本发明属于人体氨基代谢物测量技术领域，具体涉及基于N-乙基化衍生方法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。
背景技术：
氨基类代谢物指分子中含有氨基的一类代谢物的总称。氨基代谢物除了我们所熟知的氨基酸，还包括有一些其他含氮物质(如嘌呤、嘧啶等)及一些胺类物质(如组胺、色胺、腐胺、亚精胺等)，它们参与生物体多条代谢途径并起着关键性作用。由此可见，氨基代谢物的种类及含量变化与生物体的生理及生理病理过程密切相关，高效高灵敏地定量分析这类代谢物对于疾病的诊疗、药物设计与药代动力学分析等方面具有重大意义。
由于生物基质的复杂性以及氨基代谢物较多的种类和较大的浓度动态范围，目前基于UHPLC-MS的氨基代谢物定量分析存在以下难点：第一，这类代谢物大多极性强，不适合直接用于反相柱的分离，而亲水柱色谱在峰重现性、峰形及分辨率方面较反相柱存在劣势；第二，这类代谢物离子化效率低，质谱响应弱；第三，由于基质效应的影响在相同检测条件下质谱的响应会存在波动，同位素内标虽然可解决外标定量不准确的问题，但价格昂贵且很难制备或购买。
因此，如何建立合适的可覆盖多种氨基代谢物的衍生化方案，并具备如下特征：反应条件温和；反应特异性强，无其他物质干扰或可消除干扰；探针具备多种同位素标记物，可以通过色谱质谱的技术实现准确内标定量的同时更可以增加检测通量是目前需要解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种反应条件温和、特异性强、反应原料易于淬灭的多种氨基代谢物同步定量分析方法。
本发明提供的多种氨基代谢物同步定量分析方法，是基于氨基代谢物的N-乙基化柱前衍生方法(简称“N-乙基化法”)的，然后通过UHPLC-MS/MS同时对多种(80种)人体氨基代谢物进行高灵敏的内标定量分析。本发明方法操作性强且检测灵敏度高。
本发明提供的基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，具体步骤如下：
(1)氨基代谢物溶液的配制：取80种氨基代谢物，用含有一定甲酸的乙腈水溶液配制成10-600μM的标准混合溶液；80种氨基代谢物标准混合溶液具体见表1所示；
(2)氨基代谢物的衍生化反应：取混合氨基代谢物溶液，用pH为5-7的醋酸钠缓冲溶液稀释，分别加入NaBH3CN或NaBD3CN(内标)，涡旋混匀后加入乙醛水溶液，25-37℃反应过夜。反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18，例如为1:(9—12):(18—24)；然后用甲酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应；衍生化反应完成后过滤，得到衍生化产物；
(3)生物样本预处理：生物样本为尿液、血清、唾液；对于尿液样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液。对于血清样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液。对于唾液样本，离心，收集上清液；取上清液，加入甲醇，涡旋混匀，再次离心，并收集此次上清液；
(4)生物样本的衍生化反应：取预处理后的生物样本，用pH为5-7的醋酸钠缓冲溶液稀释，加入NaBH3CN，涡旋混匀，加入乙醛水溶液，25-37℃反应过夜，然后用甲酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应；反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18，例如为1:(9—12):(18—24)。反应液经滤膜过滤，与稀释20-100倍后的重标标准品按一定的体积比混合；进入UHPLC-MS测样前于-80℃密封保存；
