一种益生菌组合物及其在改善睡眠紊乱中的应用的制作方法

本申请涉及益生菌技术领域，特别涉及一种益生菌组合物在改善睡眠紊乱中的应用。

背景技术：

睡眠取决于人体内睡眠-觉醒平衡和生物周期节律的复杂相互作用。这些节律表达很大程度上受位于下丘脑前部的下丘脑视交叉上核调控，通过环境线索如光照、活动、饮食等调控成每天近24小时节律。调控这种生物节律分子机制的生物钟基因通过自动调整的反馈环路调节进行调节。bmal1和clock基因作为环路的关键基因，形成一个异二聚体调节钟控基因的表达，因此驱动下丘脑视交叉上核生物节律的输出。bmal1/clock复合物亦可以激活period(per)和cryptochrome(cry)基因的表达，而产物pers和crys是负反馈环路的关键基因，可以抑制bmal1/clock复合物的表达。在另外的一个稳定环路中，rev-erbα和孤儿受体基因通过主环路调整节律性表达。和其他的pers蛋白不同，per2可以直接和rev-erbα相互作用，调节bmal1的表达。

下丘脑视交叉上核通过神经和激素的机制传递生物节律到外周组织，使全身保持一致的生物节律。由于体内节律输出是由下丘脑视交叉上核产生的，所以像褪黑激素和皮质醇等内分泌参数可以用来标记体内中枢生物钟。有研究发现，在精神分裂症患者，内生的生物节律改变可以用褪黑激素、皮质醇激素等来标记。尽管研究者关于相对于睡眠紊乱来说褪黑激素的节律表达不同，但是其研究均表明在精神分裂症患者中睡眠-觉醒周期节律和褪黑激素节律表达存在明显的不一致性。但是，对于颅脑损伤患者睡眠紊乱是否与中枢生物节律存在联系及详细分子机制目前尚无研究。

目前对于外伤所致睡眠紊乱及情绪变化的机制了解甚少，对于如何有效的处理相关问题缺乏有效的办法。但是，越来越多的颅脑损伤患者睡眠紊乱的出现，而且，颅脑外伤所致睡眠紊乱的形式与其他类型的睡眠紊乱存在明显差异。

技术实现要素：

本申请的目的在于提供一种益生菌组合物在改善睡眠紊乱中的应用，以解决目前缺乏有效改善颅脑损伤患者睡眠紊乱的问题。

第一方面，根据本申请的实施例，提供了一种益生菌组合物，包括：乳酸杆菌，奥里杆菌和罗氏菌属。

进一步地，所述乳酸杆菌，所述奥里杆菌和所述罗氏菌属的质量比为1：(1-1.3)：(1.2-1.5)。

第二方面，根据本申请的实施例，提供益生菌组合物在改善睡眠紊乱中的应用。

第三方面，根据本申请的实施例，提供益生菌组合物在改善颅脑损伤患者睡眠紊乱中的应用。

由以上技术方案可知，本申请实施例提供一种益生菌组合物，包括乳酸杆菌，奥里杆菌和罗氏菌属。本申请可以通过给予益生菌组合物，调节肠道菌群以调节颅脑外伤患者睡眠紊乱，明确肠道菌群在调节脑控制的功能和行为方面的意义，为通过肠道微生态调节防治睡眠紊乱提供一些理论依据，用于指导临床颅脑创伤后睡眠紊乱防治。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请示出的技术路线图。

具体实施方式

对于颅脑创伤患者，在治疗过程中，胃肠功能紊乱发生率很高。胃肠道功能不仅受大脑调控，亦可反作用于大脑，脑-肠轴是两者相互作用的桥梁。脑-肠轴是大脑与胃肠道相互作用的双向调节轴，其包括中枢神经系统(cns)，自主神经系统(ans)，肠道内神经系统(ens)，hpa轴等结构，各部分功能相互协调。胃肠道是机体内唯一由cns，ans，ens共同支配的器官，即有感觉功能，也有运动功能，被称为“情绪的反应器”。

