本发明属于生物传感器
技术领域：
，具体涉及一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用，可以实现对mirna-21的灵敏性检测。
背景技术：
：micrornas(mirnas)是一类小分子非编码核糖核酸(rna)被发现在真核细胞中约有19－25核苷酸，它在真核生物中发挥关键作用。他们充当转录后基因表达调控者。越来越多的证据表明，mirnas的异常表达与许多疾病有关，包括恶性肿瘤、癌症和神经退化。mirnas的表达可作为癌症和其他疾病的诊断和治疗的生物标记。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，mirnas作为基因表遗传学的重要机制之一，受到越来越多的关注。对于mirnas的检测，已经有很多传统的检测方法被用于检测mirnas，其中包括northern杂交、real-timepcr、基因芯片等。然而，这些方法具有一些固有的局限性。northern杂交操作复杂且需要放射性标记，不仅会造成严重的污染，而且灵敏度低。real-timepcr和基因芯片技术虽然灵敏度高，但是所需要的仪器和试剂昂贵，因此限制了方法的广泛使用。尤其是基因芯片技术，几乎很少有使用者能负担得起。为了克服这些传统方法固有的缺点，一些低成本、高灵敏度的检测方法被发展起来是势在必行的。提供一个简单的、低检测限的和有选择性的方法来检测mirnas十分必要。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器及其制备方法，使用dna双链为模板，利用硼氢化钠对硝酸银的还原作用合成银纳米簇，并且利用dna与mirna序列序列之间碱基的互补配对作用，构建了一个催化发夹自组装放大系统。通过加入目标物mirna，与目标物mirna部分碱基互补配对的发夹dnahp1被打开和目标物结合,形成目标物与发夹dnah1的杂交链，在加入与发夹dnahp1碱基互补配对更多的发夹dnahp2以后，目标物mirna逐渐被剥夺下来，参与下一次循环。因此mirna的加入可引发这个催化发夹自组装放大系统，利用以dna为模板形成的银纳米簇的电致化学发光信号检测目标物。本发明还提供了一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测mirnas的应用。本发明具体技术方案如下：本发明提供的一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)、将2.5od的dnas1、dnahp1、dnahp2和mirna-21序列分别溶解在缓冲溶液中，得到dnas1缓冲溶液、dnahp1缓冲溶液、dnahp2缓冲溶液和mirna-21缓冲溶液；(2)、将抛光处理后的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，进行电沉积，取出，清洗，得到修饰了金纳米粒子的玻碳电极；(3)、将步骤(2)得到的修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入到dnas1的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了单链dnas1的玻碳电极；(4)、将步骤(3)得到的修饰了单链dnas1的玻碳电极浸入6-巯基-1-己醇溶液中，培养，清洗；(5)、将mirna-21缓冲溶液和dnahp1、dnahp2缓冲溶液混合，杂交，制备成dnahp1-hp2溶液；(6)将步骤(4)中得到的修饰了6-巯基-1-己醇/dnas1玻碳电极浸入步骤(5)中得到的dnahp1-hp2溶液，培养，然后取出，清洗，得到修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极；(7)将步骤(6)得到的修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极浸入硝酸银溶液中，培养，再将电极浸入硼氢化钠溶液中，培养，然后取出，清洗，即得。具体的，步骤(1)为将购买的分别为2.5od的dnas1、dnahp1和dnahp2序列分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中分别得到浓度为100μm的dnas1缓冲溶液、浓度为100μmdnahp1缓冲溶液和浓度为100μmdnahp2缓冲溶液；2.5od的mirna-21用depc水配置成20μm的缓冲溶液，在4℃下保存备用；制得的上述溶液根据使用需要进行稀释。进一步的，步骤(1)中dnas1序列为：5'-sh-ggttgctatatcg-3’；dnahp1序列为：5'-cccccccccccctcaacatcagtctgataagctaccgtcttgagctagcttatcagactgcgatatagcaacc-3；dnahp2序列为：5'-taagctagctcaagacggtagcttatcagactgccgtcttgagccccccccccccc；mirna-21序列为：5'-uagcuuaucagacugauguuga-3’。