阵列基片可为微流道基片，但不限于此。所述硅烷可为烷基硅烷、胺基硅烷或其他硅烷，胺基硅烷举例来说可为3-胺基丙基三甲氧基硅烷(aminopropryltrimethoxysilane，aptms)或3-胺基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，apts)。本实施方式可采用任何能以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量的手段或仪器，例如可使用微波治疗仪，但不限于此。本实施方式可以低于200w的强度对含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子进行微波，微波条件更优选为60w，30-40分钟，最优选为60w，30分钟。
本实施方式的载体可承载多个相间隔的金属纳米粒子，所述金属纳米粒子可为金纳米粒子。本实施方式的载体的基材可以玻璃或塑料所制成，所述玻璃可为光学玻璃。
本实施方式的制备方法，其中所述检测套组被应用于检测方法，所述检测方法可为三明治酵素连结免疫吸附法、间接酵素连结免疫吸附法或竞争酵素连结免疫吸附法。所述有机分子可为抗体或抗原。
本发明第二实施方式提供种加速有机分子附着至载体的方法，所述方法包括：提供包含基材的所述载体；再以硅烷(silane)固着于所述基材的表面；并将所述有机分子加至所述载体上；以及在所述载体上，以特定功率提升含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子的碰撞机率，从而加速所述有机分子附着至含有所述硅烷的所述载体。
本实施方式的加速有机分子附着至载体的方法，其中所述特定功率是在以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量来微波含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子时所提供的。所述特定功率具有固定值，所述固定值意指所述特定功率保持恒定，不随电压或电流的改变而改变。
本实施方式的载体可为基片、孔条或孔盘，但不限于此。所述基片可为微阵列基片(microarray)或实验室基片(lab-on-a-chip)。所述微阵列基片可为蛋白质基片或基因基片；所述微阵列基片可为微流道基片，但不限于此。所述硅烷可为烷基硅烷、胺基硅烷或其他硅烷，胺基硅烷举例来说可为3-胺基丙基三甲氧基硅烷(aminopropryltrimethoxysilane，aptms)或3-胺基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，apts)。本实施方式可采用任何能以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量的手段或仪器，例如可使用微波治疗仪，但不限于此。本实施方式可以低于200w的强度对含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子进行微波，微波条件更优选为60w，30-40分钟，最优选为60w，30分钟。
本实施方式的载体可承载多个相间隔的金属纳米粒子，所述金属纳米粒子可为金纳米粒子。本实施方式的载体的基材可以玻璃或塑料所制成，所述玻璃可为光学玻璃。
本实施方式的制备方法，其中所述检测套组被应用于检测方法，所述检测方法可为三明治酵素连结免疫吸附法、间接酵素连结免疫吸附法或竞争酵素连结免疫吸附法。所述有机分子可为抗体或抗原。
传统的酵素连结免疫吸附法中，将蛋白质(抗体或抗原)固着至塑料孔盘上主要是靠静置，利用静电吸附的方式，使蛋白质固着于塑料孔盘表面，一般固着的时间需要12-18小时，时间太过冗长，因此本发明提出以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量的固着技术，来解决传统的酵素连结免疫吸附法固着时间过长的缺点。
本发明的原理为透过低功率同轴电缆方式输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量(＜200w)来处理载体内的固着缓冲液(coatingbuffer)(内含蛋白质如抗体或抗原)，使得固着缓冲液中的水分子以每秒钟2.45亿次的频率进行振荡，因而导致固着缓冲液中的蛋白分子间互相碰撞的频率增加，进而提升蛋白分子与载体表面的碰撞机率，使得蛋白分子可以在短时间内吸附于载体表面，且侦测灵敏度并没有因此下降。此外，微波处理后，本发明的载体及其内的固着缓冲液整体温度仅上升3-4度左右，可避免蛋白分子因高温而变性。
