本发明涉及一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，属于生物质能源检测领域。
背景技术：
微藻用于生产生物柴油已经有了一定的研究，但是在微藻积累油脂的原理及积累的动态过程等方面研究还相对较少。目前研究发现，脂肪酸的合成需要经过一系列的酶促反应，参与酶促反应的酶包括丙酮酸脱氢酶、乙酰-coa羧化酶、脂肪酸合酶等，而经过这一系列的反应后脂肪酸需要进入叶绿体、内质网和细胞溶胶等细胞结构中进行长链脂肪酸的合成。各种藻类合成的脂肪酸成分与含量有较大的差异，脂肪酸在微藻干重中的比例也有显著差距，甚至在不同的培养条件下同种微藻内的脂肪酸成分和含量也会有产生影响。将微藻用于生产生物柴油时，细胞中的脂肪酸含量是重要的考虑因素之一。但是目前的检测手段对于微藻内油脂成分及含量的检测耗时长并且预处理复杂，不仅无法及时检测细胞内油脂含量并且无法对油脂积累的机理进行快速准确研究。
拉曼成像技术是通过拉曼光谱技术与显微成像技术相结合的综合技术，能够对分子进行特异性“指纹”识别。拉曼成像技术能够获取整个细胞的光谱信息，通过特征峰位的分析可以确定特定物质在细胞内的分布。拉曼成像技术空间分辨率高，获取的光谱信息精准特异性强，可以获取细胞核亚细胞结构的可视化信息、分子的扩散和结构特性，蛋白质与蛋白质的相互作用及一些不可见的胞内反应。采用共聚焦显微拉曼技术观察茶叶感染炭疽病时细胞壁的结构和化学成分的变化，研究将共聚焦显微拉曼技术应用于植物病理学机制的研究中，取得了良好的实验结果。
拉曼光谱技术在微藻中已有一定的研究，moudfikova等人采用拉曼光谱技术通过获取整个蛋白核小球藻的光谱信息，通过特征峰位指认出多磷酸盐，并建立二维拉曼伪彩图表征出多磷酸盐在细胞中的分布。
目前微藻细胞中的脂肪酸不饱和度检测方法采用气相色谱质谱法(gc-ms)方法，这种方法需要对样品进行前处理，因此该检测方法存在操作过程繁琐，耗时费力，需要消耗大量的有机试剂，难以实现大批量地快速定量检测等技术问题。
参考文献
【1】sameko,zemánekp,
【2】shaoy.n,fangh,zhouh,etal.detectionandimagingoflipidsofscenedesmusobliquusbasedonconfocalramanmicrospectroscopy[j].biotechnologyforbiofuels,2017,doi.org/10.1186/s13068-017-0977-8.
【3】sarwa,prakashandkumarverma,sanjay.toxicityassessmentofzn(ii)solutiontreatedwithmicroalgaescenedesmussp.mcc26usingswissalbinomice.annualinternationalconferenceonadvancesinbiotechnology(biotech),2014(7):5-11.
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决上述的微藻细胞中的脂肪酸不饱和度检测方法所存在操作过程繁琐，耗时费力，需要消耗大量的有机试剂等技术问题而提供了一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，该测定方法不需要对样品进行前处理，操作简单，从而大大的节约了人力和时间的成本。
本发明的技术方案
一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，具体包括以下步骤：
(1)、采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪测定β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线，计算β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强度的比值；
利用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪在对β-胡萝卜素标准品进行测定时，控制温度为25℃，将β-胡萝卜素标准品放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50x的物镜聚焦到β-胡萝卜素标准品样本的表面，曝光时间1s，得到所述的拉曼光谱原始信息，然后将所得到的拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线；
所述的预处理是采用去趋势算法de-trending对拉曼光谱原始信息进行处理；
所述的去除宇宙射线是采用renishaw的wire软件对拉曼光谱原始信息进行处理；
所述的基线校正是采用unscrambler软件对拉曼光谱原始信息进行处理；
所述的去噪平滑处理是采用卷积平滑方法对拉曼光谱原始信息进行处理；
(2)、经琼脂固定的待测微藻细胞样品的制备
将待测微藻接种到装有微藻培养基的250ml锥形瓶中，然后置于简易光生物培养机上，控制温度25℃、相对湿度为80％、光照强度2500lux-3500lux进行光照培养一周，光照培养过程中每24h中光照12h、黑暗12h，得到微藻液；