进一步的，步骤(1)中磷酸盐缓冲溶液的ph为7.4,浓度为0.1m。具体的，步骤(2)为：将抛光处理后的玻碳电极浸入2ml质量分数为0.1％的氯金酸溶液中，进行电沉积，电沉积电位是-0.2v，电沉积时间是100秒。获得的金纳米粒子具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的金纳米颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。进一步的，步骤(2)中，所述抛光处理后的玻碳电极具体处理方法为：玻碳电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比hno3:h2o＝1:1的溶液、乙醇溶液和超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。进一步的，步骤(3)具体为：将修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入5μm的dnas1的缓冲溶液中培养10-12h后取出，用磷酸盐缓冲溶液清洗。以此清除没有吸附的探针dnas1。进一步的，步骤(4)中所述培养，具体是：在37℃-40℃下培养1-1.5h。6-巯基-1-己醇用于封闭电极表面活性位点，避免非特异吸附。进一步的，步骤(5)具体是：将40μl5μm的dnahp1缓冲溶液、40μl5μm的dnahp2缓冲溶液和mirna-21缓冲溶液混合，在37℃杂交2h得到dnahp1-hp2溶液；进一步的，步骤(6)中所述培养，具体是：在37℃下培养1.5-2h。进一步的，步骤(7)具体是：将修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极浸入120μl30μm硝酸银溶液中，在4℃下避光培养0.5-1h，再浸入120μl30μm硼氢化钠溶液中，4℃下避光培养2-2.5h，利用硼氢化钠的还原性合成以dna为模板的银纳米簇，然后取出，清洗，即得。本发明提供的一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器，采用上述方法制备得到。本发明提供的一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测mirnas的应用，具体检测方法为：a、将2.5od的dnas1、dnahp1、dnahp2和mirna-21序列分别溶解在缓冲溶液中，得到dnas1缓冲溶液、dnahp1缓冲溶液、dnahp2缓冲溶液和mirna-21缓冲溶液；b、将抛光处理后的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，进行电沉积，取出，清洗，得到修饰了金纳米粒子的玻碳电极；c、将步骤b得到的修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入到dnas1的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了单链dnas1的玻碳电极；d、将步骤c得到的修饰了单链dnas1的玻碳电极浸入6-巯基-1-己醇溶液中，培养，清洗；e、将不同浓度的mirna-21缓冲溶液和dnahp1、dnahp2缓冲溶液混合，杂交，制备成不同浓度的dnahp1-hp2溶液；f、将步骤d得到的修饰了6-巯基-1-己醇/dnas1玻碳电极浸入步骤e中得到的不同浓度的dnahp1-hp2溶液，培养，然后取出，清洗，得到修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极；g、将步骤f得到的修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极浸入硝酸银溶液中，培养，再将电极浸入硼氢化钠溶液中，培养，然后取出，清洗，即得；h、将步骤g获得银纳米簇的玻碳电极浸入含有过硫酸钾的磷酸盐缓冲液pbs(0.1m)中，用电致化学发光方法进行检测；根据不同浓度的mirna-21制备的银纳米簇对应的发光强度，构建信号强度与mirna-21浓度的线性关系，实现对mirna-21的检测。具体的，步骤a为将购买的分别为2.5od的dnas1、dnahp1和dnahp2序列分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中分别得到浓度为100μm的dnas1缓冲溶液、浓度为100μmdnahp1缓冲溶液和浓度为100μmdnahp2缓冲溶液；2.5od的mirna-21用depc水配置成20μm的缓冲溶液，在4℃下保存备用；制得的上述溶液根据使用需要进行稀释。