另一方面，一般市售微波炉使用磁控管产生微波，再以导波管输出微波打入共振腔体，透过腔体共振方式进行微波加热，此种微波能量输出方式容易随着外部电源波动，进而直接影响共振腔内微波能量的强度，因此无法获得稳定的微波功率。此外，微波炉在运作时，微波在腔体内会形成驻波，因此需要转盘不断转动，使能量能够均匀分配，然而仅靠转盘转动仍然难以使能量真正分配均匀。在载体受到微波能量强度不均的情形下，利用微波炉微波固着仅能进行短暂的时间，例如本发明所使用的20秒，以避免受到微波能量强度较多的地方的蛋白质变性，例如抗体失去活性。但微波时间过短又会使受到微波能量强度较少的地方固着效果较差而od值较低。故利用微波炉微波来固着蛋白分子，会导致实验数据不稳定，od值比较没有重复性。
因此，本发明所使用的微波固着，此微波来源以同轴电缆输出微波能量的方式，将微波馈入长方形输出板(辐射探头)，长方形输出板(辐射探头)刚好与96孔孔盘尺寸吻合，微波时两者完全贴合，因此能均匀微波孔盘每个角落。此外，输出稳定的微波功率是以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射该微波能量的优势，可透过设计pid(proportional-integral-derivativecontrol)负反馈技术以有效保证输出微波功率不随着外部电源的波动而波动。因此，使用同轴电缆方式输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量进行固着可以获得稳定的实验数据。
因此，本发明的使用同轴电缆方式输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量的检测套组的制备方法及加速有机分子附着至载体的方法使得酵素连结免疫吸附法所需时间大幅减少，且不影响侦测灵敏度，并可获得稳定的实验数据。
本发明的实施例中酵素连结免疫吸附法以下列步骤进行：
溶液：
清洗液(washbuffer)-0.05％tween20溶于磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)
5x稀释液(diluent)-1％牛血清白蛋白(bsa)溶于pbs
受质液(substratesolution)-1xtmb
终止液(stopsolution)-2nh2so4
10x固着缓冲液(coatingbuffer)
材料：
捕获抗体(captureantibody)：将10x固着缓冲液以二次水配成1x固着缓冲液，再将捕获抗体以1x固着缓冲液稀释250倍，成为1x捕获抗体。
标准品(standard)：将目标蛋白标准品以1x稀释液配制为最高浓度，再进行序列稀释。
检测抗体(detectionantibody)：将检测抗体以1x稀释液稀释250倍，成为1x检测抗体。
卵白素-辣根过氧化物酶(avidin-hrp)：将avidin-hrp以1x稀释液稀释250倍，成为1xavidin-hrp。
步骤1.用1x固着缓冲液(coatingbuffer)稀释捕获抗体(captureantibody)，并加100μl稀释后的捕获抗体到每个分析盘的孔(well)中，将盘子密封后置于4℃隔夜(o/n)。
流程：
步骤1.
a.市售微波炉固着：将捕获抗体以1x固着缓冲液稀释250倍，进行固着步骤，加100μ1/孔(well)至表面具有/不具金纳米粒子及硅烷的玻璃/塑料孔条或孔盘中，以80w微波20秒后封盘，室温静置十分钟(取代传统孔盘需4℃放置隔夜)。
b.以同轴电缆方式输出微波能量并透过辐射器均匀发射微波能量固着：将捕获抗体以1x固着缓冲液稀释250倍，进行固着步骤，加100μl/孔至表面具有金纳米粒子的孔条或孔盘中，以60w微波30分钟(取代传统孔盘需4℃放置隔夜)。
步骤2.以超过250μ1/孔清洗液清洗孔盘四次，每次清洗完皆浸泡1分钟，并倒扣于擦手纸上去除残余液体。
步骤3.加入100μl/孔的1x稀释液，并置于室温1小时。
步骤4.以超过250μl/孔清洗液清洗孔盘四次，每次清洗完皆浸泡1分钟，并倒扣于擦手纸上去除残余液体。
步骤5.以1x稀释液序列稀释标准品并加入100μl/孔至孔盘，室温静置2小时。
步骤6.以超过250μl/孔清洗液清洗孔盘四次，每次清洗完皆浸泡1分钟，并倒扣于擦手纸上去除残余液体。
步骤7.以1x稀释液稀释检测抗体，加100μl/孔，室温静置1小时。
步骤8.以超过250μl/孔清洗液清洗孔盘六次，每次清洗完皆浸泡1分钟，并倒扣于擦手纸上去除残余液体。
步骤9.以1x稀释液稀释avidin-hrp，加100μl/孔，避光且室温静置30分钟。
步骤10.以超过250μl/孔清洗液清洗孔盘六次，每次清洗完皆浸泡1分钟，并倒扣于擦手纸上去除残余液体。
步骤11.加100μl/孔tmb受质，避光呈色15分钟。
步骤12.加50μl/孔2nh2so4终止反应。
步骤13.利用elasa分析仪，于450nm波长测结果，以630nm校正结果。
实施例
1.以corning的cor-9018孔盘固着(coating)转化生长因子beta1(transforminggrowthfactor-beta1，tgf-beta1)隔夜(overnight)与以微波炉微波固着的比较：