(5)氨基代谢物标准品的检测：将上述反应后的溶液直接进入UHPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)进行测定；
(6)方法验证：建立80种氨基代谢物的标准曲线，并求得线性范围、R2(相关系数)、LOQ(定量限)、LOD(检测限)以及日间差和日内差；以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估；
(7)普适性验证：反应后的生物样本过滤后进入UHPLC-MS进行测定。
进一步地，步骤(1)中甲酸的乙腈水溶液里甲酸的含量优先为0.5％，乙腈的含量为30％。
进一步地，步骤(2)中的衍生化反应采用化学同位素标记法：采用一对稳定同位素标记试剂NaBH3CN和NaBD3CN分别对分析物进行衍生化处理，得到重标与轻标产物，用于内标定量研究。
进一步地，步骤(2)和步骤(4)中，衍生化反应在37℃下进行；反应溶剂为pH为5的醋酸钠缓冲液，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比优先为：1:10:20。
进一步地，步骤(3)所述的生物样本中，尿液样本取自健康志愿者晨尿，血清样本取自健康志愿者，唾液样本取自健康志愿者。
进一步地，步骤(4)中所述对重标溶液优先选择稀释100倍；反应液与稀释后的重标标准品比例优先选择为1:1。
进一步地，所述步骤(5)和步骤(7)中的UHPLC-MS测定过程工作条件为：
a、色谱条件：使用Agilent 1290UHPLC系统，采用ACQUITY UPLC HSS T3反相色谱柱。流动相A配置为含有0.05-0.1％甲酸的双蒸水，流动相B为含有0.05-0.1％甲酸的乙腈溶液。流速设为0.400-0.600mL/min，进样量设为0.20-5.00μL，柱温设为35-45℃；
b、质谱条件：使用Agilent 6495QqQ MS系统，采用ESI离子源，干燥气温度：150-290℃，干燥器流量：10-20L/min，雾化器压力：40-60psi，鞘气温度：250-400℃，鞘气流量：5-12L/min，毛细管电压：3500-4000V，喷嘴电压：400-600V。数据采集使用正离子、MRM模式，采样前0.5min进废液瓶。
进一步地，所述步骤(5)和步骤(7)中UHPLC-MS测定操作中：
优先选择为:流动相A配置为含有0.1％甲酸的双蒸水，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度以流动相B百分比表示为：0.00-2.00min，1.00％；2.00-4.00min，1.00-3.80％；4.00-8.00min，3.80-22.00％；8.00-8.50min，22.00％；8.50-9.50min，22.00-60.00％；9.50-10.50min：60.00％；10.50-11.00min，60.00-80.00％；11.00-11.10，80.00-95.00％；95％到13.00min。流速设为0.500mL/min，进样量设为1.00μL，柱温设为40℃；
优先选择为：采用ESI离子源，干燥气温度：250℃，干燥器流量：12L/min，雾化器压力：50psi，鞘气温度：350℃，鞘气流量：12L/min，毛细管电压：4000V，喷嘴电压：500V。数据采集使用正离子、MRM模式，采样前0.5min进废液瓶。
进一步地，步骤(6)所述检测方法的验证具体为：