所述的待测微藻为蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻或雨生红球藻；
上述待测微藻光照培养过程中从开始光照培养直至光照培养结束，每隔一天取一次样测量微藻生物量，然后按照培养时间和微藻生物量的关系，判断微藻生命周期，取稳定期的微藻液作为待测微藻液；
微藻生物量测定采用分光光度计法或血小板计数法；
取上述的待测微藻液8ml于15ml离心管中，然后加入2ml蒸馏水稀释藻液，得到稀释后的待测微藻液；
为了采集到活体微藻细胞拉曼光谱信号，用质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液固定稀释后的待测微藻液中的待测微藻细胞，得到经琼脂固定的待测微藻细胞样品，步骤如下：
将琼脂粉加入到蒸馏水中，升温到40℃，得到质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液，然后按体积比计算，稀释后的待测微藻液：质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液均为1:5的比例，将稀释后的待测微藻液与上述质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液进行混合均匀，待琼脂冷却凝固后，即得到经琼脂固定的待测微藻细胞样品；
(3)、通过双层刀片切取步骤(2)所得的经琼脂固定的待测微藻细胞样品，放置于载玻片上，盖上盖玻片，然后放置在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪的载物台上，控制温度为25℃，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50x的物镜聚焦到经琼脂固定的待测微藻细胞样品的表面，曝光时间1s，在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪下进行观察经琼脂固定的待测微藻细胞样品，得到待测微藻细胞样品拉曼光谱原始信息，然后将所得到的待测微藻细胞样品的拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到待测微藻细胞的拉曼光谱曲线，进一步得到待测微藻细胞在1525cm-1处的拉曼峰强为f1，在1445cm-1的拉曼峰强为f2，在1660cm-1的拉曼峰强为f5；
由于原始拉曼光谱图受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此要先进行预处理，所述的预处理是采用去趋势算法de-trending对拉曼光谱原始信息进行处理；
所述的去除宇宙射线是采用renishaw的wire3.3软件对拉曼光谱原始信息进行处理；
由于采集微藻样品拉曼光谱时，获取的生物体拉曼光谱会存在一定的荧光背景，且存在基线漂移现象，因此在对存在宇宙射线的光谱进行处理后，需要对拉曼光谱基线校正与去噪平滑处理；所述的基线校正是采用unscrambler软件对拉曼光谱原始信息进行处理；
所述的去噪平滑处理是采用卷积平滑方法对拉曼光谱原始信息进行处理；
(4)、利用β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强的比值a，待测微藻细胞拉曼光谱曲线在1525cm-1处的拉曼峰强f1，计算出待测微藻细胞在1445cm-1处其含有β-胡萝卜素的拉曼峰强f3，即f3＝a*f1；
(5)、将待测微藻细胞在1445cm-1的拉曼峰强f2扣除其在1445cm-1处其含有β-胡萝卜素的拉曼峰强f3，即得到待测微藻细胞不含β-胡萝卜素，仅为有效的脂肪酸在1445cm-1的拉曼峰强f4，即f4＝f2-f3；
(6)、通过脂肪酸标准品不饱和度和1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强的比值的关系，得到脂肪酸标准品不饱和度的计算公式：iv＝-8.0436x2+116.59x+9.469，其中iv为脂肪酸标准品的不饱和度，x为脂肪酸标准品在1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强的比值；
(7)、将待测微藻细胞在1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强的比值f5/f4作为x代入步骤(6)所得的公式iv＝-8.0436x2+116.59x+9.469中，即得待测微藻细胞中的脂肪酸不饱和度值iv。
在上述的步骤(1)中，选取β-胡萝卜素在1525cm-1处的拉曼特征峰，由于脂肪酸在此处没有特征峰，因此选取该峰来扣除相对影响。
本发明的有益技术效果
本发明的一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，由于采用快速/非破坏的拉曼光谱信号采集，因此其测定过程不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。
附图说明
图1、β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线；
