用于早期检测肾移植术后发生免疫排斥反应的血液中生物标记物及其用途的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种用于早期检测肾移植术后发生免疫排斥反应的血液中生物标记物及其应用。
背景技术：
：肾脏是泌尿系统一个重要的器官，主要功能是生成和排泄尿液，并以此排泄人体代谢废物，对维持机体内环境的稳定起重要作用；另外，肾脏也是一个内分泌器官，主要调节血压、红细胞生成和骨骼生长等。因此，肾脏产生疾病对人体的机能产生很大影响。肾移植作为当今公认的治疗终末期肾脏疾病最理想的方法越来越受到医院、家庭和社会的关注，但是肾移植后对移植的供体器官的排斥是一个重要的问题，因为受体的免疫系统可能会对抗供体的细胞，轻则排斥，重则引起器官衰竭，而早期干预治疗是提高肾移植存活率的最有效的时期。因此，很有必要开发一种能够早期检测、识别肾移植后排斥反应的生物标志物，用于测试来监测肾移植术后患者的身体状况，以制定个体化的治疗方案。临床常用的肾脏疾病的诊断方法包括尿液检查(蛋白尿、血尿、管型尿和白细胞尿)，肾小球滤过率测定，影像学检查和肾活检。尿液检查有的需要晨尿，有的需要24小时尿，采集均不是很方便；而肾小球滤过率的测定尚不能直接测定，临床上只能用一些合适的内源性或外源性物质的消除率来间接反应；而影像学检查会有辐射，对人体会产生影响；而肾活检会造成局部伤口，需要术后护理，每半小时监测一次血压，监测4小时。因此，寻找一种方便，无创伤的检测方法是十分必要的。而最理想的检测方法就是不需活检的血液分析。自从有报道将家用微波炉用于快速的有机合成，微波炉也变成了一种高效的非传统的方法用于糖蛋白的脱糖基化工具。然而，家用微波炉的反应条件很难控制。后来，装上真空/气体交换端口的商业化的微波系统-pico-tag工作站被用于降解蛋白质。然而，本专利介绍的cemdiscover单模微波蛋白水解仪集合了微波这种高效的能量和pico-tag工作站真空/气体交换端口两者的优点，在血样降解方面达到了更高效的效果，而这种方法还没有被报道用于血样的单糖组成分析。技术实现要素：本发明的发明目的是提供了一种用于早期检测肾移植术后发生免疫排斥反应的血液中生物标记物及其应用，本发明提供的技术方案可以用于检测肾移植术后患者或未进行肾移植人群血液降解后所得单糖的浓度。这些降解后的单糖包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖，氨基葡萄糖，氨基半乳糖和岩藻糖，可以通过单糖浓度变化，早期检测肾移植术后患者对供体肾的反应，调节免疫抑制剂的剂量，提高肾移植术后患者的存活率。为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：本发明提供了用于早期检测肾移植术后发生免疫排斥反应的血液中生物标记物，所述生物标记物为血液经过微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法得到的岩藻糖和甘露糖。进一步的：所述生物标记物岩藻糖的浓度为50.53μmol/l以下，是未进行肾移植人群岩藻糖浓度的0.77倍以下；甘露糖的浓度为1197μmol/l以下，是未进行肾移植人群甘露糖浓度的0.83倍以下。进一步的：所述生物标记物岩藻糖浓度为60.10±43.68μmol/l、甘露糖浓度为824.0±246.1μmol/l；未进行肾移植人群中岩藻糖浓度为78.48±47.09μmol/l、甘露糖浓度为986.2±402.6μmol/l。进一步的：所述的微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法包括以下具体步骤：(1)取待检测的血液或血浆样品至微波水解管，加入水，混匀后再加入hcl得到溶解液；(2)将所述溶解液使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；(3)微波酸水解后的样品用水转移到离心管中，离心浓缩除酸；(4)然后向离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留hcl；(5)将离心后的干燥样品用水溶解，离心取上清液；(6)将所述上清液用于阴离子交换色谱分析；(7)绘制岩藻糖和甘露糖的标准曲线；(8)将步骤(6)得到的色谱图与步骤(5)中的标准曲线比对并分析计算，确定岩藻糖和甘露糖的浓度。进一步的：所述步骤(1)中血液样品选用2μl。进一步的：所述步骤(1)中hcl的浓度为3mol/l。