a、标准曲线的建立：采用同位素内标定量，轻标稀释5倍后按1:2:2.5:2:2:5:2:5:2的比例逐级稀释成9个浓度梯度，重标稀释100倍；将9个浓度梯度的轻标与重标等体积混合后进入UHPLC-MS/MS检测分析(浓度从高到低依次表示为mix1、mix2、mix3、mix4、mix5、mix6、mix7、mix8、mix9)。以轻标与重标的峰面积之比作为纵坐标，以轻标浓度作为横坐标，每个浓度比例做三个平行，每个样重复进样两次，得到标准曲线、R2以及线性范围；
b、检测限(LOD)及定量限(LOQ)分别为信噪比等于3和10时所对应的分析物柱上量；
c、选取mix2、mix5、mix7分别代表高、中、低三个浓度水平，三组平行样本，每个样本重复进样两次，一天24小时内分析三次，作为日内差评价；连续分析三天，作为日间差评价。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、采用氨基乙基化的方法改善氨基代谢物在反相色谱柱上的保留；
2、N,N-二乙基结构提供了电离基团提高质谱响应；
3、采用NaBH3CN/NaBD3CN作为一对稳定同位素标记试剂对分析物进行处理，可实现更为精准的同位素内标定量技术；
4、本发明方法反应条件温和、操作简便，适合于多种氨基代谢物同步定量测量。
附图说明
图1为氨基的N-乙基化反应。
图2为80种氨基代谢物的UHPLC-MS/MS色谱图。其中，(a)ALA(5：1,3-丙二胺；6：1,2-丙二胺；8：甲胺；9：乙醇胺；11：腐胺；22：乙胺；28：尸胺；48：DL-去甲变肾上腺素；61：异戊胺；63：；L-色胺酰胺)；ARA(44：4-氨基苯酚；57：3-羟基-2-氨基苯甲酸；58：3-氨基苯甲酸；67：p-对氨马尿酸；71：盐酸普鲁卡因；72：4-氨基苯甲酸).(b)N-PAA(13：2,4-二氨基丁酸；14：β-丙氨酸；19：高丝氨酸；23：L-高瓜氨酸；24：L-哌啶酸；25：L-鸟氨酸；30：γ-氨基丁酸；32：DL-3-氨基异丁酸；33：2-氨基异丁酸；36：5-氨基戊酸；40：正缬氨酸；46：正亮氨酸；60：L-犬尿氨酸；70：L-2-氨基己二酸；79：6-氨基己酸。N-PAA/MAA(1：4-羟基-L-脯氨酸；2：肌氨酸；26：5-羟赖氨酸；35：4-羟基-L-异亮氨酸；51：5-羟基-L-色氨酸；74：1-甲基-L-组氨酸).(c)PAA(31：L-赖氨酸；39：缬氨酸；47：L-酪氨酸；49：L-异亮氨酸；53：L-亮氨酸；62：DL-苯丙氨酸；66：L-色氨酸；7：L-脯氨酸；15：L-苏氨酸；17：丝氨酸；18：L-谷氨酰胺；21：L-丙氨酸；27：L-谷氨酸)；PAA/NT(3：L-组氨酸；10：甘氨酸；16：L-天冬氨酸；37：L-天冬酰胺；75：L-精氨酸).(d)NT/ALA(38：去甲肾上腺素；42：章胺；45：多巴胺；50：酪胺；54：5-羟色胺；55：组胺；56：甲氧酪胺；69：色氨；77：肾上腺素；78：脱氧肾上腺素；80：苯乙胺)；S-AA(20：DL-蛋氨酸亚砜；29：DL-蛋氨酸砜；34：S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸；41：黎豆氨酸；43：DL-乙硫氨酸；52：L-高胱氨酸；59：高半胱氨酸)；SP(64：丙氨酸-亮氨酸；65：亮氨酸-脯氨酸；68：丙氨酸-色氨酸)；AS(4：D-(+)-葡萄糖胺；12：D-(+)-半乳糖胺；73：D-甘露糖胺)。
