本发明属于铵离子检测技术领域，具体涉及一种铵离子微电极及其制作方法。
背景技术
测量铵离子含量的传统方法主要有纳试剂法、滴定法、离子色谱法、光谱分析法、氨气敏电极法。其中，钠氏试剂法是根据游离的氨或nh4+等形式存在的氨氮与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物。这种络合物的色度与氨氮的含量成正比，通常可在波长410～425nm范围内测其吸光度，并计算其含量。滴定法测量铵离子是利用铵盐与甲醛进行反应，定量地生成六次甲基四铵盐和h+，然后利用naoh进行滴定。离子色谱法是利用铵离子在离子色谱仪流动相和固定相之间的离子交换达到分离离子的目的，并根据待测铵离子浓度与电导检测器的响应信号成比例换算成含量的一种方法。光谱分析法就是利用特征光谱研究物质结构或测定化学成分的方法，铵离子测定领域应用最广泛的紫外-可见吸收光谱。这种光谱是由物质吸收波长范围在200～760nm区间的电磁辐射能而产生的分子吸收光谱。氨气敏电极法是利用nh3扩散到电极表面，引起电极的ph发生变化进行测定。
上述的测试方法中，纳氏试剂法的纳氏试剂制作过程复杂，实验产物hg2+会对环境造成二次污染。滴定法测定铵离子采用指示剂指示滴定终点，这种方法不够灵敏，易受人为因素的干扰，从而导致较大的误差。尽管离子色谱法可以实现无损、无污染、快速检测，但是这种方法探测宽度不够，而且离子色谱法无法使得nh4+与na+、k+分离，因此受到na+、k+干扰较大。光谱法通常操作复杂，一些操作仪器比较昂贵。氨气敏电极法检测之间，需要加入强碱对样品进行前处理，使铵根离子转变为nh3，在处理过程中会有少量氨气逸出，导致检测误差大，重复性差。此外，上述方法对样品需求量都比较大，不能满足细胞培养行业对微量样品测试的需求，因此有必要寻求一种快速、便捷、准确、样品需求量少且无毒无污染的检测方法。
技术实现要素：
针对目前铵离子测试样品需求量过大无法满足微量样品测试需求且测试过程复杂、耗时长、易受钾离子/钠离子干扰而导致测试结果误差大、重复性差等问题，本发明提供一种铵离子微电极及其制作方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种铵离子微电极，所述铵离子微电极包括绝缘基底、叠设于所述绝缘基底一表面的内参比电极和绝缘层、含有电解质的凝胶层、铵离子敏感膜层、抗干扰层；
其中，所述绝缘层在所述绝缘基底表面环绕于所述内参比电极，且与所述内参比电极之间具有间隙，所述凝胶层填充于所述绝缘层与所述内参比电极形成的间隙中并且覆盖所述内参比电极；
所述铵离子敏感膜层层叠于所述凝胶层表面，所述抗干扰层层叠于所述铵离子敏感膜层表面。
相应地，一种铵离子微电极的制作方法，至少包括以下步骤：
步骤s01.在绝缘基底表面形成一层内参比电极，同时在所述内参比电极的四周形成围绕所述内参比电极的绝缘层，所述内参比电极与所述绝缘层具有间隙；
步骤s02.将形成含有电解质的凝胶层的原料填充于所述间隙中并且覆盖所述内参比电极，使其形成含有电解质的凝胶层；
步骤s03.将铵离子敏感膜层的原料与第一溶剂混合后，涂覆于所述含有电解质的凝胶层表面，使其形成铵离子敏感膜层；
步骤s04.将抗干扰层的原料与第二溶剂进行混合后，涂覆于所述铵离子敏感膜层表面，形成抗干扰层。
本发明的技术效果为：相对于现有技术，本发明上述提供的铵离子微电极通过以含有电解质的凝胶层代替传统电极的液体内充液，从而降低因环境变化对测试结果的影响，在铵离子敏感膜层表面叠设一层具有抗钠离子、抗钾离子干扰的抗干扰层，使得电极具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好，寿命长的特点。