健康人体肠道内存在着多种正常的微生物群落，他们与宿主存在着共生关系，共同维护着宿主的生理平衡。正常情况下，成人肠道内定殖着约10¹⁴个微生物，平均每个人肠道中定殖的细菌总数佑计约有1000种。因此，这些定植于肠道的微生物与肠道之间的互动使其参与了脑肠轴的功能反应。近几年来，肠道菌群在脑肠轴中所扮演的角色逐渐被认识并成为研究热点；并且，一个涉及了中枢神经系统，神经内分泌和神经免疫系统，自主神经系统中的交感神经和副交感神经，肠神经系统和肠道微生物的全新概念，脑-肠-微生物轴被提出。现有的研究表明大脑和肠道菌群的作用也是双向的。

肠道微生态作为调节肠道功能重要的调节器，现在亦被研究表明参与机体节律性表达。有研究表明肠道微生物信号在维持机体肠道内在功能和宿主生物节律方面具有关键性作用。

肠道菌群在功能上是多种多样的，参与机体碳水化合物新陈代谢、纤维组织退化、免疫系统的维持等。肠道微生物成分的改变和行为和认知方面的改变具有一定的联系，一个健康的肠道微生物菌群对于维持健康的脑-肠-微生物轴是必不可少的。在调节脑-肠轴稳定的潜在因素中，微生物的代谢产物可能是重要的媒介。

综上所述，本申请拟明确颅脑外伤患者睡眠紊乱和生物节律表达是否存在关系，以及生物节律表达紊乱与肠道紊乱的关系；进一步明确是否可以通过调节肠道菌群以调节颅脑外伤患者睡眠紊乱，以明确肠道菌群在调节脑控制的功能和行为方面的意义，同时可以进一步加大临床应用。为通过肠道微生态调节防治睡眠紊乱提供一些理论依据，最终用于指导临床颅脑创伤后睡眠紊乱防治。

本申请做了以下实验：

1.病人选择

拟选取30例患者，10例颅脑损伤后睡眠紊乱者，10例颅脑损伤后睡眠正常者，10例正常人作为对照组。患者性别不限，年龄不限。患者均为外伤后1月-3个月。

1.1病人入组标准

1.1.1轻型颅脑损伤患者意识丧失<30分钟，和(或)短暂逆行性遗忘<24小时，gcs评分在13-15分。

1.1.2运动相关颅脑损伤致脑震荡伴有精神状态改变的。

1.1.3中型颅脑损伤患者gcs评分不大于12分，逆行性遗忘超过24小时。

1.1.4颅脑ct提示marshalct分级为ⅰ/ⅱ级。

1.1.5入选研究对象在釆样前两月内均未服用(或使用)抗生素或者微生态调节剂。

1.1.6同意签署知情同意书

1.2排除标准：

1.2.1符合颅脑损伤患者，无睡眠紊乱存在。

1.2.2重型颅脑损伤患者。

1.2.3不同意签署知情同意书者

2.诊断标准：

对符合入组患者应用匹茨堡睡眠质量指数量表(pittsburghsleepqualityindex,psqi)进行初步评测。

对符合入组患者进行多导睡眠检测(polysomnography,psg)

3.具体实验内容(参见图1)：

第一部分

通过检测8点、12点、16点、20点等不同时间点颅脑损伤后睡眠紊乱者、颅脑损伤后睡眠正常者、正常人群生物钟基因表达的变化，以了解颅脑损伤后睡眠紊乱患者分子生物钟是否发生改变及生物节律的变化规律。

通过rt-pcr检测颅脑损伤后睡眠紊乱者、颅脑损伤后睡眠正常者与正常对照人群生物种基因clock，per2，bmal1mrna在脱落口腔黏膜细胞中不同时间点表达差别。

通过western-blot检测颅脑损伤后睡眠紊乱者、颅脑损伤后睡眠正常者与正常对照人群生物种基因clock，per2，bmal1蛋白口腔黏膜细胞中不同时间点表达差别。

