本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种快速制备硬组织切片的方法及其应用。
背景技术
硬组织(骨骼、牙齿等)疾病，尤其是骨质疏松等骨科疾病，是常见且危害严重的疾病。组织切片技术是研究病理过程的重要手段。骨等硬组织切片的传统方法一般是将硬组织进行固定、脱钙、包埋及切片，再染色观察。然而，在脱钙处理过程常常使一些重要的蛋白变性和一些重要信号丢失以至于敏感指标难以检测，从而严重影响了实验结果。此外，有一些重要指标(如钙化状况、骨形成动态参数等)必须通过硬组织切片来观察。目前最常用的硬组织切片方法为甲基丙稀酸甲脂树脂包埋法(mma方法)。该方法流程复杂、成本高、耗时长(需2-3周)，并需要特殊的硬组织切片机和特殊的钨钢刀片(价格大于15000元，且使用寿命有限)，对使用者的要求也很高。目前，国内仅有为数不多的几家单位拥有昂贵的硬组织切片机，mma方法难以在国内推广，这在一定程度上妨碍了国内的硬组织相关研究。
因此急需一种简便易学、耗时短、成本低，并且不依赖于特殊设备的硬组织切片制备方法。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种快速制备硬组织切片的方法及其应用，克服传统的常规硬组织切片方法制备流程复杂、成本高以及耗时长(需2-3周)等缺点，提供一种简便易学、价格低廉、快捷(仅需3天)的硬组织切片制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
在一方面，本发明提供了一种快速制备硬组织切片的方法，包括以下步骤：
(1)将硬组织在多聚甲醛中固定，然后在蔗糖水溶液中浸泡24-48h；
(2)使用包埋剂包埋经过步骤(1)处理的硬组织，然后进行速冻，使得包埋剂固化；
(3)将经步骤(2)处理的样本的一侧紧密地粘贴至粘附膜带上，然后在-25℃～-30℃下沿与粘附膜带的表面相平行的方向对硬组织进行切片，切片厚度为6-8μm，得到带有硬组织切片的膜带；
(4)将所述带有硬组织切片的膜带置于防脱载玻片上，所述防脱载玻片上带有紫外固化胶，所述带有硬组织切片的膜带上的硬组织切片通过所述紫外固化胶与所述防脱载玻片紧密贴合，然后用紫外光引发所述紫外固化胶聚合，去除硬组织切片表面的粘附膜带，得到所述硬组织切片。
进一步地，在步骤(1)中，硬组织为骨组织。
进一步地，硬组织为天然骨组织或组织工程骨组织。在本发明具体实施例中，硬组织为小鼠或大鼠的天然骨组织。
进一步地，硬组织为胫骨或股骨。
进一步地，在步骤(1)中，多聚甲醛的浓度为4％。
进一步地，在步骤(1)中，处理温度均为4℃。
进一步地，在步骤(1)中，硬组织在多聚甲醛中固定后，用pbs清洗后再用蔗糖水溶液浸泡。
进一步地，在步骤(1)中，硬组织在多聚甲醛中固定后，首先在10-20％(w/v)的蔗糖水溶液中浸泡6-24h，然后在体积分数为30％(w/v)的蔗糖水溶液中浸泡12-24h。蔗糖水溶液的浓度为蔗糖质量比水的体积计算后得来。
进一步地，在步骤(2)中，所述包埋剂为oct包埋剂、tbs冰冻切片包埋剂或leica公司的冷冻凝胶(cryo-gel)冰冻切片包埋剂。
进一步地，在步骤(2)中，采用液氮进行速冻。
进一步地，在步骤(3)中，采用冰冻切片机进行切片。在本发明的具体实施例中，冻切片机为莱卡(leica)公司的冰冻切片机，切片机的刀片为莱卡(leica)公司制造的819一次性窄刀片刀。
进一步地，在步骤(3)中，使用滚轮在粘附膜带表面反复滚动数次，使得经步骤(2)处理的样本的一侧紧密地粘贴至粘附膜带上。
进一步地，在步骤(4)中，防脱粘附载玻片为正电荷防脱粘附载玻片。
进一步地，在步骤(4)中，使用紫外灯发出的紫外光引发所述紫外固化胶聚合，紫外照射的时间为30-60秒。
进一步地，在步骤(4)中，紫外光的波长为312nm，紫外灯的功率为48w。
在另一方面，本发明还要求保护一种采用上述方法所制备的硬组织切片。