本发明上述制备方法，工艺简单可行，并且获得的铵离子微电极具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好，寿命长的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明铵离子微电极俯视示意图；
图2为本发明图1所示的铵离子微电极沿f-f线的剖视示意图；
图3为本发明绝缘基底俯视示意图；
图4为本发明图3所示的绝缘基底沿a-a线的剖视示意图；
图5为本发明铵离子微电极制作过程向绝缘基底涂覆了内参比电极所获得的结构的俯视示意图；
图6为本发明图5所示的沿b-b线的剖视示意图；
图7为本发明铵离子微电极制作过程在绝缘基底表面形成绝缘层后所获得的结构的俯视示意图；
图8为图7所示的沿c-c线的剖视示意图；
图9为本发明铵离子微电极制作过程向绝缘层和内参比电极的间隙中填充了含电解质的凝胶层所获得的结构的俯视示意图；
图10为图9所示的沿d-d线的剖视示意图；
图11为本发明铵离子微电极制作过程含电解质的凝胶层表面涂覆了铵离子敏感膜层所获得的结构的俯视示意图；
图12为图11所示的沿e-e线的剖视示意图；
其中，1-绝缘基底；2-内参比电极；3-绝缘层；4-含有电解质的凝胶层；5-铵离子敏感膜层；6-抗干扰层。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
值得注意的是，在本发明中，第一溶剂、第二溶剂，主要是为了便于区分。
请参阅图1、图2的示意图，本发明提供一种铵离子微电极，包括绝缘基底1、叠设于绝缘基底1一表面的内参比电极2、叠设于该绝缘基底1前述表面的绝缘层3、填充于内参比电极2和绝缘层3形成的间隙中并且叠设于内参比电极2表面的含有电解质的凝胶层4、层叠于含有电解质的凝胶层4表面的铵离子敏感膜层5以及层叠于铵离子敏感膜层5表面的抗干扰层6。
其中，绝缘基底1采用聚氯乙烯(pvc)等具有绝缘性的材料制成。以绝缘性能的材料制成绝缘基底1，可以有效防止铵离子微电极在使用过程中内参比电极2与外界直接接触而出现漏电或者短路。
优选地，绝缘基底1的厚度为1～5mm，厚度过厚，不利于电极实现微型化。
优选地，内参比电极2为ag/agcl参比电极，以ag/agcl参比电极作为内参比电极，具有电势稳定，重现性很好且在温度变化时仍然表现出良好的稳定性。当然，内参比电极2不局限于ag/agcl参比电极，也可以采用au、pt、石墨等作为内参比电极。
进一步优选地，内参比电极2的厚度为0.05～0.15mm，在该厚度下，内参比电极2可以形成一层轻薄的电极膜层，达到最大限度的缩小了电极尺寸，从而实现微量样品的测量。如果内参比电极2的厚度增大，会使得样品需求量相应地增多。内参比电极2可以采用丝网印刷的方式实现，从而确保厚度在上述范围内。当然，也可以采用其他能够获得该厚度范围的制作方式。
通过在内参比电极2的四周形成围绕于内参比电极2的绝缘层3，可以有效地避免测量过程中溶液与内参比电极2的裸露部分相互接触而造成短路。在本发明中，绝缘层3叠设于绝缘基底1叠设有内参比电极2所在的表面上，并且绝缘层3围绕内参比电极2一周，形成圆周状的绝缘层3。另外，绝缘层3与内参比电极2之间具有间隙，相互无接壤。
优选地，所述绝缘层3的材料为聚乙烯、交联聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚烯烃、氟塑料等。
进一步优选地，绝缘层3的厚度为0.5～1.5mm，在该厚度下，绝缘层3与内参比电极2之间形成一个高度差，便于向绝缘层3和内参比电极2的间隙中填充含有电解质的凝胶层4，最终获得饱满而曲面平滑的含有电解质的凝胶层4，也能更好的保护内参比电极2不受外界干扰。
含有电解质的凝胶层4为果冻状的物质，主要以聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、明胶、海藻酸钠中的任一种与氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯化铵中的至少一种混合而成。
