本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法。
背景技术：
转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容。
我国对转基因水稻的研究处于世界领先水平，其中，研发的一些抗病、抗虫转基因水稻品系已经申请生产种植用生物安全证书，但由于它们的转基因生物安全问题等一些原因，至今尚未有品系批准商业化生产应用。鉴于转基因水稻技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测bt蛋白的方法，具有必要性和紧迫性。
目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是pcr扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。pcr反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。
蛋白检水平的检测，主要是基于抗原和抗体相互作用的免疫学方法，针对转基因植物及其产品中外源目的基因表达的特异性蛋白进行定性和定量检测。1971年瑞典的engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosrbentassay，简称elisa方法)。1974年voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使elisa方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于elisa方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得elisa方法得到了越来越广泛的应用。
但是随着检测灵敏度的要求越来越高，通过转基因成分的检测和蛋白质两个水平的检测已经完全不能满足目前发展的需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于转基因水稻中bt的高灵敏度快速检测方法，利用核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子实现快速的检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于核酸适配体-量子点结合苏云金芽孢杆菌孢子的荧光测定法，包括以下步骤：
(1)核酸适配体-量子点的制备：
1.1、将13.9μl10mmsmcc(琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)添加到125μl量子点中并在室温下放置一小时以激活量子点；
1.2、在300μl1mg/ml一倍工作浓度的pbs溶液中制备5′巯基修饰的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl1m的二硫苏糖醇(dtt)并在室温下放置30分钟以缩减适配体；
1.3、激活量子点的溶液以及缩减适配体的溶液分别通过一个nap-5脱盐柱(sephadexg-25脱盐柱)，每个溶液收集500μl；
1.4、然后将量子点和缩减适体在室温下反应一个小时。将10.1μlβ-巯基乙醇(100μm的最终浓度)加入到混合物中来淬火共轭反应，并在室温下放置30分钟，通过柱纯化，共收集到250μl核酸适配体-量子点；
1.5、将10μl核酸适配体-量子点溶解在1ml反渗透纯净水中。运用一个uv-2100分光光度计来衡量在260nm时的吸光度；
1.6、核酸适配体-量子点的实际浓度由与最初的核酸适配体浓度(1.08mg/ml)进行比较来决定。
(2)将核酸适配体-量子点与芽孢杆菌孢子结合：
2.1、将30μl核酸适配体-量子点放置在一个试管中并用600μlpbs进行稀释。
2.2、用同样的程序进行一系列重复的反应：核酸适配体-量子点无孢子，非结合的量子点与bt孢子，核酸适配体-量子点与纯化的bt孢子结合，核酸适配体-量子点与bg孢子结合；
2.3、之前收集的孢子，用pbs将13mm微孔膜过滤器(pvdf，亲水性，0.45μm)洗两次，孢子暴露于核酸适配体-量子点或非结合的量子点中的任何一个后在过滤器中收集并用1ml一倍工作浓度的pbs溶液洗涤三次，洗过的孢子在1mlpbs中收集。
作为本发明实施例的优选，在所述步骤1.4中，反应产物使用0.5ml集中器集中，然后添加到200柱superdex脱盐柱并用pbs进行洗脱。。
作为本发明实施例的优选，所述步骤1.6中，核酸适配体共轭量子点的百分比被确定为98％。
作为本发明实施例的优选，将pbs稀释的100μl核酸适配体-量子点分别加入900μl107,106,105,104,103cfu的bt孢子中。混合物用vsm3旋涡混合器短暂的涡旋(速度8)并放置在室温下反应20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明经济实用，反应是在恒温的条件下进行,所以不需要昂贵的pcr仪，而且检测周期比较短。
2.本发明检测简单：该方法检测转基因水稻中bt蛋白结果客观、易判定，可对转基因产品的含量进行定量分析。
附图说明
图1是bt的适体的二级回路结构示意图；
图2是bt孢子的荧光光谱图；
图3是游离量子点与bt孢子结合荧光光谱图；
图4是共轭核酸适配体-量子点结合bt孢子荧光光谱图；
图5是共轭核酸适配体-量子点结合纯化的bt孢子荧光光谱图；
图6是共轭核酸适配体-量子点结合bg孢子荧光光谱图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、cry1ab蛋白制备
cry1ab蛋白的制备步骤如下：参见图1至2所示，将储存于-70℃冰箱中的苏云金芽胞杆菌菌株划线到lb平板上30℃生长过夜，挑单菌落到10ml的lb培养基于30℃振荡培养过夜。再将过夜培养的菌液加入200ml的pgsm培养基中于30℃振荡培养3-4天后，在显微镜下观察细胞可以看到裂解的细胞。然后4℃，4000rpm离心15min收集培养物，用冰冷的0.1mol/lnacl洗涤沉淀一次，4℃，4000rpm离心15min收集培养物，再用冰冷的双蒸水洗涤沉淀一次，在4℃，4000rpm离心15min收集培养物，将沉淀悬浮于15ml冰冷的纯水中。再将溶液于4℃，4000rpm离心15min收集沉淀，沉淀即为cry1ab晶体蛋白。将沉淀悬浮于0.1mol/lnaoh中15min使cry1ab晶体蛋白完全溶解，马上用1mol/ltris缓冲溶液调节溶液的ph至7.0，于12000rpm离心10min后，取上清液用100倍体积的pbs溶液透析三次。其浓度采用bradford法测定。
