柳兰萃取物用于提升基因表现量的用途的制作方法

本发明是关于柳兰萃取物的用途，尤其是一种柳兰萃取物用于提升转谷氨酰胺酶(transglutaminase，tgm)基因、角蛋白(keratin，krt)基因、水通道蛋白(aquaporin，aqp)基因及聚角蛋白微丝(filaggrin，flg)基因表现量的医药组合物的用途。

背景技术：

表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。

表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，并使得皮肤表皮层屏障受损，而让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红且会使皮肤保水能力下降，因此角质层的健康对于皮肤保湿以及抵御外来伤害着实非常重要。

综合上面所述，为了改善因角质细胞受损导致皮肤变得脆弱、易敏，以及皮肤保水能力下降的问题，开发一种能有效维持角质细胞排列、维持角质层结构完整以及使角质细胞分泌更多保湿因子，以提升皮肤屏障以及保湿功能的医药组成物，着实有其必要性。

技术实现要素：

缘此，本发明的一目的在提供一种柳兰萃取物用于制备提升转谷氨酰胺酶(transglutaminase，tgm)基因、角蛋白(keratin，krt)基因、水通道蛋白(aquaporin，aqp)基因及聚角蛋白微丝(filaggrin，flg)基因表现量的医药组合物的用途。

本发明的又一目的在提供一种柳兰萃取物用于制备提升角质细胞中水通道蛋白的蛋白质表现的医药组合物的用途。

本发明的又一目的在提供一种柳兰萃取物用于制备促进角质细胞分泌玻尿酸的医药组合物的用途。

本发明的另一目的在提供一种柳兰萃取物用于制备舒缓皮肤敏感、泛红的医药组合物的用途。

本发明的柳兰萃取物是以一溶剂萃取一柳兰所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，该溶剂与该柳兰的液固比为5～20∶1～5，且该萃取步骤是在50℃～100℃进行。

在本发明的一实施例中，该转谷氨酰胺酶基因是转谷氨酰胺酶1(transglutaminase1，tgm1)基因；该角蛋白基因包含角蛋白1(keratin1，krt1)基因、角蛋白10(keratin10，krt10)基因及角蛋白14(keratin14，krt14)基因；该水通道蛋白是水通道蛋白3(aquaporin3，aqp3)。

在本发明的一实施例中，该医药组合物会维持角质细胞的排列，使皮肤角质层结构完整。

同时，本发明用于提升tgm、krt、aqp及flg基因表现量，以及促进角质细胞分泌玻尿酸并舒缓皮肤敏感、泛红的医药组合物，亦可包含一有效量的柳兰萃取物及一医药上可接受的载体，该组合物是以粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状存在。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明实施例的柳兰萃取物于提升转谷氨酰胺酶1(transglutaminase1，tgm1)基因、角蛋白1(keratin1，krt1)基因、角蛋白10(keratin10，krt10)基因及角蛋白14(keratin14，krt14)基因表现量的直方图；

图2是本发明实施例的柳兰萃取物于提升水通道蛋白3(aquaporin3，aqp3)基因表现量的直方图；

图3是本发明实施例的柳兰萃取物于提升聚角蛋白微丝(filaggrin，flg)基因表现量的直方图；

图4是本发明实施例的柳兰萃取物于角质细胞中提升水通道蛋白的蛋白质表现的免疫荧光染色图；

图5是为本发明实施例的柳兰萃取物于促进角质细胞分泌玻尿酸的效果的直方图；

图6是为；本发明实施例的柳兰萃取物于舒缓皮肤泛红的效果的直方图。

具体实施方式

实施例1本发明的柳兰萃取物的制备方法

柳兰(epilobiumangustifolium)为柳叶菜科(onagraceae)多年生草本植物，生于海拔3100～4250米的山坡林缘、林下及河谷湿草地，茎为直立状高约1米，叶为披针形且无叶柄，边缘有细锯齿，两面被微毛，花穗长且为红紫或淡红色，花期为6～8月，是理想的夏季花卉，目前已知柳兰具有调经活血、消肿止痛、治疗月经不顺、骨折、关节扭伤的功效。

在本发明一实施例中，将柳兰整株清洗，取洗净后的柳兰整株与水的萃取溶剂以5～20∶1～5的液固比混合，在溶剂中进行萃取0.5～3小时后，加入酒精去除悬浮物质，以获得粗萃取物。萃取后冷却至室温，将该粗萃取物经由0.45～0.2微米的滤网过滤以获得滤液。最后，将该滤液于45～70℃进行减压浓缩并加入防腐剂，得到本发明的柳兰萃取物。