当含有电解质的凝胶层4的材料成分之一为聚甲基丙烯酸羟乙酯时，以甲基丙烯酸羟乙酯单体为原料，向甲基丙烯酸羟乙酯单体中添加光敏剂，并与氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯化铵中的任一种混合后，经过光催化发生聚合形成聚甲基丙烯酸羟乙酯聚合物。
本发明的含有电解质的凝胶层4填充于内参比电极2和绝缘层3形成的间隙部位，并且覆盖于内参比电极2表面，从而使得内参比电极2维持在一个稳定的环境中。
优选地，铵离子敏感膜层5采用如下的组分制成，母体材料、阳离子交换剂、增塑剂。
以形成铵离子敏感膜层5的原料质量百分含量为100％计算，母体材料、阳离子交换剂、增塑剂的含量分别为：
其中，所述母体材料为聚氨酯、聚氯乙烯中的至少一种。
所述铵离子敏感材料为2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基双[n-[5′-硝基(苯并-15-冠-5)-4′-基]氨基甲酸酯、4-叔-丁基-2,2,14,14-四乙基取代-2a,14a,二氧桥杯[4]芳烃-四乙酸四叔丁酯、n-十八烷酰基-尼罗蓝、9-(二乙胺基)-5-[(2-辛癸基)亚氨基]苯并[a]吩噁嗪、2,3-萘并-15-冠醚-5中的任一种。
所述阳离子交换剂为四苯基硼烷、四苯基硼烷中的任一种。
所述增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二癸酯、磷酸三丁酯中的任一种。
进一步优选地，铵离子敏感膜层5的厚度为0.10～1.50mm，如果铵离子敏感膜层5过厚，会导致测试时间延长，测试效率低下，而如果过薄，不利于测量的稳定性。
上述抗干扰层6为由三醋酸纤维素、二醋酸纤维素、硝酸纤维素、醋酸丁基纤维素中的任一种与聚氨酯混合而成的膜层。所述的纤维素与聚氨酯共混交联后形成特定分子间隙和官能团，限制了钠离子和钾离子在膜内的扩散速度，从而减缓了钠离子和/或钾离子朝向铵离子敏感膜层的迁移，极大地消除对铵离子测试过程中的干扰。
优选地，抗干扰层6的厚度为0.005～0.015mm，如果抗干扰层6的厚度小于0.005mm，钾离子和/或钠离子容易穿透膜层，对测试结果造成干扰，不利于提高测量准确度；而如果厚度大于0.015mm，一方面不利于实现电极的轻薄化，另一方面，会降低电极对铵离子的响应灵敏度，导致无法测量含微量铵离子的样品。
本发明所提供的铵离子微电极，一方面，通过合成含有电解质的凝胶层代替传统电极的液体内充液，采用丝网印刷技术印刷ag/agcl内参比层，从而最大限度地缩小了电极尺寸，实现微量样品的测量；另一方面，铵离子敏感膜层外表面涂覆一层具有抗钠/钾离子干扰的抗干扰层，解决了铵离子电极易受钠/钾离子干扰的问题，提高了铵离子测试的准确度，最终获得响应速度快、灵敏度高、稳定性好，寿命长的铵离子电极。
具体地，用本发明的铵离子微电极进行测量时，当样品液体同时接触铵离子电极和外参比电极时，铵离子通过抗干扰层6与铵离子敏感膜层5接触，在铵离子敏感膜层5与外参比电极之间会产生电位差，这个电位差与样品中铵离子活度成正比，符合能斯特方程原理，通过能斯特方程及测得的电位差，即可计算铵离子浓度。
相应地，在上述铵离子微电极的前提下，本发明还进一步提供铵离子微电极的制作方法。
请参阅图3～12，在一实施例中，所述铵离子微电极的制作方法至少包括以下步骤：
步骤s01.在绝缘基底表面形成一层内参比电极，同时在所述内参比电极的四周形成围绕所述内参比电极的绝缘层，所述内参比电极与所述绝缘层具有间隙；
步骤s02.将形成含有电解质的凝胶层的原料填充于所述间隙中并且覆盖所述内参比电极，使其形成含有电解质的凝胶层；
步骤s03.将铵离子敏感膜层的原料与第一溶剂混合后，涂覆于所述含有电解质的凝胶层表面，使其形成铵离子敏感膜层；