进一步的，步骤a中dnas1序列为：5'-sh-ggttgctatatcg-3’；dnahp1序列为：5'-cccccccccccctcaacatcagtctgataagctaccgtcttgagctagcttatcagactgcgatatagcaacc-3；dnahp2序列为：5'-taagctagctcaagacggtagcttatcagactgccgtcttgagccccccccccccc；mirna-21序列为：5'-uagcuuaucagacugauguuga-3’。进一步的，步骤a中磷酸盐缓冲溶液的ph为7.4,浓度为0.1m。具体的，步骤b为：将抛光处理后的玻碳电极浸入2ml质量分数为0.1％的氯金酸溶液中，进行电沉积，电沉积电位是-0.2v，电沉积时间是100秒。获得的金纳米粒子具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的金纳米颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。进一步的，步骤c中，所述抛光处理后的玻碳电极具体处理方法为：玻碳电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比hno3:h2o＝1:1的溶液、乙醇溶液和超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。进一步的，步骤c具体为：将修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入5μm的dnas1的缓冲溶液中培养10-12h后取出，用磷酸盐缓冲溶液清洗,以此清除没有吸附的探针dnas1。进一步的，步骤d中所述培养，具体是：在37℃-40℃下培养1-1.5h，6-巯基-1-己醇用于封闭电极表面活性位点，避免非特异吸附。进一步的，步骤e具体是：将40μl5μm的dnahp1缓冲溶液、40μl5μm的dnahp2缓冲溶液和10μl不同浓度的mirna-21缓冲溶液混合，在37℃杂交2h，目标物mirna-21与其部分碱基互补配对的dnahp1结合形成杂交链，与dnahp1链更多碱基配对的dnahp2将mirna-21剥夺下来形成dnahp1-hp2，被剥夺下来的的mirna-21参与下一个循环过程，因此经过催化发夹自组装放大过程得到不同浓度的dnahp1-hp2溶液；步骤e中所述mirna-21缓冲溶液浓度分别为10-3,10-2,10-1,1,10,102,103和104fm。进一步的，步骤f中所述培养，具体是：在37℃下培养2h。进一步的，步骤g具体是：将修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极浸入120μl30μm硝酸银溶液中，在4℃下避光培养0.5-1h，再浸入120μl30μm硼氢化钠溶液中，4℃下避光培养2-2.5h，利用硼氢化钠的还原性合成以dna为模板的银纳米簇，然后取出，清洗，即得。步骤h具体为：将步骤g获得银纳米簇的玻碳电极浸入3ml含有0.5m过硫酸钾的0.1mpbs磷酸盐缓冲液中，光电倍增管高压设置为800v，扫描电压范围是0v到-1.6v，在室温下进行电致化学发光检测，根据不同浓度的mirna-21加入，引发催化发夹自组装放大系统，产生不同浓度的dnahp1-hp2，不同浓度的dnahp1-hp2形成不同浓度的银纳米簇(如图1b)，不同的银纳米簇对应不同的发光强度，构建信号强度与mirna-21浓度的线性关系，实现对mirna-21的检测。本实验中所用磷酸盐缓冲溶液的ph是6.0-8.5，最优的ph为7.4。以dna为模板形成的银纳米簇可以与共反应剂过硫酸钾产生反应，反应过程为：(1)agncs+e–→agncs–·(2)s2o82–+e–→so42–+so4–·(3)agncs–·+so4–·→agncs*+so42–(4)agncs*→agncs+hν。通过此过程，银纳米簇的光信号被获得，信号强度与银纳米簇的量有关，也就是与双链dnahp1-hp2的浓度有关，也就间接与mirna-21的浓度有关。随着mirna-21浓度的增加，银纳米簇的电致化学发光信号随之增强，构建了信号强度与mirna-21浓度的线性关系，实现对mirna-21的检测。因此，此传感器可对不同浓度的mirna-21进行定量检测。与现有技术相比，本生物传感器的制备方法，使用银纳米簇合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，将dna，银纳米簇进行关联，进而利用dna碱基互补配对原则构建成一个催化发夹自组装放大系统，同时电沉积的金纳米粒子可以吸附更多dnas1，dnas1可以吸附更多的dnahp1-hp2，形成更多的银纳米簇，因此金纳米粒子也对银纳米簇的获得具有进一步的放大作用，因此可以制备更多具有电致化学发光性能的银纳米簇，便于仪器对光信号的收集。利用银纳米簇的电致化学发光信号，构建与mirna-21浓度的线性关系，实现对mirna-21的检测。因此对mirna-21的检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好、稳定性好的特点。