实施例2本发明柳兰萃取物提升角质细胞中tgm1、krt1、krt10、krt14、apq3及flg的基因表现量

本发明以人类初代皮肤角质细胞(humanprimaryepidermalkeratinocytes，hpek)进行tgm1、krt1、krt10、krt14、apq3及flg的基因分析。该人类初级皮肤角质细胞购自cellntec公司(瑞士)编号hpek-50，将该细胞培养于无血清的角质细胞培养液(keratinocyte-sfm)(gibco公司，编号为#10724-011，美国)。

将人类初代角质细胞分成两组：(1)加入本发明的柳兰萃取物的实验组以及(2)空白控制组，接着将角质细胞加入裂解液(lysisbuffer)收集成管后，使用rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)分别收集两组角质细胞内的rna，接着利用iii反转录酶(购自invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取rna为模板并以引物产生mrna反转录的相应cdna产物，接着利用abisteponeplus^tmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国)以及kapasybrfast(购自sigma公司，美国，编号38220000000)将两组反转录后产物分别以表一的组合引物进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)试验，定量tgm1基因、krt1基因、krt10基因、krt14基因、apq3基因及flg基因的mrna表现量，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环，其中定量数值是取由阈值循环数(ct)，而目标基因的mrna相对量是推导自方程式2^-△ct，其中△ct＝ct目标基因-cttbp(tata结合蛋白，tataboxbindingprotein)，再利用excel软件进行非成对单尾studentt-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物

本发明的柳兰萃取物对于提升角质细胞中tgm1、krt1、krt10、krt14、apq3及flg的基因表现的效果的实验结果如图1、图2及图3所示，先前研究指出转谷氨酰胺酶(transglutaminase1，tgm)会使角质化细胞的细胞膜与结构蛋白间形成强力键结，并能增加表皮层的强度与稳定性；角蛋白(keratin，krt)会形成角蛋微丝，而聚角蛋白微丝(filaggrin，flg)会帮助角蛋白微丝组装成坚固的网络，为皮肤提供强度和弹性；水通道蛋白(aquaporin，aqp)则会加角质细胞内水的通透性，以提高角质细胞的含水量。角质细胞经柳兰萃取物处理后，相较于空白控制组，tgm1基因表现量提升约1.8倍、krt1基因表现量提升约2.4倍、krt10基因表现量提升约2倍、krt14基因表现量提升约2.3倍、apq3基因表现量提升约4.3倍，以及flg基因表现量提升约1.6倍，此结果显示本发明的柳兰萃取物具有优异的提升tgm、krt、apq及flg基因表现量的能力，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，亦能有效提升皮肤屏障功能亦能使皮肤形成更多保湿因子。

实施例3本发明的柳兰萃取物提升角质细胞中水通道蛋白的蛋白质表现量

本发明进一步检测角质细胞中水通道蛋白的表现情形，藉由检测水通道蛋白的蛋白质表现，以得知本发明的柳兰萃取物提升角质细胞含水量的情形。首先，将2x10³个人类初代角质细胞培养在盖玻片上(该盖玻片置于6孔培养盘中)，并于37℃培养16至18小时，其中将人类初代角质细胞分成两组：(1)加入本发明的柳兰萃取物的实验组以及(2)空白控制组，接着以免疫荧光染色分析(immunofluorescenceassay)以及共轭焦影像显微镜(laserscanningconfocalmicroscopy)观察初代角质细胞中水通道蛋白的蛋白质表现情形。将盖玻片上的角质细胞以300μl的4％仲甲醛(paraformaldehyde)于室温下固定15分钟，并以500μl磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline，pbs)冲洗三次，再以300μl含0.5％tritonx-100的磷酸盐缓冲溶液将细胞于室温下穿孔(penetrate)十分钟后移除，接着加入300μl的阻断溶液(含1％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)的磷酸盐缓冲溶液)于室温下作用1小时，以降低后续实验中杂质与抗体的非专一性结合，并以500μl磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，接着加入200μl的以阻断溶液配制的apq3多株捕捉抗体(polyclonalanti-aqp3antibody，购自bosterimmunoleader，美国，编号pa1488)溶液，于37℃下作用2小时，并以500μl磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，接着加入200μl的以阻断溶液配制的alexafluor-488偶联的抗鼠二级抗体(购自thermo，美国，编号a11032)溶液，于37℃下作用1小时，并以500μl磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，接着加入200μl的20000倍稀释后的赫斯特(hoechst33342，购自thermo，美国，编号62249)将细胞于室温下使核染色3～5分钟，并以500μl磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，接着将盖玻片固定于一载玻片上，并在共轭焦雷射扫描显微镜(zeisslsm700)下进行观察。

