基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法与流程

文档序号:15734215发布日期:2018-10-23 21:12阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法,其特征在于,具体步骤如下:

(1)氨基代谢物溶液的配制:取80种氨基代谢物,用含有一定甲酸的乙腈水溶液配制成20-600μM的标准混合溶液;

(2)氨基代谢物的衍生化反应:取混合氨基代谢物溶液,用醋酸钠配制成pH为5-7的反应缓冲液,分别加入NaBH3CN或NaBD3CN(内标),涡旋混匀后加入乙醛水溶液,25-37℃反应过夜;反应液中,氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18;然后用甲酸调节反应液pH至2-3,淬灭反应;衍生化反应完成后过滤,得到衍生化产物;

(3)生物样本预处理:生物样本为尿液、血清、唾液;对于尿液样本,加入甲醇,涡旋混匀,离心,收集上清液;对于血清样本,加入甲醇,涡旋混匀,离心,收集上清液;对于唾液样本,离心,收集上清液;取上清液,加入甲醇,涡旋混匀,再次离心,并收集此次上清液;

(4)生物样本的衍生化反应:取预处理后的生物样本,用醋酸钠配制成pH为5-7的反应缓冲液稀释,加入NaBH3CN,涡旋混匀,加入乙醛水溶液,25-37℃反应过夜,然后用甲酸调节反应液pH至2-3,淬灭反应;反应液经滤膜过滤,与稀释20-100倍后的重标标准品按一固定的体积比混合;

(5)氨基代谢物标准品的检测:将上述反应后的溶液直接进入UHPLC-MS进行测定;

(6)方法验证:建立80种氨基代谢物的标准曲线,并求得线性范围、R2、LOQ、LOD以及日间差和日内差,以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估;

(7)普适性验证:反应后的生物样本过滤后进入UHPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)进行测定。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中的衍生化反应采用化学同位素标记法:采用一对稳定同位素标记试剂NaBH3CN/NaBD3CN分别对分析物进行衍生化处理,得到重标与轻标产物,用于内标定量研究。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的生物样本中,尿液样本取自健康志愿者晨尿,血清样本取自健康志愿者,唾液样本取自健康志愿者。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(5)和步骤(7)中所述UHPLC-MS测定过程工作条件为:

a、色谱条件:使用Agilent 1290 UHPLC系统,采用ACQUITY UPLC HSS T3反相色谱柱;流动相A配置为含有0.05-0.1%甲酸的双蒸水,流动相B为含有0.05-0.1%甲酸的乙腈溶液;流速设为0.400-0.600 mL/min,进样量设为0.2-5.00 μL,柱温设为35-45℃;

b、质谱条件:使用Agilent 6495 QqQ MS系统,采用ESI离子源,干燥气温度:150-290℃,干燥器流量:10-20 L/min,雾化器压力:40-60 psi,鞘气温度:250-400℃,鞘气流量:5-12 L/min,毛细管电压:3500-4000 V,喷嘴电压:400-600 V;数据采集使用正离子、MRM模式,采样前0.5 min进废液瓶。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的测量方法,其特征在于,步骤(6)中所述方法的验证的具体过程为:

a、标准曲线的建立:采用同位素内标定量,轻标稀释5倍后按1 : 2 : 2.5 : 2 : 2 : 5 : 2 : 5 : 2的比例逐级稀释成9个浓度梯度,重标稀释100倍;将9个浓度梯度的轻标与重标等体积混合后进入UHPLC-MS/MS检测分析,浓度从高到低依次表示为mix1、mix2、mix3、mix4、mix5、mix6、mix7、mix8、mix9;以轻标与重标的峰面积之比作为纵坐标,以轻标浓度作为横坐标,每个浓度比例做三个平行,每个样重复进样两次,得到标准曲线、R2以及线性范围;

b、LOD)及LOQ分别为信噪比等于3和10时所对应的分析物柱上量;

c、选取mix2、mix5、mix7分别代表高、中、低三个浓度水平,三组平行样本,每个样本重复进样两次,一天24小时内分析三次,作为日内差评价;连续分析三天,作为日间差评价。

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