请参阅图1及表1，在市售塑料孔盘的corning的cor-9018孔盘使用市售微波炉以功率10％(约80w)微波20秒固着tgf-beta1，结果不只灵敏度降低且od值也降低，以微波炉微波固着未能提升cor-9018孔盘固着tgf-beta1的效力。
表1
2.以corning的cor-9018孔盘固着tgf-beta1隔夜与以微波治疗仪固着tgf-beta1的比较：
请参阅图2及表2，在市售塑料孔盘的corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪固着tgf-betal，结果不只是灵敏度降低且od值也降低，以微波治疗仪固着未能提升cor-9018孔盘固着tgf-beta1的效力。
表2
3.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波炉微波固着il-15的比较：
请参阅图3a、图3b及表3，使用市售微波炉以功率10％(约80w)分别微波本发明的载体与corning的cor-9018孔盘20秒以固着il-15，本发明的载体在利用微波固着后，il-15灵敏度为0.25pg/ml，而cor-9018孔盘灵敏度为2.5pg/ml，微波固着后本发明的载体的灵敏度超越传统孔盘10倍以上。
表3
4.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波炉微波固着tgf-beta1的比较：
请参阅图4a、图4b及表4，使用市售微波炉以功率10％(约80w)分别微波本发明的载体与corning的cor-9018孔盘20秒以固着tgf-beta1，本发明的载体在利用市售微波炉微波固着后，tgf-beta1的灵敏度最优选可达0.001pg/ml，而cor-9018孔盘在利用市售微波炉微波固着后，灵敏度为10-1pg/ml，利用市售微波炉微波固着后本发明的载体的灵敏度超越传统孔盘超过10倍以上，但由于微波炉输出功率不稳，造成od值的一致性不佳。
表4
5.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体固着tgf-beta1隔夜与以微波治疗仪微波固着tgf-beta1的比较：
请参阅图5及表5，本发明的载体固着tgf-beta1隔夜，和以微波治疗仪微波固着tgf-beta1，所得od值差不多，灵敏度也同样可达到1pg/ml。
表5
6.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体使用微波治疗仪进行微波固着与市售微波炉进行微波固着tgf-beta1的比较：
请参阅图6a、图6b及表6，利用微波治疗仪以及市售微波炉进行微波固着实验，市售微波炉的微波条件为功率10％，20秒。微波治疗仪的微波条件为60w，30分钟。结果市售微波炉的微波固着数据，因微波炉是以磁控管产生微波，再透过导波管方式输入共振腔体，此种微波能量输出方式造成微波能量不稳，而使得od值较没有重复性，实验结果不稳定；使用微波治疗仪，也就是以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射微波能量的方式输出功率稳定，且可对载体提供均匀的微波，不因样品在载体上的位置而受影响，所得od值稳定。
表6
7.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪微波固着tgf-beta1的比较：
请参阅图7及表7，使用微波治疗仪并以60w分别微波本发明的载体与corning的cor-9018孔盘30分钟以固着tgf-beta1，本发明的载体在利用微波治疗仪固着后，tgf-beta1灵敏度最优选可达0.1-0.01pg/ml，而cor-9018孔盘在利用微波治疗仪微波固着后，灵敏度为10-1pg/ml，利用微波治疗仪微波固着后本发明的载体的灵敏度超越传统孔盘10倍以上，且od值的一致性良好。
表7
8.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪微波固着干扰素-gamma(interferon-gamma，ifn-gamma)的比较：
请参阅图8a、图8b及表8，本发明的载体在利用微波治疗仪微波固着后，ifn-gamma灵敏度最优选可达0.05pg/ml，而市售塑料孔盘的corning的cor-9018孔盘在利用微波治疗仪微波固着后，ifn-gamma灵敏度为50-5pg/ml，本发明的载体的灵敏度超越corning的cor-9018孔盘100倍以上。
表8
9.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪微波固着gm-csf的比较：
请参阅图9a、图9b及表9，本发明的载体在利用微波治疗仪微波固着后，gm-csf灵敏度最优选可达0.0075pg/ml，而市售塑料孔盘的corning的cor-9018孔盘在利用微波治疗仪微波固着后，灵敏度为0.075pg/ml，本发明的载体的灵敏度超越corning的cor-9018孔盘10倍以上。