其中：
cry1ab基因的pcr分子检测，上下游引物序列分别为
5'-gagaacttcggtacgtagc-3’
5'-aacacatgagcggtaagg-3’
所述的试剂组分及其配比如下：
lb培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeastextract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l，naoh调节该培养基的ph,使其达到7.4；
pgsm培养基：细菌蛋白胨7.5g，葡萄糖1g，kh2po43.4g，k2hpo44.35g，加蒸馏水定容至1l，调ph至7.2，121℃高温蒸汽下灭菌30min；
pbs缓冲液：kh2po40.2g，nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo42.9g，tween-200.5ml，加蒸馏水定容至1l，调ph至7.4；
tris缓冲溶液：50ml0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷(tris)溶液用0.1mol/l盐酸调节ph至7.0，加水稀释至100ml
二、水溶性cdse/zns量子点的制备
水溶性cdse/zns量子点的制备具体步骤是：称取0.0127g(0.1mmol)cdo和0.1140g硬脂酸放入50ml的三颈瓶中,在氩气保护下,加热至130℃,使cdo充分溶解于硬脂酸中。将温度降至室温后,称取三辛基氧化磷(topo)和十六烷基胺(hda)各1.5g放入三颈瓶中,搅拌加热到230℃,另称取0.032g(1mmol)s粉,在氩气保护下,使之溶解于2ml三辛基磷(top)中,抽入5ml的针管中作为储备液。当cd前驱物温度达到230℃时,将se粉储备液快速注入三颈瓶后,温度降至180℃,保持10min，收集cdse样品溶于氯仿中备用。
称取0.632g的硬脂酸锌和0.032g的硫粉分别加入2ml的十八碳烯(ode)中加热到120℃充分溶解,降温到70℃,将两种溶液混合在一起70℃下保存备用。将分散于氯仿中的cdse样品加入瓶中,加热到120℃保持30min，蒸干氯仿,升温至200℃。抽取硬脂酸锌和硫粉的十八碳烯溶液,以0.2ml/min注入zns壳层,注入完成后,升温至230℃保持1h,降温到60℃,反应产物用甲醇沉化,离心清洗三次,得到cdse/zns氯仿溶液。取cdse/zns氯仿溶液、巯基丙酸和去离子水各1ml放入瓶中混合,强烈搅拌3h,量子点即由最初的氯仿溶液中转移进入水溶液中,抽取上层水溶液,加甲醇离心清洗三次,后分散于去1ml去离子水中既得cdse/zns量子点母液。参见图3所示，进行紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、透射电子显微镜表征。
三、共轭核酸适配体-量子点制备
将13.9μl10mmsmcc(琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)添加到125μl量子点中并在室温下放置一小时以激活量子点。在300μl1mg/ml一倍工作浓度的pbs溶液中制备5′巯基修饰的寡核苷酸，向溶液中加入6.1μl1m的二硫苏糖醇(dtt)并在室温下放置30分钟以缩减适配体。激活量子点的溶液以及缩减适配体的溶液分别通过一个nap-5脱盐柱(sephadexg-25脱盐柱)，每个溶液收集500μl。然后将量子点和缩减适体在室温下反应一个小时。将10.1μlβ-巯基乙醇(100μm的最终浓度)加入到混合物中来淬火共轭反应，并在室温下放置30分钟。反应产物使用0.5ml集中器集中(7000转，3000×g，15min)，然后添加到200柱superdex脱盐柱并用pbs进行洗脱。通过柱纯化，共收集到250μl核酸适配体-量子点。将10μl核酸适配体-量子点溶解在1ml反渗透纯净水中。运用一个uv-2100分光光度计来衡量在260nm时的吸光度。核酸适配体-量子点的实际浓度由与最初的核酸适配体浓度(1.08mg/ml)进行比较来决定。核酸适配体共轭量子点的百分比被确定为98％。
四、核酸适配体-量子点与芽孢杆菌孢子结合
参见图4至6所示，将30μl核酸适配体-量子点放置在一个试管中并用600μlpbs进行稀释。在这个典型反应中，将pbs稀释的100μl核酸适配体-量子点分别加入900μl107,106,105,104,103cfu的bt孢子中。混合物用vsm3旋涡混合器短暂的涡旋(速度8)并放置在室温下反应20min。用同样的程序进行一系列重复的反应：核酸适配体-量子点无孢子，非结合的量子点与bt孢子，核酸适配体-量子点与纯化的bt孢子结合，核酸适配体-量子点与bg孢子结合。之前收集的孢子，用pbs将13mm微孔膜过滤器(pvdf，亲水性，0.45μm)洗两次。孢子暴露于核酸适配体-量子点或非结合的量子点中的任何一个后在过滤器中收集并用1ml一倍工作浓度的pbs溶液洗涤三次。洗过的孢子在1mlpbs中收集。所有实验均一式两份。
本专利中所述的试剂来源及其组分和其配比如下：
1、试剂来源
本发明所用的主要化学试剂的特殊试剂来自下列商购渠道(省略常用试剂的渠道)：
cdo(国药集团化学试剂有限公司)；氩气(国药集团化学试剂有限公司)；cd(国药集团化学试剂有限公司)；碳二亚胺(edc)(国药集团化学试剂有限公司)；n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(上海国药集团)；；三羟甲基氨基甲烷tris(国药集团化学试剂有限公司)；氧化镉(cdo,含量99.99％)、十六烷基胺(hda,含量90％)、三辛基氧化磷(topo,含量90％)、三辛基磷(top,含量90％)、硫粉(s,99％)、巯基丙酸(mpa,98％)。
2、仪器来源
fa1004型电子天平上海良平仪器仪表有限公司
dc-2型多功能搅拌器河南省巩义市英峪予华仪器厂
evolution300型紫外-可见分光光度计thermoelectroncorporation
ls-55荧光分光光度计型荧光分光光度计美国perkinelmer公司
tem-h-70000fa透射电子显微镜日本日立公司
milli-q超纯水机美国millipore公司
g25脱盐纯化柱北京博尔西科技有限公司
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。