通过检测单核细胞生物钟基因表达的区别。

通过检测颅脑损伤后睡眠紊乱者、颅脑损伤后睡眠正常者与正常对照人群静脉血中生物种基因clock，per2，bmal1mrna表达是否存在差别。

第二部分

我们釆用全组基因测序初步分析颅脑损伤后睡眠紊乱者、颅脑损伤后睡眠正常者与正常人群肠道微生物菌群的多样性。

通过对粪便菌群特点分析睡眠紊乱患者肠道微生态构成及分布丰度

通过对优势菌群表达蛋白的分析，利用生物学软件进一步了解优势菌群蛋白与生物钟基因clock，per2，bmal1表达相关性。

第三部分

根据患者粪便高通量测序分析结果，给予颅脑损伤后睡眠紊乱患者口服益生菌，观察患者睡眠变化，再次高通量复测粪便内菌群结构变化。

4.实验结果：

生物钟基因clock、bmal1和per2mrna在口腔黏膜细胞和单核细胞中表达均在12：00，呈现高峰期，并且在睡眠紊乱组三种基因表达节律性消失，睡眠正常组三种基因存在节律性表达。颅脑损伤患者睡眠紊乱组口腔黏膜细胞和单核细胞中clockmrna的表达水平较睡眠正常组表达明显降低，差异具有统计学意义(p＝0.0003，口腔黏膜细胞；p<0.0001，单核细胞)。在睡眠紊乱组和睡眠正常组中，bmal1mrna不管是口腔黏膜细胞还是单核细胞中表达无明显区别，统计学统计无统计学差异(p＝0.1187，口腔黏膜细胞；p＝0.2094，单核细胞)。在睡眠紊乱组和睡眠正常组中per2mrna表达不管是口腔黏膜细胞还是单核细胞中在12:00、18:00存在明显降低，差异有统计学意义(12:00时p＝0.0102，口腔黏膜细胞；p＝0.0006，单核细胞；在18:00时p＝0.0004，口腔黏膜细胞；p＝0.0015，单核细胞)。但是在24:00时两组患者在口腔黏膜细胞和单核细胞中per2mrna表达无明显区别，差别无统计学意义(p＝0.7838，口腔黏膜细胞；p＝0.2808，单核细胞)。

如表1所示，根据颅脑损伤后睡眠紊乱患者与睡眠正常患者肠道菌群分析，筛选出肠道菌群13种，其中颅脑损伤睡眠紊乱与睡眠正常组相比，乳酸杆菌(lactobacillus)、奥里杆菌(oribacterium)、罗氏菌属(rothia)、放线菌(actinomyces)、链形植物属(streptophyta)、tm7-3菌、沙雷氏菌(serratia)等数量出现不同程度减少，odoribacter和嗜胆菌属(bilophila)增加。

表1

5.结论

颅脑损伤患者睡眠紊乱组生物钟基因per2、bmal1、clock均存在异常表达，且节律性消失，这些发现表明颅脑损伤合并睡眠紊乱患者分子生物钟受到破坏，对于我们进一步了解睡眠紊乱后生物节律紊乱的相关研究有重要意义。

颅脑损伤患者睡眠紊乱与肠道内菌群紊乱有关，可能由于有益菌的减少，出现干扰生物节律的有害菌。

基于以上实验结果及分析，本申请提供了一种益生菌组合物，包括：乳酸杆菌，奥里杆菌和罗氏菌属。

进一步地，所述乳酸杆菌，所述奥里杆菌和所述罗氏菌属的质量比为1：(1-1.3)：(1.2-1.5)。

具体地，根据睡眠紊乱患者肠道菌群紊乱程度确定乳酸杆菌，奥里杆菌和罗氏菌属的具体比例和用量。根据肠道菌群16sdna肠道菌群分析，发现复合菌群分析结果明显优于单一肠道菌群分析结果。

本申请实施例提供益生菌组合物在改善睡眠紊乱中的应用。

本申请实施例提供益生菌组合物在改善颅脑损伤患者睡眠紊乱中的应用。

由以上技术方案可知，本申请实施例提供一种益生菌组合物，包括乳酸杆菌，奥里杆菌和罗氏菌属。本申请可以通过给予益生菌组合物，调节肠道菌群以调节颅脑外伤患者睡眠紊乱，明确肠道菌群在调节脑控制的功能和行为方面的意义，为通过肠道微生态调节防治睡眠紊乱提供一些理论依据，用于指导临床颅脑创伤后睡眠紊乱防治。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。