本发明的柳兰萃取物对于提升水通道蛋白的蛋白质于角质细胞中表现量的实验结果如图4所示，经过柳兰萃取物处理后，相较于空白控制组，水通道到蛋白3的蛋白质的表现量明显提升。此结果显示本发明的柳兰萃取物具有优异的提升角质细胞中水通道蛋白的蛋白质表现量，并能有效提升角质细胞的含水量以及形成更多保湿因子，具有效提升角质层结构完整的能力。

实施例4本发明的柳兰萃取物促进角质细胞分泌玻尿酸的效果

进一步测试本发明的柳兰萃取物对促进角质细胞分泌玻尿酸的效果，由于已知角质细胞会分泌玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层屏障的完整，及防止皮肤水分散失及形成完整防护，因此。首先于96孔培养盘中，每孔加入200μl的上述培养液并植入1x10⁴个角质细胞，并于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成三组：(1)加入0.0625mg/ml或(2)0.03125mg/ml本发明的柳兰萃取物以及(3)空白控制组，于37℃培养24小时，时间到后在不扰动贴附细胞的情况下，每孔收集120μl的培养液。

接着利用玻尿酸(humanhyaluronicacid，ha又称人类透明质酸)的elisa分析检测试剂套组(购自cusabiobiotech公司，中国，编号csb-e04805h)进行分析。首先于在底部覆盖一层人类透明质酸捕捉抗体的96孔培养盘中，加入100μl的各孔收集的培养液，或溶于含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液的标准品，于37℃下与捕捉抗体进行结合2小时，时间到后将液体移除，并直接于每孔中加入100μl的侦测抗体，于37℃下侦测捕捉抗体1小时后，以200μl的清洗溶液(含0.05％聚氧乙烯无水山梨醇单月桂酸酯(tween20)的磷酸盐缓冲溶液)冲洗96孔培养盘中每个孔洞共三次，再加入100μl的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(streptavidin-hrp)于37℃下作用1小时，与侦测抗体进行结合，接着以200μl的清洗溶液冲洗96孔培养盘中每个孔洞共三次，并加入90μl的呈色溶液，于37℃下作用15～30分钟并且避光，再加入50μl的终止溶液以中止反应，最后以酵素免疫分析仪测量其5分钟内于450nm的吸光值。再以excel软件进行studentt-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。

本发明的柳兰萃取物对促进角质细胞分泌玻尿酸的效果的实验结果如图5所示，经过柳兰萃取物处理后，角质细胞分泌的玻尿酸量显著增加，相较于空白控制组的玻尿酸分泌量，以0.0625mg/ml柳兰萃取物处理的组别增加9.6％，而以0.03125mg/ml柳兰萃取物处理的组别增加23.8％，此结果显示本发明的柳兰萃取物具有优异的促进角质细胞分泌玻尿酸的能力，能有效使皮肤角质层结构完整并提升皮肤屏障功能，并使皮肤保水力提升。

实施例5本发明的柳兰萃取物舒缓皮肤敏感、泛红的效果

为证实本发明的柳兰萃取物于舒缓皮肤泛红的效果，首先，制备添加1％柳兰萃取物的1％柳兰精华液；以及不合柳兰萃取物的精华液作为对照组精华液，其中该精华液成分皆为水、馨鲜酮、己二醇、1，3-丁二醇、三仙胶、增稠剂以及三乙醇胺。接着，募集8位受试者，每位受试者于每日早晚清洗完脸部后，将控制组精华液、含本发明的柳兰萃取物精华液分别使用于左右半脸的肌肤，并以指腹稍加按摩促进吸收，于使用前与使用后4周以visia肌肤检测仪(cis-visia.7visiacomplexionanalysissystem，canfieldscientific，美国，序号v71214)进行皮肤泛红的肤质检测。

本发明的柳兰萃取物对舒缓皮肤泛红的效果的实验结果如图6所示，使用含本发明的柳兰萃取物的精华液后，比使用对照组舒缓皮肤泛红7％(第零周91.5％，第四周84.5％)，此结果显示本发明的柳兰萃取物能有效舒缓皮肤泛红，具有提升皮肤屏障以及保湿能力的效果。

综上所述，本发明以水、醇类、或醇水混合物为溶剂所萃取得的柳兰萃取物，能有效提升角质细胞中保湿相关基因表现量、提升水通道蛋白的蛋白质于角质细胞中表现量、促进角质细胞分泌玻尿酸的效果并能有效舒缓皮肤敏感、泛红，以维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能以及使皮肤形成更多保湿因子。因此，本发明的柳兰萃取物可用于制备柳兰萃取物用于提升转谷氨酰胺酶基因、角蛋白基因、水通道蛋白基因及聚角蛋白微丝基因表现量的医药组合物的用途，该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。