图3为z144(B1：L-脯氨酸，B2：异戊胺)；m/z146(C1：β-丙氨酸，C2：L-丙氨酸)3相同母离子m/z的代谢物色谱图。其中，(a)m/z118(A1：肌氨酸，A2乙醇胺)；m/；m/z176(D1：L-苏氨酸，D2：高丝氨酸)；m/z187(E1：1,3-丙二胺，E2：1,2-丙二胺)；m/z192(F1：DL-乙硫氨酸，F2：高半胱氨酸)；m/z204(G1：L-谷氨酸，G2：4-羟基-L-异亮氨酸)；m/z212(H1：L-组氨酸，H2：肾上腺素)m/z222(I1：DL-蛋氨酸亚砜，I2：DL-苯丙氨酸)；m/z226(J1：去甲肾上腺素，J2：1-甲基-L-组氨酸)；m/z231(K1：L-精氨酸，K2：2,4-二氨基丁酸)；m/z238(L1：DL-蛋氨酸砜，L2：L-酪氨酸)；m/z245(M1：L-天冬酰胺，M2：L-鸟氨酸)；m/z259(N1：丙氨酸-亮氨酸，N2：L-赖氨酸)；m/z277(O1：5-羟基-L-色氨酸，O2：S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸)；(b)m/z160(P1：γ-氨基丁酸，P2：DL-3-氨基异丁酸，P3：4-羟基-L-脯氨酸，P4：2-氨基异丁酸)；m/z174(Q1：5-氨基戊酸，Q2：缬氨酸，Q3：正缬氨酸)；m/z188(R1：正亮氨酸，R2：L-异亮氨酸，R3：L-亮氨酸，R4：6-氨基己酸)；m/z194(S1：3-氨基苯甲酸，S2：4-氨基苯甲酸，S3：酪胺)；m/z210(T1：3-羟基-2-氨基苯甲酸，T2：章胺，T3：多巴胺)；m/z236(U1：D-甘露糖胺，U2：D-(+)-葡萄糖，U3：D-(+)-半乳糖胺)。
图4为人尿液中氨基代谢物的UHPLC-MS/MS色谱图。其中，2：肌氨酸；3：L-组氨酸；4：D-(+)-葡萄糖胺；5：1,3-丙二胺；6：1,2-丙二胺；7：L-脯氨酸；8：甲胺；9：乙醇胺；10：甘氨酸；11：腐胺；12：D-(+)-半乳糖胺；13：2,4-二氨基丁酸；14：β-丙氨酸；15：L-苏氨酸；16：L-天冬氨酸；17：丝氨酸；18：L-谷氨酰胺；19：高丝氨酸；20：DL-蛋氨酸亚砜；21：L-丙氨酸；22：乙胺；23：L-高瓜氨酸；24：L-哌啶酸；25：L-鸟氨酸；27：L-谷氨酸；28：尸胺；29：DL-蛋氨酸砜；30：γ-氨基丁酸；31：L-赖氨酸；32：DL-3-氨基异丁酸；33：2-氨基异丁酸；36：5-氨基戊酸；37：L-天冬酰胺；39：缬氨酸；40：正缬氨酸；44：4-氨基苯酚；45：多巴胺；47：L-酪氨酸；49：L-异亮氨酸；50：酪胺；52：L-高胱氨酸；53：L-亮氨酸；54：5-羟色胺盐酸盐；56：甲氧酪胺；57：3-羟基-2-氨基苯甲酸；59：高半胱氨酸；60：L-犬尿氨酸；61：异戊胺；62：DL-苯丙氨酸；65：亮氨酸-脯氨酸；66：L-色氨酸；69：色氨；73：D-甘露糖胺；74：1-甲基-L-组氨酸；75：L-精氨酸；80：苯乙胺。
图5为人血清样本中氨基代谢物的UHPLC-MS/MS色谱图。其中，1：4-羟基-L-脯氨酸；2：肌氨酸；3：L-组氨酸；4：D-(+)-葡萄糖胺；5：1,3-丙二胺；6：1,2-丙二胺；7：L-脯氨酸；8：甲胺；9：乙醇胺；10：甘氨酸；11：腐胺；12：D-(+)-半乳糖胺；13：2,4-二氨基丁酸；14：β-丙氨酸；15：L-苏氨酸；16：L-天冬氨酸；17：丝氨酸；18：L-谷氨酰胺；19：高丝氨酸；20：DL-蛋氨酸亚砜；21：L-丙氨酸；22：乙胺；23：L-高瓜氨酸；24：L-哌啶酸；25：L-鸟氨酸；27：L-谷氨酸；28：尸胺；29：DL-蛋氨酸砜；30：γ-氨基丁酸；31：L-赖氨酸；32：DL-3-氨基异丁酸；33：2-氨基异丁酸；36：5-氨基戊酸；39：缬氨酸；40：正缬氨酸；44：4-氨基苯酚；47：L-酪氨酸；49：L-异亮氨酸；53：L-亮氨酸；54：5-羟色胺盐酸盐；56：甲氧酪胺；59：高半胱氨酸；60：L-犬尿氨酸；61：异戊胺；62：DL-苯丙氨酸；64：丙氨酸-亮氨酸；65：亮氨酸-脯氨酸；66：L-色氨酸；71：盐酸普鲁卡因；73：D-甘露糖胺；74：1-甲基-L-组氨酸；75：L-精氨酸；79：6-氨基己酸；80：苯乙胺。
