本发明涉及药物分析领域，具体而言，本发明涉及一种阿莫西林胶囊杂质的UPLC检测方法。
背景技术：
：阿莫西林为WHO推荐作为首选的β－内酰胺类口服抗生素，杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较强的杀灭作用，在临床上广泛用于呼吸系统、泌尿系统、消化系统、耳鼻喉科、妇产科、性病、皮肤科等感染的治疗。阿莫西林作为药物使用时要求含量不低于98.5％，并对其中的杂质含量做出了严格限制。阿莫西林目前已知的主要杂质为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、L、M，来自于合成原料、拆分试剂、中间体以及降解产物(根据合成路线的不同，杂质不完全相同)，结构式如下：《中国药典(2015版)》未记载阿莫西林制剂杂质的检测方法。对阿莫西林原料杂质采用的检测方法为：检测波长254nm，流速为1.0mL/min。以0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值5.0)-乙腈(99:1)为流动相A、0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值5.0)-乙腈(80:20)为流动相B，梯度洗脱。所述洗脱程序为：先以A-B(92:8)等度洗脱至阿莫西林出峰完毕后按下表梯度洗脱：T(min)A(％)B(％)09282501004001004192855928另有文献报道对阿莫西林原料的分析检测，江竹莲等(江竹莲，张伟，刘绿叶.柱切换二维色谱除盐质谱联用鉴定阿莫西林中杂质.山东化工，2015，44(2)59-62.)在不改变阿莫西林国家药典标准方法的前提下，通过柱切换在线除盐技术使得分析条件能够兼容质谱并鉴定出阿莫西林中4种杂质，其中杂质1、杂质2推测为杂质D，杂质4推测为杂质J，但该方法无法同时分离上述12种已知杂质。李永红等(李永红，周方方，付路平，等.RP-HPLC法同时测定酶法合成阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物的含量.郑州大学学报(医学版)，2016，51(4)：455-458.)采用RP-HPLC法，以Gemini-NX-C18为固定相，V(甲醇)∶V(0.05mol/L、pH值为5.6的磷酸盐缓冲液)＝10∶90为流动相，流速1.0mL/min，检测波长230nm，进样量10μL，柱温为30℃，分离原料6-氨基青霉烷酸(6-APA)、D-对羟基苯甘氨酸甲酯(HPGM)，中间体D-对羟基苯甘氨酸(HPG)及阿莫西林，该方法为等度洗脱，也无法同时分离上述12种已知杂质。有文献(洪建文，李趣嫦，王彦蝶.HPLC法测定阿莫西林颗粒剂的含量及有关物质.广东药学院学报，2009，25(1)：42-45.)报道的分析方法为：检测波长230nm，流速为1.0mL/min，柱温30℃。以0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值5.0)-乙腈(99:1)为流动相A、0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值5.0)-乙腈(80:20)为流动相B，梯度洗脱。所述洗脱程序为：先以A-B(92:8)等度洗脱至阿莫西林出峰完毕后按下表梯度洗脱：然而，上述检测方法存在可分离得到的杂质少，部分杂质与溶剂峰未完全分开，且用时长、有机溶剂消耗量大。雷勇胜等采用UPLC-TOF-MS/MS法测定(雷勇胜，宋丽明，郝英魁，等.阿莫西林原料药中有关物质的UPLC-TOF-MS-MS鉴定.现代药物与临床，2015，30(1)：24-27.)采用UPLC-TOF-MS/MS法测定阿莫西林原料药中杂质，以乙酸铵体系为流动相；体积流量0.5mL/min；检测波长254nm；柱温30℃；进样量10μL。电喷雾电离源；正离子检测；毛细管电压3.0kV；离子源温度120℃；雾化气温度500℃；雾化气体积流量700L/h；锥孔气体积流量50L/h，发现了6个杂质，对应的是欧洲药典中的杂质D、杂质D、杂质D、杂质G、杂质E和杂质J。该法操作复杂，且仅能分离4种杂质。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种阿莫西林胶囊的UPLC检测方法，所述UPLC检测方法以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，梯度洗脱，可以同时检测阿莫西林胶囊中杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和M。在一种实施方式中，以0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(99:1)为流动相A、0.05mol/L磷酸盐缓冲液-乙腈(78:22)为流动相B，梯度洗脱。