在又一方面，本发明还要求保护上述方法所制备的硬组织切片在组织染色中的应用。
进一步地，硬组织切片用于vonkossa染色、钙黄绿素荧光双标、免疫组化染色、碱性磷酸酶染色或抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色。
进一步地，vonkossa染色用于检测硬组织钙化状况，步骤如下：
(1)将硬组织切片于室温放置30分钟，然后用去离子水洗涤3次，每次5分钟；
(2)加入5％硝酸银，强光照射30分钟，然后弃去硝酸银溶液，加入5％硫代硫酸钠溶液放置5分钟；
(3)用核固红染液反染，封片，观察。
进一步地，钙黄绿素荧光双标用于检测骨形成动态参数，步骤如下：
(1)分别在收集骨组织前2天和7天时，给小鼠腹腔注射钙黄绿素(20mg/kg)，取骨组织并按上述方法制备硬组织切片；
(2)将硬组织切片室于温放置30分钟，然后用去离子水洗涤3次，每次5分钟；
(3)用dapi反染，封片，用荧光显微镜拍照观察；
(4)计算骨形成动态参数。
本发明在常规的冰冻切片方法基础上，结合膜带转移和紫外固化技术，提供了一种快速的硬组织切片方法，该方法简便易学、耗时短、成本低，并且不依赖于特殊设备，所制备的硬组织切片结构完整、质量高。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
(1)与传统的甲基丙稀酸甲脂(mma)常规硬组织切片方法相比，.本发明制备硬组织切片所需时间短(仅需3天)，而常规硬组织切片方法所需时间长(需2-3周时间)。
(2)本发明方法使用普通的刀片(<10元/片)和常规的冻冻切片机，所需成本低，操作简单易学；而常规硬组织切片技术需要特殊硬组织切片机和特殊的钨钢刀片(>1.5万元/片)，因而成本昂贵，操作也比较难(通常需要专人操作)。
(3)本发明制备的硬组织切片的结构完整、质量高，能够保留骨髓的完整形貌，不需脱钙，可直接用于检测硬组织钙化状况(vonkossa染色)和骨形成动态参数(荧光双标分析)，此外本方法无需经过脱水、二甲苯浸润等常规硬组织切片所需的破坏性步骤，有效地保存了蛋白抗原性和酶活性，因而还可用于免疫组化、碱性磷酸酶染色和trap染色等分析该方法本发明制备的硬组织切片可广泛应用于生物学、医学和材料学等领域的研究。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明实施例1中用紫外固化胶将骨组织切片从粘附膜带转移到载玻片上获得样本的剖面结构示意图；
图2是本发明实施例1中小鼠胫骨硬组织切片钙黄绿素荧色双标结果；
图3是本发明实施例1中小鼠胫骨硬组织切片vonkossa染色结果；
图4是本发明实施例2中大鼠股骨硬组织切片钙黄绿素荧色双标结果；
附图标记说明：
1-粘附膜带；2-硬组织；3-紫外固化胶；4-防脱载玻片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明以下实施例中，所使用的粘附膜带为莱卡(leica)公司生产的粘性膜带(目录号39475214)；冻切片机为莱卡(leica)公司的冰冻切片机；切片机刀片为莱卡(leica)公司制造的819一次性窄刀片刀；紫外固化胶为美国诺兰(norland)公司生产的63号紫外固化胶；防脱载玻片为正电荷防脱粘附载玻片。
实施例13月龄小鼠胫骨硬组织切片的制备
1.小鼠胫骨组织获取、固定、包埋和液氮速冻
(1)处死小鼠，取胫骨，剔除多余的软组织后，置于预冷的4％多聚甲醛(pfa)中，4℃保存固定过夜；
(2)取出固定后的样本，用pbs洗三次，每次5分钟，然后放入15％(w/v)的蔗糖溶液中浸泡处理1小时，接着转移到30％(w/v)的蔗糖溶液中4℃下过夜；
(3)将蔗糖浸泡过的样本放在含有oct包埋剂的包埋盒中，并且调整样本至合适方位，在需要切片的位置做上适当标记；
(4)取一直径为10cm的细胞培养皿置于含有液氮的泡沫盒中，使得培养皿浮于液氮之上预冷1分钟，注意避免液氮进入培养皿中；
