本发明属于啤酒技术领域，尤其涉及一种啤酒中酒花苦味酸氧化物葎草灵酮和希鲁酮的检测方法。
背景技术
苦感是啤酒区别于其它酒种最重要的风味特征之一。啤酒的苦味物质来源复杂，主要是来自于酒花的苦味酸(α-酸和β-酸)、以及苦味酸的氧化和异构化产物。通常情况下，最受酿酒师们关注的是酒花α-酸在麦汁煮沸过程的异构化产物——异α-酸，因其苦感强度和含量较高，成为普通lager啤酒中最重要的苦味物质；另外，异α-酸的还原制品(二氢、四氢和六氢异α-酸)也具有不同的苦感强度和苦味特性，可用于发酵后期的苦感修饰，成为成品啤酒中苦味物质的有力补充。
随着国外高酒花添加量的啤酒(如ipa等)不断进入中国市场，其酒花添加工艺和添加量都与国内普遍的淡爽型lager啤酒存在明显区别，由此带来的苦味物质的分布差异也逐渐引起国内酿酒师的关注，其中最主要的就是苦味酸的氧化物——葎草灵酮(α-酸氧化物)和希鲁酮(β-酸氧化物)。这类氧化物是除了异α-酸以外，含量较高的苦味物质，其含量在ipa啤酒中可达几个-几十个mg/l；且有文献报道，葎草灵酮和希鲁酮的苦感强度分别可达到异α-酸的66％和84％。
对于啤酒中葎草灵酮和希鲁酮的检测，国外文献报道中是通过将酒花浸膏中的α-酸和β-酸进行提纯，分别获得含量较高的α-酸和β-酸的浸膏，然后通过强氧化剂(如过氧化氢异丙苯)进行氧化，后经提纯后得到纯度较高的葎草灵酮和希鲁酮，作为液相色谱(hplc)分析的参考标准品。啤酒样品经过液液萃取等方式富集后，利用hplc进行定性定量。该方法得到葎草灵酮和希鲁酮纯度高，有利于后续对样品中待测组分的定性和定量；但缺点是首先要对酒花原料进行提纯，且使用强氧化剂，试验条件要求高，操作步骤繁琐，普通实验室难以实现，且无商业化产品，因此，目前国内在此方面尚未开展相关研究。
技术实现要素：
本发明提出一种啤酒中酒花苦味酸氧化物葎草灵酮和希鲁酮的检测方法，无需对酒花原料中的α-酸和β-酸进行预提纯，无需采用强氧化剂进行氧化以及后续的氧化物提纯，方法操作简单，重现性强，可满足日常对大量样品的检测需求。
为了达到上述目的，本发明提供了一种啤酒中葎草灵酮和希鲁酮的检测方法，包括以下步骤：
葎草灵酮和希鲁酮参考标样的制备：
将酒花颗粒粉碎后置于50℃-70℃烘箱中高温空气氧化2-4天，得到参考标样；
葎草灵酮和希鲁酮参考标样的定性：
将参考标样用乙醇浸提，利用hplc进行分析，采集每个色谱峰从200-400nm的紫外吸收光谱，通过对比已定性的葎草灵酮和希鲁酮的紫外吸收光谱定性分析参考标样中的葎草灵酮和希鲁酮；
啤酒样品前处理：
将啤酒样品充分脱气后，将脱气啤酒过spe-c18小柱进行吸附，使用不同淋洗液依次淋洗和洗脱，洗脱液经0.22μm滤膜过滤即可；
啤酒样品中葎草灵酮和希鲁酮的检测：
利用hplc对啤酒样品进行分析，将啤酒样品中与葎草灵酮和希鲁酮参考标样中经定性分析的峰匹配进行定性分析，同时采用与葎草灵酮结构相似、分子量接近的异α-酸进行相对定量分析，计算得到啤酒中葎草灵酮和希鲁酮的含量。
作为优选，hplc分析条件为：流动相:a为0.05％磷酸水溶液，经过滤后超声脱气；b为乙腈，高纯氦脱气；色谱柱：alltimac18150mm×4.6mmi.d.，柱温：30℃，检测波长：270nm，进样量：10μl；
梯度洗脱程序如下：
作为优选，参考标样中的葎草灵酮由三个色谱峰组成，希鲁酮由两个色谱峰组成。
作为优选，将脱气啤酒过spe-c18小柱进行吸附，使用不同淋洗液依次淋洗和洗脱，具体包括：先分别用乙腈和纯水对spe-c18小柱进行活化，将脱气啤酒经过spe-c18小柱吸附待测组分，然后依次用a液和b液淋洗去除杂质，最后用c液洗脱spe-c18小柱上的待测组分,其中，a液为0.05％磷酸水溶液，b液为体积比70：30的乙腈：磷酸水溶液，c液为体积比90：10乙腈：磷酸水溶液。作为优选，葎草灵酮和希鲁酮的最小检出限分别为0.03mg/l。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供的方法在制备葎草灵酮和希鲁酮的参考标样时，无需对酒花原料中的α-酸和β-酸进行预提纯，无需采用强氧化剂进行氧化以及后续的氧化物提纯。本方法仅采用容易获得的酒花颗粒进行简单的高温空气氧化，即可获得氧化产物，经过hplc分离后，通过紫外光谱定性其中的葎草灵酮和希鲁酮，并以此作为下一步对啤酒样品进行hplc分析时的定性参考标样，同时借助异α-酸进行相对定量即可实现。