进一步的：所述步骤(2)中微波酸水解的条件为功率80w-100w，温度80℃-100℃，水解时间5min-15min。进一步的：所述微波酸水解的条件为功率100w、温度100℃、水解时间10min。进一步的：所述步骤(6)中的色谱条件为：分析柱：thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×250mm；保护柱：thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×50mm；淋洗液：0-18min18mmnaoh；流速：1.0ml/min，进样体积：10μl，柱温：30℃，检测器：电化学检测器，金电极，标准糖电位，运行时间：18min。本发明还提供了所述的生物标记物在制备用于检测肾移植术后发生免疫排斥反应的试剂中的用途，所述试剂中包括浓度为60.10±43.68μmol/l的岩藻糖和浓度为824.0±246.1μmol/l的甘露糖的标准液。与现有技术相比，本发明将微波酸水解联合阴离子交换色谱分析用于血液降解并检测单糖的技术方案应用于肾移植术后患者，其有益技术效果是：1、样品降解快速(10分钟快速完成样品处理)。2、可以批通量(一次降解多达10个20微升的样品)。3、具有兼容性(微波酸水解使用传统方法相同的酸)。4、所需要的血液用量少，每次只需小于1ml的血量。5、所需要的酸用量少(仅需10微升)。6、操作步骤简单易学(无需衍生，直接上样)。7、灵敏度高、准确性好。使用本发明的技术方案，通过检测血液中降解后单糖的浓度可以早期检测肾移植术后的免疫排斥反应的发生。附图说明图1表明酸对血清微波酸水解的影响，其中，a-0.01mg/ml混合单糖标准品、b-2mol/ltfa、c-3mol/lhcl；图2是不同浓度hcl水解患者血清离子色谱图；其中，a-0.005mg/ml混合单糖标准品、b-0mol/lhcl、c-1mol/lhcl、d-2mol/lhcl、e-3mol/lhcl、f-4mol/lhcl和g-5mol/lhcl；图3是不同浓度hcl对血清微波酸水解的峰面积柱状图；图4表明血清量对微波酸水解的影响；其中，a-0.01mg/ml混合单糖标准品、b-2μl、c-5μl和d-10μl；图5是某患者不同血清量峰面积柱状图；图6为0.0005mg/ml单糖标准品溶液及未进行肾移植人群和肾移植术后患者血液单糖组成分析阴离子交换色谱图，其中，a-0.0005mg/ml单糖标准品溶液，b-未肾移植人群，c-肾移植术后患者；图7为4种肾移植术后患者与未进行肾移植人群血液6种单糖浓度分布图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例中涉及的所有血样均由青岛市青岛大学医学院附属医院提供。实施例1一、不同酸对血清微波酸水解的影响(1)随机取10例患者血清，每例血清取2份，分别取2μl至微波水解管，加入去离子水至10μl，混匀后再加入10μl6mol/lhcl或4mol/ltfa；(2)在功率100w、温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；(3)微波酸水解后的样品用20μl去离子水转移到1.5ml离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；(4)每管加100μl甲醇，离心浓缩除残留hcl，重复三次；(5)得到的干燥样品每管用150μl去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，分析完成，用200mmol/lnaoh淋洗液冲洗柱子；从图1可以看出除血清中游离的葡萄糖外，tfa降解得到的其他单糖浓度很少。另外，tfa降解产生的杂质也较多。对10例患者血清微波水解后所得6种单糖峰面积计算均值发现，tfa整体的降解效率比hcl降解效率低，tfa对碱性糖(galn和glcn)的降解效率很低(见表1)。本发明需要对6种单糖均进行检测，所以选择3mol/lhcl。