图6为人唾液样本中氨基代谢物的UHPLC-MS/MS色谱图。其中，1：4-羟基-L-脯氨酸；2：肌氨酸；3：L-组氨酸；4：D-(+)-葡萄糖胺；5：1,3-丙二胺；6：1,2-丙二胺；7：L-脯氨酸；8：甲胺；9：乙醇胺；10：甘氨酸；11：腐胺；12：D-(+)-半乳糖胺；13：2,4-二氨基丁酸；14：β-丙氨酸；15：L-苏氨酸；16：L-天冬氨酸；17：丝氨酸；18：L-谷氨酰胺；20：DL-蛋氨酸亚砜；21：L-丙氨酸；22：乙胺；23：L-高瓜氨酸；24：L-哌啶酸；25：L-鸟氨酸；27：L-谷氨酸；28：尸胺；29：DL-蛋氨酸砜；30：γ-氨基丁酸；31：L-赖氨酸；32：DL-3-氨基异丁酸；33：2-氨基异丁酸；36：5-氨基戊酸；39：缬氨酸；40：正缬氨酸；44：4-氨基苯酚；47：L-酪氨酸；49：L-异亮氨酸；53：L-亮氨酸；56：甲氧酪胺；59：高半胱氨酸；60：L-犬尿氨酸；61：异戊胺；62：DL-苯丙氨酸；64：丙氨酸-亮氨酸；65：亮氨酸-脯氨酸；66：L-色氨酸；73：D-甘露糖胺；74：1-甲基-L-组氨酸；79：6-氨基己酸；80：苯乙胺。
具体实施方式
实施例：N-乙基化衍生法对人血清、尿液、唾液所含氨基代谢物检测
一、实验材料与仪器
实验所用乙腈，甲酸，乙醛，抗坏血酸(Vc)均来自Sigma，如表1；乙酸，氰基硼氢化钠，醋酸钠，均来自阿拉丁；
80种氨基代谢物标准品来源于SigmaAldrich；
尿液样本取自健康女性晨尿；血清样本取自健康志愿者；唾液样本取自健康男性志愿者；
本实验所用仪器：Agilent 1290UHPLC系统，包括DAD检测器、自动进样器、二元梯度泵、温控单元等模块。配备的色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3C18反相色谱柱(1.8μm,2.1mm×100mm)。Agilent 6495QQQ MS。
二、液质条件
色谱条件：对于UHPLC系统，采用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1x100mm)反相色谱柱。流动相A配置为含有0.1％甲酸的双蒸水，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度以流动相B百分比表示为：0.00-2.00min，1.00％；2.00-4.00min，1.00-3.80％；4.00-8.00min，3.80-22.00％；8.00-8.50min，22.00％；8.50-9.50min，22.00-60.00％；9.50-10.50min：60.00％；10.50-11.00min，60.00-80.00％；11.00-11.10，80.00-95.00％；95％到13.00min。流速设为0.500mL/min，进样量设为1.00μL，柱温设为40℃；
质谱条件：采用ESI离子源，干燥气温度：250℃，干燥器流量：12L/min，雾化器压力：50psi，鞘气温度：350℃，鞘气流量：12L/min，毛细管电压：4000V，喷嘴电压：500V。数据采集使用正离子、MRM模式，采样前0.5min进废液瓶。
三、实验过程
标准溶液配制与柱前衍生