步骤s04.将抗干扰层的原料与第二溶剂进行混合后，涂覆于所述铵离子敏感膜层表面，形成抗干扰层。
下面对本发明的制作方法做进一步的详细解释。
步骤s01中，请参阅图3、图4、图5、图6，首先提供表面平整、洁净的绝缘基底1，若绝缘基底1表面不平整、不洁净，需先打磨并清洁处理。
获得平整、洁净的绝缘基底1后，以其中的一个表面为工作表面，为方便解释说明，将绝缘基底1的工作表面设定为a面，向a面上涂覆一层内参比电极层，具体可以是ag/agcl油墨，待ag/agcl油墨干燥后，形成ag/agcl内参比电极层2，得到如图3、图3所示的结构图；
在a面环绕内参比电极层2的四周，涂覆形成一层绝缘层3，并且绝缘层3与内参比电极层2之间具有间隙，得到如图5、图6所示的结构图。
步骤s02中，请参阅图7、图8。所述含有电解质的凝胶层4的制作过程为：将含有光敏剂质量浓度为1～3％的二苯甲酰二甲醚的甲基丙烯酸羟乙酯单体溶液与浓度为0.0008～0.002m的氯化钠溶液、氯化钾溶液、硝酸钠溶液、硝酸钾溶液、氯化铵溶液中的至少一种按照质量比为60～70：30～40混合后，涂覆于所述间隙和内参比电极表面，光照催化使其发生聚合反应，获得所述含有电解质的凝胶层4。
当然，也可以采用聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、明胶、海藻酸钠中的任一种与0.001m的kcl、kno3、nano3、nh4cl中的任一种混合后，直接填充于内参比电极层2和绝缘层3形成的间隙中，并使其蔓延至内参比电极层2表面上，静置凝胶。
步骤s03中，请参阅图9、图10。将原料组分如下的成分，按照质量百分含量为100％计算，称取各组分的原料，并加入适量的环己酮溶剂(作为第一溶剂)，混合均匀，得到混合溶液，将获得的混合溶液涂覆于含有电解质的凝胶层4的表面，室温下待环己酮挥发，获得铵离子敏感膜层5，具体结构如图9、10所示。
上述铵离子敏感膜层5的原材料组分如下：
其中，所述母体材料为聚氨酯、聚氯乙烯中的至少一种；
所述铵离子敏感材料为2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基双[n-[5′-硝基(苯并-15-冠-5)-4′-基]氨基甲酸酯、4-叔-丁基-2,2,14,14-四乙基取代-2a,14a,二氧桥杯[4]芳烃-四乙酸四叔丁酯、n-十八烷酰基-尼罗蓝、9-(二乙胺基)-5-[(2-辛癸基)亚氨基]苯并[a]吩噁嗪、2,3-萘并-15-冠醚-5中的任一种；
所述阳离子交换剂为四苯基硼烷、四苯基硼烷中的任一种；
所述增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二癸酯、磷酸三丁酯中的任一种。
优选地，所述第一溶剂除了环己酮之外，还可以是三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、n，n-二甲基甲酰胺等有机溶剂。
步骤s04中，请参阅图11、图12。抗干扰层6的制作方法如下：
将三醋酸纤维素、二醋酸纤维素、硝酸纤维素、醋酸丁基纤维素中的任一种与聚氨酯按照质量比为(70～80):(20～30)溶于四氢呋喃溶剂(作为第二溶剂)中，获得混合溶液，将所述混合溶液涂覆于所述含有电解质的凝胶层，经干燥处理，得到抗干扰层6。
优选地，第二溶剂除四氢呋喃外，还可以是三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、n，n-二甲基甲酰胺等有机溶剂。
经过上述步骤s01～s04的制作过程，最终获得结构如图1、图2所示的铵离子微电极。
本发明上述提供的铵离子微电极的制作方法，工艺简单可行，并且获得的铵离子微电极具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好，寿命长的特点。因此，获得的铵离子微电极适合用于细胞培养行业中微量样品测试中。当然，也可以用于其他铵离子的微量测量中。