表1降解所得六种单糖峰面积二、hcl浓度对血清微波酸水解的影响(1)随机取10例患者血清，每例血清取6份，分别取2μl至微波水解管，加入去离子水至10μl，混匀后再加入10μlhcl，使其终浓度分别为0mol/l、1mol/l、2mol/l、3mol/l、4mol/l和5mol/l；(2)在功率100w、温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；(3)微波酸水解后的样品用20μl去离子水转移到1.5ml离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；(4)每管加100μl甲醇，离心浓缩除残留hcl，重复三次；(5)得到的干燥样品每管用150μl去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，分析完成，用200mmol/lnaoh淋洗液冲洗柱子；实验重复三次，对10例患者血清微波水解后所得6种单糖峰面积计算均值，以不同单糖为横坐标，以峰面积为纵坐标作柱状图(如图3所示)。从图2和图3很明显的看出，低浓度的hcl对血清降解得到单糖的效果较差。对碱性糖(galn和glcn)来说，4mol/lhcl的降解效果最好，但是会损失中性糖(fuc、gal、glc和man)，导致浓度降低，而2mol/lhcl对碱性糖的降解效率又太低。因此，选择3mol/lhcl对碱性糖降解效率不至于太低，又不会损失太多的中性糖。三、血清体积对血清微波酸水解的影响(1)随机取10例患者血清，每例取3份，分别取2、5、10μl至微波水解管，加入去离子水至10μl，混匀后再加入10μlhcl，使其终浓度为3mol/l；(2)在功率100w，温度100℃的条件下使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；(3)微波酸水解后的样品用20μl去离子水转移到1.5ml离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；(4)每管加100μl甲醇，离心浓缩除残留hcl，重复三次；(5)得到的干燥样品每管用150μl去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，分析完成，用200mmol/lnaoh淋洗液冲洗柱子；图4和图5显示，相同体积，相同浓度的酸水解条件下，虽然血清量增加，得到的单糖组分的峰面积值增加，但是10μl血清样品微波酸水解之后得到的各单糖组分的峰面积并没有比5μl多一倍，5μl血清样品得到的各单糖组分的峰面积也不是2μl血清的2.5倍，甘露糖的浓度甚至几乎没有变化。因此，本发明选择2μl血清用于单糖组分的分析。而且，从离子色谱图也可以看出，血清量越多，所含杂质越多，本发明选取的2μl血清完全可以测出6种单糖且分离度也较好。实施例2一、单糖标准曲线的绘制精密称取岩藻糖，半乳糖胺，葡萄糖胺，半乳糖，葡萄糖，甘露糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.05mg/ml，0.01mg/ml，0.005mg/ml，0.001mg/ml，0.0005mg/ml，0.0001mg/ml，0.00005mg/ml的溶液；取80μl至上样瓶，用于阴离子交换色谱分析。色谱条件如下：分析柱:thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×250mm，保护柱:thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×50mm，淋洗液：0-18min18mmnaoh；流速：1.0ml/min，进样体积：10μl，柱温：30℃，检测器：电化学检测器，金电极(p/n061875)，标准糖电位，运行时间：18min。得到6种单糖标准品的阴离子交换色谱图，见图6a。从图6a可以看出6种单糖完全分开，互不干扰。肾移植术后患者血样谱图直接对照标准品图6a，可以得知样品的单糖组成，通过对不同浓度标准品谱图积分绘制标准曲线，可计算得样品中各单糖的浓度。二、血液的微波酸水解和离子色谱检测(1)取216例未进行肾移植人群血液样品2μl至微波水解管，加入8μl去离子水，混匀后再加入10μl6mol/lhcl；(2)在功率100w、温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；(3)微波酸水解后的样品用20μl去离子水转移到1.5ml离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；(4)每管加100μl甲醇，离心浓缩除残留hcl，重复三次；(5)得到的干燥样品每管用150μl去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析；色谱条件分析柱:thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×250mm，保护柱:thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×50mm，淋洗液：0-18min18mmnaoh；流速：1.0ml/min，进样体积：10μl，柱温：30℃，检测器：电化学检测器，金电极(p/n061875)，标准糖电位，运行时间：18min。