(1)于分析天平准确称取80种氨基代谢物，混合配置成表1所示浓度的混合溶液。所用溶剂为含有0.3％甲酸的34％乙腈水溶液；
(2)取100μL混合氨基标准品，用750μL 0.1M醋酸钠缓冲溶液(pH 5，50％乙腈，1mM抗坏血酸)稀释，分别加入50μL 2M NaBH3CN或NaBD3CN(内标)，涡旋混匀后加入100μL2M乙醛水溶液，37℃反应过夜后用甲酸调节反应液pH至2-3淬灭反应。反应液经滤膜过滤，进入UHPLC-MS测样前于-80℃密封保存。
生物样品配制与柱前衍生
(1)尿液样本取自健康女性晨尿。在100μL尿样中加入400μL甲醇，涡旋混匀，以10000rpm、4℃离心10min，收集上清液；
(2)血清样本取自健康志愿者。在40μL血清中加入160μL甲醇，涡旋混匀，以10000rpm、4℃离心10min，收集上清液；
(3)唾液样本取自健康男性志愿者。先以10000rpm、4℃离心10min，收集上清液；取40μL上清液，加入160μL甲醇，涡旋混匀，再次以10000rpm、4℃离心10min，并收集此次上清液；
(4)取10μL生物样本，用840μL 0.1M醋酸钠缓冲溶液(pH5，50％乙腈，1mM抗坏血酸)稀释，加入50μL 2M NaBH3CN，涡旋混匀，加入100μL 2M乙醛水溶液，37℃反应过夜后用甲酸调节反应液pH至2-3淬灭反应。反应液经滤膜过滤，与稀释100倍后的重标产物按1:1的体积比混合，进入LC-MS系统检测。
同位素标记:本发明采用一对稳定同位素标记试剂(2H-/1H-)分别对分析物进行衍生化处理，得到重标与轻标产物。通过对80种氨基代谢物重标(2H-)与轻标产物(1H-)的保留时间进行比对，结果显示68种代谢物的重标与轻标产物保留时间差值小于1s，9种代谢物的重标与轻标产物保留时间差值小于2s，另外3种也均小于3.5s；由此可见，该方法所采用的氘带标记试剂所带来的同位素效应并不明显，可有效用于内标定量研究。
通过UHPLC-MS/MS方法对氨基代谢物的检测
对氨基代谢物进行N-乙基化处理后，通过UHPLC-MS/MS可检测到80种氨基代谢物，其中包含21种脂肪胺、6种芳香胺、3种氨基糖、22种非蛋白氨基酸、20种神经递质、18种蛋白氨基酸、7中含硫物质、3种小肽及6种修饰氨基酸。对于22组具有相同m/z的物质(包含同分异构体)，除了L-丝氨酸与D-丝氨酸外，余下21组物质均能通过该方法得以分离并鉴别(如图2)，包括15组具有2个相同m/z的物质(如图3(a))：m/z118(肌氨酸和乙醇胺)、m/z144(L-脯氨酸和异戊胺)、m/z146(β-丙氨酸和L-丙氨酸)、m/z176(L-苏氨酸和高丝氨酸)、m/z187(1,3-丙二胺和1,2-丙二胺)、m/z192(DL-乙硫氨酸和高半胱氨酸)、m/z204(L-谷氨酸和4-羟基-L-异亮氨酸)、m/z212(H1：L-组氨酸，H2：肾上腺素)、m/z222(DL-蛋氨酸亚砜和DL-苯丙氨酸)、m/z226(去甲肾上腺素和1-甲基-L-组氨酸)、m/z231(K1：L-精氨酸，K2：2,4-二氨基丁酸)、m/z238(DL-蛋氨酸砜和L-酪氨酸)、m/z245(L-天冬酰胺和L-鸟氨酸)、m/z259(丙氨酸-亮氨酸和L-赖氨酸)、m/z277(5-羟基-L-色氨酸和S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸)，4组具有3个相同m/z的物质(如图3(b))：m/z174(5-氨基戊酸，缬氨酸和正缬氨酸)、m/z194(3-氨基苯甲酸，4-氨基苯甲酸和酪胺)、m/z210(3-羟基-2-氨基苯甲酸，章胺和多巴胺)、m/z236(D-甘露糖胺，D-(+)-葡萄糖和D-(+)-半乳糖胺)，2组具有4个相同m/z的物质(图3b)：m/z160(γ-氨基丁酸，DL-3-氨基异丁酸，4-羟基-L-脯氨酸和2-氨基异丁酸)、m/z188(正亮氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸和6-氨基己酸)。以上表明该方法可有效应用于多数同分异构体的检测。