本方法通过对比两种不同类型spe前处理柱的浓缩富集效果，确定了一种可同时富集葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的样品前处理方法。该方法操作简单，重新性强，满足日常对大量样品的检测需求。除啤酒以外，还适用于麦汁、发酵液等液体样品的检测。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的酒花氧化物乙醇浸提液中葎草灵酮在270nm下的hplc色谱图；
图2为本发明实施例所提供的酒花氧化物乙醇浸提液中葎草灵酮在200-400nm下的三个组分的紫外吸收光谱；
图3为本发明实施例所提供的酒花氧化物乙醇浸提液中希鲁酮在330nm下的hplc色谱图；
图4为本发明实施例所提供的酒花氧化物乙醇浸提液中希鲁酮在200-400nm下的两个组分的紫外吸收光谱；
图5为本发明实施例所提供的啤酒样品中酒花酸氧化物经c18spe柱的解析曲线图；
图6为本发明实施例所提供的啤酒样品中酒花酸氧化物经pepspe柱的解析曲线图；
图7为本发明实施例所提供的啤酒样品中酒花酸氧化物分别经c18spe柱和pepspe柱洗脱的效果比较图，其中，上图为c18spe柱洗脱效果图，下图为pepspe柱洗脱效果图；
图8为本发明实施例所提供的啤酒样品中葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的hplc完整谱图；
图9为本发明实施例所提供的啤酒样品中葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的hplc局部放大谱图，其中，葎草灵酮的吸收峰由l1+l2+l3三个峰组成；希鲁酮的吸收峰由x1+x2两个峰组成；异α-酸的吸收峰由t1+c1+t2+c2+t3+c3六个峰组成，t为反式异α-酸，c为顺式异α-酸。
具体实施方式
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的啤酒中酒花苦味酸氧化物葎草灵酮和希鲁酮的检测方法，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1葎草灵酮和希鲁酮的参考标样的制备
将酒花颗粒(α-酸18％、β-酸5％)粉碎后置于60℃烘箱中高温空气氧化，0-4天每天取样分析，分析α-酸和β-酸的衰减，见表1。
表1α-酸和β-酸的衰减
注：每一类酒花酸都是一系列结构相似的同系物组成。
从表1可以看出，在60℃时随着氧化时间的延长，α-酸和β-酸逐渐衰减，在氧化第二天各组分的衰减都已达90％以上，因此确定酒花颗粒的氧化条件为60℃高温空气氧化2-4天。经试验证明，酒花颗粒在50-70℃温度范围内氧化所得α-酸和β-酸的衰减与已列出的60℃下α-酸和β-酸的衰减情况大体一致，变大趋势差异不大，因此，不再赘述说明。
实施例2葎草灵酮和希鲁酮的参考标样的定性
将实施例1中氧化2-4天后的酒花颗粒经过无水乙醇浸提30min后，进行hplc分析。色谱条件如下：
仪器：waters2695液相色谱仪(waters公司，美国)，waters2996二极管阵列检测器和empower数据处理软件(waters公司，美国)；
试剂：乙腈(sigma,色谱纯)，无水乙醇(分析纯，南京化学试剂)，磷酸(85％，国药集团)，异-α酸标样(64.3％，asbc)；
流动相:a用移液枪准确移取磷酸(85％)500μl至1l容量瓶中，加水定容后，0.22μm滤膜过滤后，超声脱气5分钟；b:乙腈；高纯氦脱气5分钟。
色谱柱：alltimac18(150mm×4.6mmi.d.,5μm)，柱温：30℃，检测波长：270nm，进样量：10μl，梯度洗脱程序如下：
氧化物乙醇浸提液经过alltimac18色谱柱分离后，采集每个色谱峰从200-400nm紫外吸收光谱，结合文献报道中葎草灵酮和希鲁酮的紫外吸收光谱，对浸提液中这两种氧化物进行定性分析。图1和图2分别为葎草灵酮的三个组分在270nm的hplc谱图和200-400nm的紫外光谱图。图3和图4分别为希鲁酮的两个组分在330nm的hplc谱图和200-400nm的紫外吸收光谱图。