216例未进行肾移植人群血液样品的统计检测结果见图2所示。实施例3取216例肾移植术后发生免疫排斥反应的患者血液2μl，其余步骤同实施例2，统计检测结果，见图7。将图7结果总结至表1，6种单糖浓度分析结果见表2。表1.肾移植术后患者血液降解后所得6种单糖与未进行肾移植人群的相对趋势岩藻糖半乳糖胺葡萄糖胺半乳糖葡萄糖甘露糖肾移植术后↓***ns↑***ns↑**↓***注释：“ns”代表与未进行肾移植人群相比无变化，“***p<0.001”、“**p<0.01”和“*p<0.05”分别代表与未进行肾移植人群相比有不同的显著性差异，“↑”和“↓”分别代表与未进行肾移植人群相比上升或下降。表2.肾移植术后发生排斥反应患者及未进行肾移植人群血液中6种单糖浓度(μmol/l)对比结果从图6看出，6种单糖用阴离子交换色谱得到了较好的分离，具有可行性。从图7，表1，表2可以看出，肾移植术后发生排斥反应患者血液微波降解后，只有岩藻糖和甘露糖的浓度明显低于未进行肾移植的人群；可以以岩藻糖和甘露糖为生物标志物来监测肾移植术后患者是否对供体肾产生了免疫排斥反应，然后给予相应剂量的免疫抑制剂来抵制免疫排斥反应的发生。实施例4利用本发明所述的生物标记物用于检测肾移植术后是否发生免疫排斥反应的应用，具体包括以下步骤：1、取待检测的血液样品2μl至微波水解管，加入8μl去离子水，混匀后再加入10μl6mol/lhcl得到溶解液；2、将所述溶解液使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解，微波酸水解的条件为功率100w、温度100℃、水解时间10min；3、微波酸水解后的样品用20μl去离子水转移到1.5ml离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；4、然后每管加100μl甲醇，离心浓缩除残留hcl，重复三次；5、得到的干燥样品每管用150μl去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清；6、将所述上清液用于阴离子交换色谱分析；色谱条件如下：分析柱：thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×250mm；保护柱：thermoscientificdionexcarbopactmpa10,4.0mm×50mm；淋洗液：0-18min18mmnaoh；流速：1.0ml/min，进样体积：10μl，柱温：30℃，检测器：电化学检测器，金电极(p/n061875)，标准糖电位，运行时间：18min；7、绘制岩藻糖和甘露糖的标准曲线：精密称取岩藻糖和甘露糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.05mg/ml，0.01mg/ml，0.005mg/ml，0.001mg/ml，0.0005mg/ml，0.0001mg/ml，0.00005mg/ml的溶液；取80μl至上样瓶，用于阴离子交换色谱分析。色谱条件如步骤6所示；8、将步骤6得到的色谱图与步骤5中的标准曲线比对并分析计算，确定岩藻糖和甘露糖的浓度。如果待测血液样品中的岩藻糖浓度为60.10±43.68μmol/l、甘露糖浓度为824.0±246.1μmol/l，则判定待测血液样品为肾移植术后发生免疫排斥反应的患者。以上结果均表明：该方法降解快速(10分钟快速完成样品处理)；批通量(一次降解多达10个20微升的样品)处理；兼容性(微波酸水解使用传统方法相同的酸)；血液用量少，每次只需小于1ml的血量；酸用量少(仅需10微升)；操作步骤简单易学(无需衍生，直接上样)；灵敏度高、准确性好；检测血液中降解后所得6种单糖的浓度早期检测肾移植术后患者是否发生免疫排斥反应，适合临床上用于肾移植术后患者血液检测。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页12