附图说明图1a为基于dna为模板形成银纳米簇的构建电致化学发光传感器过程的示意图；图1b为基于此电致化学发光传感器检测mirna-21的示意图；图2a为基于此电致化学发光传感器检测mirna-21可行性实验的电致化学发光检测；图2b为基于此电致化学发光传感器检测mirna-21可行性实验的循环伏安法检测；a为裸玻碳电极；b为金纳米粒子/银纳米簇修饰的玻碳电极；c为引入目标物的金纳米粒子/银纳米簇玻碳电极；图3a为修饰电极各步骤的循环伏安图；a为裸玻碳电极；b为金纳米粒子修饰的玻碳电极；c为单链dnas1修饰的玻碳电极；d为用6-巯基-1-己醇溶液处理的玻碳电极；e为用目标物mirna-21溶液处理的玻碳电极；图3b为修饰电极各步骤的阻抗图；a为裸玻碳电极；b为金纳米粒子修饰的玻碳电极；c为单链dnas1修饰的玻碳电极；d为用6-巯基-1-己醇溶液处理的玻碳电极；e为用目标物mirna-21溶液处理的玻碳电极；图4a为dnah1和dnah2的浓度对本实验的影响图。图4b为磷酸盐缓冲溶液ph的优化图；图4c为催化发夹自组装培养时间的优化图；图4d为催化发夹自组装培养温度的优化图；图5为基于dna为模板形成银纳米簇构建电致化学发光传感器对不同浓度mirna-21的发光强度图；a为10-3fm,b为10-2fm,c为10-1fm1,d为1fm,e为10fm,f为102fm,g为103fm,h为104fm；图6为此传感器对不同浓度mirna-21的标准曲线；图7a为不同干扰物相应的电致化学发光强度图；a为空白，b为mirna-155，c为mirna-101，d为单个碱基错配mirna-21，e为mirna-21，f为混合物包括mirna-155、mirna-101、单个碱基错配mirna-21和mirna-21；图7b为此传感器对检测目标物1fmmirna-21的稳定性图。具体实施方式实施例1一种基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测mirnas的应用，具体检测方法为：(1)、将购买的2.5od的dnas1、dnahp1、dnahp2序列分别溶解在ph为7.4浓度为0.1m磷酸盐缓冲溶液中，分别得到浓度100μm的dnas1缓冲溶液、浓度为100μmdnahp1缓冲溶液和浓度为100μmdnahp2缓冲溶液；将2.5od的mirna-21用depc水配置成20μm的缓冲溶液，在4℃下保存备用；制得的上述溶液根据使用需要进行稀释。其中dnas1序列：5'-sh-ggttgctatatcg-3’，dnahp1序列：5'-cccccccccccctcaacatcagtctgataagctaccgtcttgagctagcttatcagactgcgatatagcaacc-3’dnahp2序列：5'-taagctagctcaagacggtagcttatcagactgccgtcttgagcccccccccccccmirna-21序列：5'-uagcuuaucagacugauguuga-3’(2)、玻碳电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比hno3:h2o＝1:1溶液、乙醇溶液和超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min，将抛光处理后的玻碳电极浸入2ml质量分数为0.1％的氯金酸溶液中，进行电沉积，电沉积电位是-0.2v，电沉积时间是100秒，获得金纳米粒子修饰的玻碳电极；(3)、将修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸泡在含有5μmdnas1的缓冲溶液中，室温下培养12h，通过金硫键使dnas1结合到电极表面；(4)、将步骤(3)得到的修饰了单链dnas1的玻碳电极浸入到10mm6-巯基-1-己醇溶液中，在37℃下培养1h,6-巯基-1-己醇用于封闭电极表面活性位点，避免非特异吸附；(5)、将40μl5μmdnahp1缓冲溶液、40μl5μmdnahp2缓冲溶液和10μl浓度为10-3,10-2,10-1,1,10,102,103，104fmmirna-21的缓冲溶液分别混合，在37℃杂交2h目标物mirna-21与其部分碱基互补配对的h1结合形成杂交链，与h1链更多碱基配对的h2将mirna-21剥夺下来形成dnahp1-hp2，被剥夺下来的的mirna-21参与下一个循环过程，因此经过催化发夹自组装放大过程，得到不同浓度dnahp1-hp2溶液；(6)、将步骤(4)中得到的修饰了6-巯基-1-己醇/dnas1玻碳电极浸入步骤(5)中得到的dnahp1-hp2溶液中，在37℃下培养2h，从而得到修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极；(7)、将修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极浸入120μl30μm硝酸银溶液中，在4℃下避光培养0.5-1h，再浸入120μl30μm硼氢化钠溶液中4℃下避光培养2-2.5h，利用硼氢化钠的还原性合成以dna为模板的银纳米簇；(8)、将步骤(7)获得银纳米簇的玻碳电极浸入3ml含有0.5m过硫酸钾的磷酸盐缓冲液pbs(0.1m，ph7.4)中，光电倍增管高压设置为800v，扫描电压范围是0v到-1.6v，在室温下进行电致化学发光检测，得到不同浓度的mirna-21浓度对应的信号强度,如图5；构建信号强度与mirna-21浓度的线性关系，如图6，利用此线性关系实现对mirna-21的检测。