UHPLC-MS/MS对氨基代谢物的检测方法的验证：
(1)标准曲线的建立：采用同位素内标定量，将轻标先稀释5倍后按1:2:2.5:2:2:5:2:5:2的比例逐级稀释成9个浓度梯度，将重标稀释100倍；然后将轻标与重标等体积混合后进入UHPLC-MS/MS检测分析(浓度从高到低依次表示为mix1、mix2、mix3、mix4、mix5、mix6、mix7、mix8、mix9)，以轻标与重标的峰面积之比作为纵坐标，以轻标浓度作为横坐标，每个浓度比例做三组平行，每个样重复进样两次，得到标准曲线、R2及线性范围。检测限(LOD)及定量限(LOQ)：分别为信噪比等于3和10时所对应的样本柱上量。日内差及日间差评价：选取mix2、mix5、mix7分别代表高、中、低三个浓度水平的比例，三组平行样本，每个样本重复进样两次，一天24小时内分析三次，作为日内差评价；共分析三天，作为日间差评价；
(2)建立80种氨基代谢物的标准曲线，并求得线性范围、R2、LOD、LOQ以及日间差和日内差的RSD值(如表2)，以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估；
(3)灵敏度:80种氨基代谢物的R2均大于0.99，其中75种物质的R2在0.995以上，只有4-羟基-L-脯氨酸、L-哌啶酸、4-氨基酚、D-甘露糖胺以及肾上腺素在0.990-0.995之间，表明该方法具有良好的线性关系。对于LOD，76种物质的LOD低于10fmol，2种物质的LOD在10-20fmol之间，另外两种物质在20-40fmol之间，表明该方法具有较高检测灵敏度。该方法和5-AIQC方法相比，除4-羟脯氨酸及组胺的灵敏度较低，其他物质与5-AIQC方法均有着相似或高于5-AIQC的检测灵敏度；此外，本方法操作更便捷、反应条件更温和、反应原料易于淬灭且引入同位素内标可实现内标定量，使检测结果更加精准可靠；
(4)精密度:本发明选中mix2、mix5和mix7作为高、中、低浓度代表分析了80种氨基代谢物浓度的日间差及日内差(如表3)。除了羟赖氨酸的中浓度RSD值及组胺的低浓度的日间差RSD值稍大于15％，余下分析物的RSD值均低于15％。总体来说，该方法的日间差和日内差RSD值符合要求，证明了该方法具有良好的精密度。
生物样本中的氨基代谢物检测
人尿液样本的检测
通过该方法可在人尿液中检测到56种氨基代谢物，其中包含14种脂肪胺、2种芳香胺、3种氨基糖、14种非蛋白氨基酸、14种神经递质、18种蛋白氨基酸、4中含硫物质、1种小肽及1种修饰氨基酸(结果如图4)。
人血清样本的检测
通过该方法可在人血清中检测到54种氨基代谢物，其中包含11种脂肪胺、2种芳香胺、3种氨基糖、16种非蛋白氨基酸、10种神经递质、17种蛋白氨基酸、3种含硫物质、2种小肽及3种修饰氨基酸(结果如图5)。
人唾液样本的检测
通过该方法可在人唾液中检测到50种氨基代谢物，其中包含10种脂肪胺、1种芳香胺、3种氨基糖、15种非蛋白氨基酸、8种神经递质、16种蛋白氨基酸、3种含硫物质、2种小肽及3种修饰氨基酸(结果如图6)。
表1 80种氨基代谢物的浓度信息
表2 80种氨基代谢物乙基化后的线性方程、R2、线性范围以及LOQ和LOD
注：LOD*为5-AIQC方法的检测限。
表3 80种氨基代谢物乙基化后浓度的日间差、日内差RSD值