所述UPLC检测的洗脱程序为：先以流动相A-流动相B体积比为92:8等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后，按下列程序梯度洗脱：0-15min，流动相A：流动相B体积比渐变为0:100，梯度洗脱；15-18.5min，流动相A：流动相B体积比为0:100，等度洗脱；18.5-19min，流动相A：流动相B体积比渐变为92:8，梯度洗脱；19min后，流动相A：流动相B体积比为92:8等度洗脱。在一种实施方式中，所述UPLC检测方法的流动相A和流动相B中离子对缓冲液的pH为4.5-5.5。在一种实施方式中，以离子对缓冲液-乙腈(99:1)为流动相A、离子对缓冲液-乙腈(78:22)为流动相B，梯度洗脱，流速为0.1-0.6mL/min；检测波长为254nm，柱温为20-40℃，进样量1-8μL。在一种实施方式中，取阿莫西林胶囊待测品以流动相定量稀释制成供试品溶液，按照加校正因子的主成分自身对照法计算公式：杂质的含量＝F×(A供/A对)×1％，计算获得杂质的含量；其中，F为杂质的相对校正因子，A供为供试品溶液杂质的峰面积，A对为对照溶液主峰峰面积，所述相对校正因子为主成份线性回归方程的斜率和杂质的线性回归方程的斜率的比值。在本发明的色谱条件下，对于阿莫西林胶囊中用普通分析方法不能有效分离的12种杂质都可以获得有效分离，专属性好、灵敏度高，且分析时间短，节约了大量有机溶剂，减少了环境污染。具体实施方式为了使本领域
技术领域：
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例一：阿莫西林胶囊分析方法一仪器：WatersAcquityUPLC系统，色谱柱：WatersAcquityUPLCBEHC18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.5):乙腈(99:1)流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.5):乙腈(78:22)流速：0.1ml/min进样量：2μl检测波长：254nm柱温：25℃梯度洗脱：先以流动相A-流动相B体积比为92:8等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后，按下列程序梯度洗脱：0-15min，流动相A：流动相B体积比渐变为0:100，梯度洗脱；15-18.5min，流动相A：流动相B体积比为0:100，等度洗脱；18.5-19min，流动相A：流动相B体积比渐变为92:8，梯度洗脱；19min后，流动相A：流动相B体积比为92:8等度洗脱。实施例二：阿莫西林胶囊分析方法二仪器、色谱柱、检测波长、梯度洗脱同实施例一。流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.5):乙腈(99:1)流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.5):乙腈(78:22)流速：0.6ml/min进样量：4μl柱温：40℃实施例三：阿莫西林胶囊分析方法三仪器、色谱柱、检测波长、梯度洗脱同实施例一。流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0):乙腈(99:1)流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0):乙腈(78:22)流速：0.7ml/min进样量：1μl柱温：30℃实施例四：阿莫西林胶囊分析方法四仪器、色谱柱、检测波长、梯度洗脱同实施例一。流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.2):乙腈(99:1)流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.2):乙腈(78:22)流速：0.3ml/min进样量：2μl柱温：35℃实施例五：阿莫西林胶囊分析方法五仪器、色谱柱、检测波长、梯度洗脱同实施例一。流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0):乙腈(99:1)流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0):乙腈(78:22)流速：0.5ml/min进样量：8μl柱温：20℃实施例六：阿莫西林胶囊分析方法六仪器、色谱柱、流速、检测波长、进样量、柱温、梯度洗脱同实施例一。流动相A：0.005mol/L乙酸铵缓冲液(pH5.0):乙腈(99:1)流动相B：0.005mol/L乙酸铵缓冲液(pH5.0):乙腈(78:22)实施例七：阿莫西林胶囊分析方法七仪器、色谱柱、流动相、流速、进样量、柱温、梯度洗脱同实施例一。检测波长：254nm实施例八：阿莫西林胶囊分析方法八仪器、色谱柱同实施例一。