实施例2基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测mirna-21的可行性放大检测研究：a、抛光处理的裸玻碳电极，不进行后续处理；b、将抛光处理的裸玻碳电极浸入氯金酸溶液中进行电沉积获得修饰金纳米粒子的玻碳电极，再将其浸泡在含有5μmdnas1的缓冲溶液中，室温下培养10-12h，再将此电极浸入到10mm6-巯基-1-己醇溶液中，在37℃下培养1h，然后将获得的电极浸泡在5μmdnahp1-hp2的缓冲溶液中，最后将修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极浸入120μl30μm硝酸银溶液中，在4℃下避光培养1h，再浸入120μl30μm硼氢化钠溶液中4℃下避光培养2h，利用硼氢化钠的还原性合成以dna为模板的银纳米簇(如图1a)；c、电极的组装过程(如图1b)，具体操作过程与步骤b相似，被6-巯基-1-己醇溶液处理的玻碳电极浸入到含有104fm目标物mirna-21，5μmdnahp1和5μmdnahp2的混合溶液中，目标物引发催化发夹自组装放大系统，得到dnahp1-hp2，修饰了dnahp1-hp2的玻碳电极经过和步骤b相同的硝酸银和硼氢化钠的处理，得到由目标物引发形成的银纳米簇；将按着上述a,b,c三种方法获得的电极进行电致化学发光检测(如图2a)和循环伏安法检测(如图2b)，所获得的实验结果证明此设计可有效放大检测目标物mirna-21。组装过程中，电极表面分别用循环伏安法(图3a)和电化学阻抗法表征(图3b),证明组装过程是成功的。实施例3基于dna-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测mirna-21优化条件：根据实施例1制备的电致化学发光传感器检测检测mirna-21，改变dnahp1和dnahp2的浓度都为1、2、3、4、5、6、7μm(dnahp1和dnahp2浓度相同)，控制mirna-21的浓度是1fm，其他条件相同。检测形成银纳米簇的电致化学发光信号，结果如图4a，表明5μm为实验最佳浓度；根据实施例1制备的电致化学发光传感器检测检测mirna-21，改变溶液的ph为6、6.5、7、7.4、7.5、8和8.5，控制mirna-21的浓度是1fm，其他条件相同。检测形成银纳米簇的电致化学发光信号，结果如图4b，表明溶液最佳ph值是7.4；根据实施例1制备的电致化学发光传感器检测检测mirna-21，改变催化发夹自组装放大过程的培养时间为0.5、1、1.5、2、2.5、3h,控制mirna-21的浓度是1fm，其他条件相同。检测形成银纳米簇的电致化学发光信号，结果如图4c，表明2h是催化发夹自组装放大过程的最佳培养时间；根据实施例1制备的电致化学发光传感器检测检测mirna-21，改变催化发夹自组装放大过程的培养温度为20、25、30、35、37、40、45℃，控制mirna-21的浓度是1fm，其他条件相同。检测形成银纳米簇的电致化学发光信号，结果如图4d，表明37℃是催化发夹自组装放大过程的最佳培养温度。实施例4在实施例3中探索的最优实验条件下，根据实施例1制备的电致化学发光传感器检测mirna-21，改变mirna-21的浓度分别为10-3,10-2,10-1,1,10,102,103，104fm，检测相对应获得的银纳米簇的电致化学发光强度，构建线性关系，实现对mirna-21的检测。实施例5在实施例3中探索的最优实验条件下，根据实施例1制备的电致化学发光传感器检测mirna-21的方法，将mirna-21分别替换为mirna-155，mirna-101，单个碱基错配mirna-21干扰物和mirna-21与干扰物的混合物，检测相对应获得的银纳米簇的电致化学发光强度，如图7a，说明此电致化学发光传感器具有很好的选择性；此外，当目标物是1fm时，当组装电极被持续扫描15个循环以后，实验结果如图7b,相对标准偏差是1.61％，表明此电致化学发光传感器具有很好的稳定性。利用本发明制备的传感器的检测结果与现有技术相比，检测范围、检测限对比：结果如下表1：表1：方法检测范围检测限参考文献电致化学发光传感器100am-100pm22amchenetal.,2016电致化学发光传感器1.0fm-1.0nm0.5fmfengetal.,2016电化学传感器25fm-300fm8.2fmwangetal.,2015荧光传感器1fm-10pm0.6fmdongetal.,2014荧光传感器10fm-1nm10fmduanetal.,2013电致化学发光传感器1am-10pm1am本申请本申请检测范围广，1am-10pm，检测限为1am，检测方法简单，灵敏度高，稳定性好。当前第1页12