图2、蛋白核小球藻的拉曼光谱曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明的实施例中所用的雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪的型号invia，生产厂家英国雷尼绍renishaw公司。
所述的去趋势算法de-trending，详见参考文献2；
所述的renishaw的wire3.3软件，renishaw,unitedkingdom；
所述的unscrambler软件，camoas,oslo,norway；
所述的卷积平滑方法，详见参考文献2。
本发明的实施例中待测微藻生物量测定，采用血小板计数法(参考文献3)估算微藻的生物量。
本发明的实施例中所用的普通小球藻(chlorellavulgaris)、蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)、衣藻(chlamydomonassp.)、雨生红球藻(haematococcuspluvialis)购置于中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库，微绿球藻(nannochlorisoculata)购置于中国科学院海洋研究所。
本发明的实施例中所用的bg11培养基，按每升计算，其含10ml浓度为150.0g/l的nano3、10ml浓度为4.0g/l的k2hpo4、10ml浓度为7.5g/l的mgso4·7h2o、10ml浓度为3.6g/l的cacl2·2h2o、10ml浓度为0.6g/l的柠檬酸水溶液、10ml浓度为0.6g/l的柠檬酸铁铵、10ml浓度为0.1g/l的edtana2水溶液，10ml浓度为2.0g/l的na2co3水溶液及1ml的a5溶液，余量为水，在120℃条件下灭菌30min，待冷却至室温后待用；
其中所用的a5溶液，按每升计算，其含2.86g的h3bo3，1.86g的mncl2·4h2o，0.22g的znso4·7h2o，0.39g的na2moo4·2h2o，0.08g的cuso4·5h2o，0.05g的co(no3)2·6h2o，余量为水。
所用的se培养基，按每升计算，其含1ml浓度为250.0g/l的nano3水溶液、1ml浓度为75.0g/l的k2hpo4水溶液、1ml浓度为75.0g/l的mgso4·7h2o水溶液、1ml浓度为25.0g/l的cacl2·2h2o水溶液、1ml浓度为175.0g/l的kh2po4水溶液、1ml浓度为25.0g/l的nacl水溶液、1ml浓度为5.0g/l的fecl3·6h2o水溶液、1ml的edta-fe水溶液、1ml的a5溶液、40ml的土壤提取液(购自上海光语生物科技有限公司)，余量为水，在120℃条件下灭菌30min，待冷却至室温后待用；
其中所用的a5溶液，按每升计算，其含2.86g的h3bo3，1.86g的mncl2·4h2o，0.22g的znso4·7h2o，0.39g的na2moo4·2h2o，0.08g的cuso4·5h2o，0.05g的co(no3)2·6h2o，余量为水。
所用的f/2培养基，按每升计算，其含1ml浓度为75g/l的nano3水溶液、1ml浓度为5g/l的nah2po4·h2o水溶液、1ml浓度为30g/l的na2sio3·9h2o水溶液、1mltraceelements、0.5ml的vitaminsolution，余量为水，在120℃条件下灭菌30min，待冷却至室温后待用；
其中所用的traceelements，按每升计算，含3.15g的fecl3·6h2o，4.36gna2edta·2h2o、1ml浓度为9.8g/l的cuso4·5h2o水溶液、1ml浓度为6.3g/l的na2moo4·2h2o水溶液，1ml浓度为22.0g/l的znso4·7h2o水溶液，1ml浓度为10.0g/l的cocl2·6h2o水溶液，1ml浓度为180.0g/l的mncl2·4h2o水溶液，余量为水；
其中所用的vitaminsolution，按每升计算，含1ml浓度为1.0g/l的vitaminb12水溶液，10ml浓度为0.1g/l的biotin水溶液，200mg的thiamine·hcl，余量为水。
实施例1
一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，包括以下步骤：
(1)、采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪对β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线进行测定；
上述利用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪在对β-胡萝卜素标准品进行测定时，控制温度为25℃，将β-胡萝卜素标准品放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50x的物镜聚焦到β-胡萝卜素标准品样本的表面，曝光时间1s，得到β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱原始信息，然后将所得到的β-胡萝卜素标准品拉曼光谱原始信息依次采用去趋势算法对拉曼光谱原始信息进行预处理、采用renishaw的wire3.3软件去除宇宙射线、利用unscrambler软件对拉曼光谱基线校正和通过卷积平滑方法对拉曼光谱去噪平滑处理，最终得到β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线，结果如图1所示，计算β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强的比值为a＝1/25；