流动相A：0.005mol/L乙酸铵缓冲液(pH5.0):乙腈(99:1)流动相B：0.005mol/L乙酸铵缓冲液(pH5.0):乙腈(80:20)流速：0.5ml/min检测波长：254nm进样量：10μl柱温：30℃梯度洗脱：0～3.64min，0％～60％B；3.64～12.53min，60％B；12.53～13.09min，60％～0％B；13.09～17min，0％B实施例九：阿莫西林胶囊分析方法九仪器：Aglient1260型高效液相色谱仪，色谱柱：GeminiC185μ110A4.6×250mm，流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0):乙腈(99:1)流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0):乙腈(80:20)流速：1.0ml/min，检测波长：230nm进样量：20μl柱温：25℃梯度洗脱：先以流动相A-流动相B(92:8)等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后，按下列程序梯度洗脱：0-35min，流动相A：流动相B体积比渐变为0:100，梯度洗脱；35-45min，流动相A：流动相B体积比为0:100，等度洗脱；45-46min，流动相A：流动相B体积比渐变为92:8，进行梯度洗脱；46min后，流动相A：流动相B体积比为92:8等度洗脱。表1不同方法分离效果比较实施例十：阿莫西林胶囊分析方法一的应用研究供试品溶液：取阿莫西林胶囊待测品适量(约含阿莫西林50mg)，精密称定，加流动相A使溶解，定容，摇匀，过滤。对照品溶液：取阿莫西林对照品适量，精密称定，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含20μg阿莫西林的溶液。按照上述色谱条件分别对供试品溶液和对照品溶液进行HPLC检测，然后以加校正因子的主成分自身对照法计算公式：杂质的含量＝F×(A供/A对)×1％，计算获得杂质的含量；其中，F为杂质的相对校正因子，A供为供试品溶液杂质的峰面积，A对为对照溶液主峰峰面积，所述相对校正因子为主成份线性回归方程的斜率和杂质的线性回归方程的斜率的比值。各杂质的相对保留时间以及相对校正因子见表2。表2各杂质的相对保留时间以及相对校正因子1.所述检测方法系统适应性检测取阿莫西林系统适用性对照品适量，加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含2.0mg阿莫西林的溶液，取2μl注入液相色谱仪，除保留时间不同外，记录的色谱图与标准图谱一致。2.所述检测方法专属性检测强降解试验是在高温、强酸、强碱、强氧化、强光照条件下加速对对供试品进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，比对杂质的生成量与主成份的减少量，以此来评估分析方法的有效性和适用性。同时采用DAD检测器，进行峰纯度检查：降解试验所得的图谱中，当主成份的纯度因子大于阈值时，则可判断该色谱峰不包含其他杂质峰，色谱峰纯度符合要求。本发所述检测方法专属性强。表3专属性试验结果降解条件主峰纯度因子纯度阈值物料平衡无降解98.85999.464999.00101％60℃10d98.80999.553999.0099.0％1N盐酸30min85.43999.913999.0097.8％0.1N氢氧化钠10min93.69999.002999.0098.5％3％过氧化氢10min80.21999.628999.0094.8％光照降解(UV20h)99.06999.202999.0099.4％高湿(RH75％10d)99.09999.474999.0099.4％3.所述检测方法定量限和检测限的检测采用信噪比法，取主成分和各杂质对照品，用溶剂稀释至一定浓度，进样，观察信噪比S/N，信噪比为10时对应的浓度为定量限，信噪比为3时对应的浓度为检测限。阿莫西林及各杂质定量限和检测限结果汇总见表4。表4定量限和检测限试验结果在定量限的数据中，相当于样品浓度0.05％的有关物质样品信噪比在10以上，保证样品中0.05％以上的有关物质可以定量检测；在检测限的数据中，相当于样品浓度0.02％的杂质样品信噪比在3以上，保证样品中0.02％以上的有关物质可以被检测到，证明本发明的灵敏度很高。3.所述检测方法线性及范围检测表5线性及范围试验结果由表4的结果可知，发明所述检测方法针对各杂质的线性范围均符合至少在LOQ值～指标150％的范围内的标准，且回归系数均>0.999，证明呈良好的线性关系。4.所述检测方法的重复性检测取本品，按上述检测方法重复6次检测，验证方法具有良好精密度，标准要求杂质之和绝对偏差不得超过质量标准的50％，结果见表6。表6重复性试验结果6次测定样品中均检出多个杂质峰，其中杂质D和杂质J最大，杂质之和的绝对偏差为0.17％，不超过质量标准限度的50％(2.5％)，证实该方法具有良好的精密度。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。当前第1页1 2 3