(5)将上述步骤(3)中的样品置于预冷的细胞培养皿中速冻，直至oct包埋剂呈白色固体状，得到速冻的骨组织样本；
(6)将速冻的骨组织样本按如下所述步骤进行切片或暂时保存于-80℃冰箱中。
2.冰冻切片
(1)将速冻的骨组织样本用oct固定在冰冻切片机的冷冻台上，同时将冰冻切片机的箱体温度和机头温度都调节为-25℃，如果在切片过程中有断裂的现象，可以将温度降至-30℃；
(2)将包含样本的冷冻台固定在冰冻切片机的机头上并调节方向，使得样本与刀片尽量平行；
(3)用冰冻切片机切片，弃去不需要部分，待切到靠近需要制备成硬组织切片的目标区域，取出一片粘附膜带，将膜带剪成两半，将其中一半粘附膜带粘贴在样本表面。然后使用滚轮在粘附膜带的表面自上往下反复滚动数次，去除膜带和样本间的气泡，使膜带与样本粘贴更加紧密；
(4)沿与粘附膜带的表面相平行的方向对样本进行缓慢并且匀速地切片，确保切下的膜带上粘有完整的骨组织切片，切片厚度为8μm。
3.用紫外固化胶将骨组织切片从粘附膜带转移到载玻片上
(1)在防脱载玻片上滴上一滴紫外固化胶，尽量避免气泡；
(2)将上述所切下的粘有骨组织切片的膜带片置于防脱载玻片上，样本面朝下，直接与紫外固化胶接触，使得紫外固化胶慢慢的展开，并充满整个样本与防脱载玻片之间；参见图1，自上而下，依次为粘附膜带1、硬组织2、紫外固化胶3、防脱载玻片4。其中硬组织2为小鼠胫骨。
(3)将步骤(2)获得的样本置于紫外灯箱上照射，从而引起紫外固化胶聚合交联，紫外灯箱参数为：紫外波长：312nm；紫外功率：48w；电源：220v；紫外照射时间为60秒；
(4)用一尖头镊子将粘附膜带慢慢的撕下，此时样本已经从粘附膜带完全转移到载玻片上，得到小鼠胫骨硬组织切片，切片可直接用于下游实验或暂时保存于-20℃冰箱中。
对上述制备的小鼠胫骨硬组织切片进行钙黄绿素荧色双标和vonkossa染色，具体方法如下：
a、钙黄绿素荧光双标：
(1)分别在收集骨组织前2天和7天时，给小鼠腹腔注射钙黄绿素(20mg/kg)，取骨组织并按上述方法制备硬组织切片；
(2)将硬组织切片室于温放置30分钟，然后用去离子水洗涤3次，每次5分钟；
(3)用dapi反染，封片，用荧光显微镜拍照观察；结果如图2所示，图2a-d分别代表小鼠胫骨不同位置处的荧光显微照片，图中，dapi标记的细胞核呈现蓝色，钙黄绿素荧光标记的新生骨呈现绿色，结果表明本方法获得的小鼠胫骨切片具有完整的骨与骨髓结构，钙黄绿素荧光标记的新生骨清晰可见。
(4)用bioquant软件计算骨形成动态参数，结果显示骨矿化沉积率(mar)均值为1.4μm/d，骨形成率(bfr/bs)均值为1.25μm3/μm2/d，和骨矿化表面比例(ms/bs)均值为88.9％。
b、vonkossa染色：
(1)将硬组织切片于室温放置30分钟，然后用去离子水洗涤3次，每次5分钟；
(2)加入5％硝酸银，强光照射30分钟，然后弃去硝酸银溶液，加入5％硫代硫酸钠溶液放置5分钟；
(3)用核固红染液反染，封片，观察。结果如图3所示，图3a-d分别代表小鼠胫骨不同位置处的荧光显微照片，图中，核固红染液反染的细胞核呈现红色，钙化的骨组织呈现黑色，结果表明实验小鼠胫骨的矿化情况。
而采用传统的切片方法，在包埋的操作过程中，标本的固定、脱水、透明、包埋和固化均对最终切片的质量有明显的影响。程序繁琐，所需时间长，需要2-3周。成本高，需要特殊的刀片和仪器，需要专人操作。
实施例23月龄大鼠股骨硬组织切片的制备
将实施1中的小鼠换成大鼠，取其股骨，其他步骤按照实施例1进行，制备大鼠股骨硬组织切片。
按照实施例1的方法对大鼠股骨硬组织切片进行钙黄绿素荧色双标，结果如图4所示，图4a-d分别代表大鼠股骨不同位置处的荧光显微照片，图中，dapi标记的细胞核呈现蓝色，钙黄绿素荧光标记的新生骨呈现绿色，结果表明本方法获得的大鼠股骨切片具有完整的骨与骨髓结构，钙黄绿素荧光标记的新生骨清晰可见，可完全满足下游的实验分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。