通过图1中β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱数据分析发现，其在1449cm-1处有特征峰，而这特征峰很可能加大了微藻中脂肪酸分子中的c＝c在1445cm-1的特征峰表现，使得微藻脂肪酸不饱和度偏大，由于实验中用到的5种微藻都含有β-胡萝卜素，因此在计算上述微藻脂肪酸不饱和度时，有必要扣除β-胡萝卜素在1445cm-1拉曼位移下的特征峰影响；
由于β-胡萝卜素在1525cm-1处有明显的拉曼特征峰，而脂肪酸在此处并没有特征峰，因此可利用该峰来扣除相对影响；
(2)、经琼脂固定的5种待测微藻细胞样品的制备
将5种待测微藻在超净台内接种于分别装有对应培养基的250ml锥形瓶中，然后放置于简易光生物培养机上，控制温度25℃左右，相对湿度保持在80％左右，光照强度2500lux进行光照培养168h，光照培养过程中每天光照12h、黑暗12h，得到5种微藻液；
上述每个锥形瓶中放入磁力转子，在微藻初级培养平台上，利用磁力搅拌器每天多次进行搅拌，以确保co2在瓶中的溶解量。
所述的5种待测微藻为蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻和雨生红球藻；其中所述普通小球藻采用bg11培养基进行培养，蛋白核小球藻、衣藻、雨生红球藻采用se培养基进行培养，微绿球藻采用f/2培养基进行培养。
上述待测微藻光照培养过程中从开始光照培养直至光照培养结束，每隔24h取一次样测量微藻生物量，生物量的测定采用血小板计数法；
然后按照培养时间和微藻生物量的关系，判断待测微藻生命周期；
光照培养至168h时，待测蛋白核小球藻达到稳定期；
光照培养至144h时，待测微绿球藻达到稳定期；
光照培养至144h时，待测普通小球藻达到稳定期；
光照培养至168h时，待测衣藻达到稳定期；
光照培养至144h时，待测雨生红球藻达到稳定期；
5种待测微藻，均取光照培养达到稳定期的微藻液作为待测微藻液；
上述的每种微藻液达到稳定期后分别取8ml作为待测微藻液分别于15ml离心管中，然后分别加入2ml蒸馏水稀释待测微藻液，得到稀释后的5种待测微藻液；
用质量百分比浓度为3％的琼脂水溶液分别固定上述所得的稀释后的5种待测微藻样液中的待测微藻细胞，步骤如下：
将琼脂粉加入到蒸馏水中，升温到40℃，得到质量百分比浓度为3％的琼脂水溶液，然后按体积比计算，稀释后的5种待测微藻液：质量百分比浓度为3％的琼脂水溶液均为1:5的比例，将稀释后的5种待测微藻液分别逐一与质量百分比浓度为3％的琼脂水溶液进行混合均匀，待琼脂冷却凝固后，得到经琼脂固定的5种待测微藻细胞样品；
(3)、通过双层刀片切取步骤(2)所得的经琼脂固定的5种待测微藻细胞样品，分别放置于载玻片上，盖上盖玻片，然后将经琼脂固定的5种待测微藻细胞样品之一：蛋白核小球藻放置在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪的载物台上，控制温度为25℃，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50x的物镜聚焦到经琼脂固定的5种待测微藻细胞样品之一：经琼脂固定的待测蛋白核小球藻细胞样品的表面，曝光时间1s，在拉曼光谱仪下进行观察待测经琼脂固定的蛋白核小球藻细胞样品，得到经琼脂固定的蛋白核小球藻细胞样品的拉曼光谱原始信息；
然后按上述的方式逐一获得另外经琼脂固定的4种待测微藻细胞样品中的4种待测微藻细胞样品的拉曼光谱原始信息；
然后将所得到的蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻、雨生红球藻5种经琼脂固定的待测微藻细胞样品的拉曼光谱原始信息依次依次去趋势算法对拉曼光谱原始信息进行预处理、采用renishaw的wire3.3软件去除宇宙射线、利用unscrambler软件对拉曼光谱基线校正和通过卷积平滑方法对拉曼光谱去噪平滑处理，最终得到5种待测微藻细胞的拉曼光谱曲线，进一步得到待测的蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻、雨生红球藻5种微藻细胞在1525cm-1处的拉曼峰强为f11、f12、f13、f14、f15，在1445cm-1的拉曼峰强为f21、f22、f23、f24、f25，在1660cm-1处的拉曼峰强为f51、f52、f53、f54、f55，其中待测的蛋白核小球藻细胞的拉曼光谱曲线结果如图2所示，从图2中可以看出1660cm-1和1445cm-1处存在明显的油脂峰，我们选取1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强比值研究脂肪酸不饱和度；