表9
10.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与corning的cor-9018孔盘以微波治疗仪微波固着il-12的比较：
请参阅图10a、图10b及表10，本发明的载体在利用微波治疗仪微波固着后，il-12灵敏度最优选可达0.005pg/ml，而市售塑料孔盘的corning的cor-9018孔盘在利用微波治疗仪微波固着后，灵敏度为0.5pg/ml，本发明的载体的灵敏度超越corning的cor-9018孔盘100倍以上。
表10
11.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪微波不同时间固着肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)的比较：
请参阅图11及表11，以微波治疗仪微波不同时间，分别为10、15、20、25、30、35、40分钟，依结果显示微波30分钟可以将线性拉到最大，达到较好的侦测曲线，拉开浓度侦测范围，得到最好的结果。
表11
12.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪微波固着tgf-beta1的比较：
请参阅图12及表12，具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪微波固着十倍稀释的tgf-beta1标准品后相比，具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体的整体od值较高，但扣除背景值后，具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体两者差距不大。透过微波治疗仪微波固着后，两者皆可达到很好的灵敏度。
表12
13.本发明的具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪微波固着tgf-beta1的比较：
请参阅图13及表13，具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体以微波治疗仪微波固着五倍稀释的tgf-beta1标准品后相比，具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体的整体od值较高，但扣除背景值后，具金纳米粒子及硅烷的玻璃基材载体与具硅烷的玻璃基材载体两者差距不大。透过微波治疗仪微波固着后，两者皆可达到很好的灵敏度。
表13
实施方案
1.一种检测套组的制备方法，包括：提供载体，所述载体包含基材；以硅烷(silane)固着于所述基材的表面；提供有机分子；将所述有机分子加至所述载体上；以同轴电缆输出微波能量；以及透过辐射器均匀发射所述微波能量来微波所述载体及所述有机分子，以将所述有机分子固着于含有所述硅烷的所述载体上。
2.如实施方案1所述的制备方法，其中微波的条件为60w，30-40分钟。
3.如实施方案1-2所述的制备方法，其中微波的条件为60w，30分钟。
4.如实施方案1-3所述的制备方法，其中所述载体承载多个相间隔的金属纳米粒子。
5.如实施方案1-4所述的制备方法，其中所述载体为蛋白质基片、基因基片、或微流道基片。
6.如实施方案1-5所述的制备方法，其中所述基材以玻璃或塑料所制成。
7.如实施方案1-6所述的制备方法，其中所述检测套组被应用于检测方法，所述检测方法为三明治酵素连结免疫吸附法、间接酵素连结免疫吸附法或竞争酵素连结免疫吸附法。
8.一种加速有机分子附着至载体的方法，包括：提供所述载体，所述载体包含基材；以硅烷(silane)固着于所述基材的表面；将所述有机分子加至所述载体上；以及在所述载体上，以特定功率提升含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子的碰撞机率，从而加速所述有机分子附着至含有所述硅烷的所述载体。
9.如实施方案8所述的方法，其中所述特定功率是在以同轴电缆输出微波能量并透过辐射器均匀发射所述微波能量来微波含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子时所提供的。
10.如实施方案8-9所述的方法，其中所述特定功率具有固定值。
11.如实施方案8-10所述的方法，其中所述有机分子为抗体或抗原。
12.如实施方案8-11所述的方法，其以低于200w的强度对含有所述硅烷的载体及有机分子进行微波。
13.如实施方案8-12所述的方法，其以60w的强度对含有所述硅烷的所述载体及所述有机分子微波30-40分钟。
14.如实施方案8-13所述的方法，其中所述载体承载多个相间隔的金属纳米粒子。
15.如实施方案8-14所述的制备方法，其中所述载体为蛋白质基片、基因基片、或微流道基片。
16.如实施方案8-15所述的制备方法，其中所述基材以玻璃或塑料所制成。