为更有效的说明本发明的技术方案，下面通过具体实施例说明本发明的技术方案。
实施例1
一种铵离子微电极，其结构如图1、图2所示：pvc基底1、ag/agcl内参比层2、绝缘层3、含电解质的凝胶层4、铵离子敏感膜层5、抗干扰层6。
制作方法包括以下步骤：
步骤s01：如图3～6所示，使用丝网印刷机在pvc基底上印刷ag/agcl油墨，待ag/agcl油墨干燥后，获得内参比电极1，在内参比电极1周围覆盖一层具有凹槽的绝缘层2；
步骤s02：如图7～8所示，将含有2％光敏剂二苯甲酰二甲醚的甲基丙烯酸羟乙酯单体溶液与0.001m的nacl水溶液按68:32(质量比)混合，用微量移液器吸取100μl，滴涂于步骤s01绝缘层2形成的凹槽中，然后将电极放置在紫外灯下光催化聚合9分钟，形成含有电解质的凝胶层4；
步骤s03：如图9～10所示，将2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基双[n-[5′-硝基(苯并-15-冠-5)-4′-基]氨基甲酸酯、四苯基硼烷、邻苯二甲酸二丁酯、pvc粉，按照质量比为1:0.9:56:42.1，总质量为69.3mg，混合后并加入3ml环己酮中溶解，在漩涡振荡器上震荡2h混合均匀，用微量移液器吸取139μl混合溶液，滴涂于步骤s02所制得的含有电解质的凝胶层4之上，保证完全覆盖住含有电解质的凝胶层4，在室温下使环己酮过夜蒸发成铵离子敏感膜层5；
步骤s04：如图11～12所示，将聚氨酯粉与三醋酸纤维素按质量比72:28，总质量为61mg加入3.3ml四氢呋喃溶液溶解震荡混合5h，用微量移液器吸取127μl混合溶液滴涂于步骤3制得的铵离子敏感膜之上形成抗干扰层。
为了验证实施例1制作得到的铵离子微电极测试性能，将其安装至西尔曼科技电解质分析仪上，配制浓度分别为0.05g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l的铵离子样品溶液，标记为p1、p2、p3、p4、p5；同时制作对比样品，即配制浓度分别为样品0.05g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l的铵离子样品溶液，并向每个样品中添加6mmol/l的钾离子和148mmol/l的钠离子作为干扰，分别标记为d1、d2、d3、d4、d5。随后进行测试，测试结果如表1。
表1
从表1可知，本实施例1无论是实验组还是对照组，每个浓度的样品测量时间均小于25s，并且测量准确度高，钠离子和/或钾离子的干扰性小。
实施例1采用对铵离子选择性较强的2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基双[n-[5′-硝基(苯并-15-冠-5)-4′-基]氨基甲酸酯作为铵离子敏感材料，使铵离子微电极对铵离子有很强的专一性和较高的选择性，对钾离子的选择性系数小于-3.2，对钠离子的选择性系数小于-4.3，完全满足细胞培养基中，环境监测水体中铵根离子的检测；铵离子敏感材料与阳离子交换剂四苯基硼烷的配比，使电极的平衡所需时间显著缩短，从而使铵离子的检测能迅速完成，检测时间小于25秒；使用高亲脂性的邻苯二甲酸二丁酯作为增塑剂，增强了铵离子敏感材料在膜内的牢固性，减缓了铵离子敏感材料在测试样品过程中的浸出流失，从而使电极的寿命显著增长；在铵离子敏感膜层最外层涂覆了聚氨酯与三醋酸纤维素混合膜作为抗干扰层，聚氨酯与三醋酸纤维素按一定配比共混交联形成的特定分子间隙和官能团限制了钾离子和钠离子在膜内的扩散速度，从而减缓了钾离子和钠离子朝向铵离子敏感膜层的迁移，在很大程度上消除了对铵离子测试的干扰。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。