(4)、利用步骤(1)所得的β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强的比值a＝1/25及步骤(2)所得的蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻、雨生红球藻5种待测微藻细胞的拉曼光谱曲线在1525cm-1处的拉曼峰强为f11、f12、f13、f1、f15，分别计算出蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻、雨生红球藻5种待测微藻细胞在1445cm-1处其含有β-胡萝卜素的拉曼峰强f31＝a*f11＝f11/25、f32＝a*f12＝f12/25、f33＝a*f13＝f13/25、f34＝a*f14＝f14/25、f35＝a*f15＝f15/25；
(5)、将步骤(3)所得的蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻、雨生红球藻5种待测微藻细胞在1445cm-1的拉曼峰强f21、f22、f23、f24、f25扣除其在1445cm-1处其含有β-胡萝卜素的拉曼峰强f31、f32、f33、f34、f35，即得到蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻、雨生红球藻5种待测微藻细胞不含β-胡萝卜素，仅为脂肪酸在1445cm-1的拉曼峰强为f41、f42、f43、f44、f45，即f41＝f21-f31、f42＝f22-f32、f43＝f23-f33、f44＝f24-f34、f45＝f25-f35；
(6)、通过脂肪酸标准品的不饱和度和1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强比值的关系，得到脂肪酸标准品不饱和度的计算公式：iv＝-8.0436x2+116.59x+9.469，其中iv为脂肪酸标准品的不饱和度，x为脂肪酸标准品在1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强的比值；
(7)、5种待测微藻细胞，即蛋白核小球藻细胞、微绿球藻细胞、普通小球藻细胞、衣藻细胞、雨生红球藻细胞在1660cm-1和1445cm-1下的拉曼峰强的比值分别为f51/f41、f52/f42、f53/f43、f54/f44、f55/f45；
将f51/f41、f52/f42、f53/f43、f54/f44、f55/f45分别作为x，代入步骤(6)所得的公式iv＝-8.0436x2+116.59x+9.469中，即分别得到5种待测微藻细胞，即蛋白核小球藻细胞、微绿球藻细胞、普通小球藻细胞、衣藻细胞、雨生红球藻细胞中的脂肪酸不饱和度值iv。
每个待测微藻液细胞样品取40个样进行测定，最终所得到5种待测微藻细胞，即蛋白核小球藻细胞、微绿球藻细胞、普通小球藻细胞、衣藻细胞、雨生红球藻细胞的拉曼光谱在1660cm-1和1445cm-1拉曼位移下的拉曼峰强的比值x的平均值、x的标准偏差，5种待测微藻细胞，即蛋白核小球藻细胞、微绿球藻细胞、普通小球藻细胞、衣藻细胞、雨生红球藻细胞中的脂肪酸不饱和度iv的最小值、iv的最大值、iv的平均值和iv的标准偏差，具体如表1所示：
表1.5种微藻拉曼光谱在1660cm-1和1445cm-1拉曼位移下的拉曼峰强比值(x)和不饱和度(iv)结果表(校正后)
对照实施例
气相色谱质谱法(gc-ms)(samek等人(2011))是目前微藻油脂分析的主要方法。本发明人借助气质联用gc-ms的方法(采用的仪器是赛默飞tsq8000evo三重四极杆气质联用仪，型号tsq8000evo，美国)检测计算得到普通小球藻细胞中的脂肪酸不饱和度为131.20。
通过与上述表1的对比，本发明的测定方法中得到的普通小球藻细胞中的脂肪酸不饱和度值为124.50，其最大值为131.05与gc-ms测得的普通小球藻细胞中的脂肪酸不饱和度值131.20只少了0.11％，可以说几乎相等。比较5种微藻校正后的数据发现5种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度iv的平均值提高了14.07％，5种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度iv的标准偏差平均值降低了24.69％。由此表明了本发明的微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法的可靠性与精度是可行的。
综上所述，本发明的一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，解决了微藻细胞中的脂肪酸不饱和度检测方法存在操作过程繁琐，耗时费力，需要消耗大量的有机试剂等技术问题。经与国标法gc-ms比较以后，得到该计算方法的可靠性与精度是可行的，可以应用于实际生产中对微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定。
以上内容仅为本发明的基本说明和优选方案，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。