该方法虽并未获得纯度较高的葎草灵酮和希鲁酮，但在实际样品分析时，仅以这些已定性的组分的出峰时间来对样品中的待测组分进行定性就足以判断。
实施例3啤酒样品前处理
啤酒基质复杂，其中葎草灵酮和希鲁酮的含量不高，且在仪器上的响应较低，因此需进行样品前处理，富集浓缩后上机分析。
考虑到葎草灵酮和希鲁酮的极性略强于异α-酸，选择c18柱(非极性)、pep柱(中等极性)两种spe柱进行样品前处理试验，选择适宜的洗脱溶剂比例(乙腈-水溶液，乙腈比例从0到100％递增)。实验表明，这两种spe柱都可以完全吸附葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸，但在解析时二者有所差别。
c18spe柱：乙腈40％，葎草灵酮开始析出；乙腈50％，希鲁酮和异α-酸析出；乙腈90％，葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸达到最大值。解析曲线见图5。
pepspe柱：乙腈50％，葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸析出；乙腈80％，希鲁酮达到最大；乙腈90％，葎草灵酮达到最大；乙腈100％，异α-酸达到最大值。解析曲线见图6。
在最佳解析条件下综合比较这两种spe柱的吸附效果，c18spe柱对葎草灵酮和异α-酸的解析效果明显好于pepspe柱；对希鲁酮的解析效果与pepspe柱相当，如图7所示。因此，最终确定用c18spe柱进行样品前处理。
具体步骤如下：
先分别用6ml的乙腈和纯水对spe-c18小柱进行活化，取9ml脱气啤酒过spe-c18小柱进行吸附，然后依次用3mla液和3mlb液淋洗去除杂质，最后用1.5mlc液洗脱spe-c18小柱上的待测组分,其中，a液为0.05％磷酸水溶液，b液为体积比70：30的乙腈：磷酸水溶液，c液为体积比90：10乙腈：磷酸水溶液。洗脱液经0.22μm滤膜过滤后上机检测，检测图谱如图8和图9所示，其中，图9为图8中关于待测目标的局部放大图，可知葎草灵酮的吸收峰由l1+l2+l3三个峰组成；希鲁酮的吸收峰由x1+x2两个峰组成；异α-酸的吸收峰由t1+c1+t2+c2+t3+c3六个峰组成。
实施例4方法重现性、检出限和回收率
重现性：同一啤酒进行6次的样品前处理+仪器分析，葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的峰面积的相对标准偏差rsd≤4％，重新性较好，满足实际样品检测需求。
表2方法重现性数据(n＝6)
检出限：以被测组分的三倍信噪比为最小检出限，该方法中葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的最小检出限为0.03mg/l、0.03mg/l和0.05mg/l。
回收率：由于本方法未分别获得葎草灵酮和希鲁酮的纯物质，故将参考标样浸提液(其中葎草灵酮和希鲁酮的含量已知)以及异α-酸标样加入啤酒样品中，分别计算待测物的回收率，见下表3。
表3方法回收率数据(n＝3)
注：葎草灵酮和希鲁酮含量均以异a-酸计。
实施例5不同品类啤酒中葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的检测
利用本方法检测不同品类的啤酒中葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸，了解不同品类啤酒中主要的苦味物质组成，见表4。
表4不同品类的啤酒中主要的苦味物质组成
从表4数据可以看出，lager啤酒、皮色森啤酒、小麦白啤酒和黑啤酒中，葎草灵酮和希鲁酮含量均不高(＜2mg/l)；而在ipa啤酒中，含有较高的葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸，且不同品牌的苦味物质分布差异较大，这主要是由于ipa啤酒特殊的酒花添加量和添加工艺造成的。
由上可见，本实施例所提供的方法为后续研究这些苦味物质对啤酒苦感的影响提供了强有力的技术手段。