本发明涉及动物源性食品中喹诺酮类残留药物检测方法。
背景技术：
喹诺酮类药物(Quinolones)是人工合成的一类含有4-喹酮母核的化合物，是一类广谱抗生素，因其具有抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强、价格低廉等特点，喹诺酮类药物已成为兽医临床治疗及畜牧、水产养殖中最重要的抗感染药物之一，同时该类药物可促进动物日增重和提高饲料转化率，国内兽用喹诺酮类药物的使用量已接近500吨/年。但药物的滥用可导致药物残留在动物组织中，造成长期的健康影响，包括微生物的抗生素耐药性。与此同时，由于该类药物除部分被用作兽药外，尚有很多品种在人类临床治疗中使用，从而使得喹诺酮类药物相互之间的交叉耐药问题同样不容忽视。就目前看来，国内亦有金黄色葡萄球菌等致病菌对喹诺酮类药物的耐药率不断上升的报道。由于细菌对喹诺酮类药物耐药性的产生和某些喹诺酮类药物的潜在致癌作用，其残留问题已引起人们的广泛关注。因此，美国禁止在食品动物养殖中使用喹诺酮类药物，我国及世界卫生组织、欧盟、日本等国家和组织都将喹诺酮类药物列入限制使用的兽药名单中，并制订出相应的最高残留限量：根据不同动物品种、组织和药物种类，最高残留限量在10～6000μg/kg之间。但由于待检测样品巨大，样品制备环节繁琐，消耗大量的人力与物质，尽管政府部门及相关机构投入巨大进行检测与监管，但兽药的非法滥用仍无法杜绝。
目前新型样品前处理技术如固相萃取、分子印迹技术、免疫亲和技术得到的不断应用，在仪器分析方面主要是气相色谱法、高效液相色谱法及高效液相串联质谱法。但这些方法有的达不到现在的检测要求，有的整个操作步骤繁琐、耗时长，不利于大规模的定性和定量分析工作。相比较于其他方法，DPX枪头式分散固相微萃取柱净化样品，所需样品量减少，使用溶剂量减少，节约了成本和时间，高通量，效率高，降低了实验操作人员在有毒溶剂中的暴露，可以较好地去除样品中的干扰物，降低基质效应的影响。此外，利用DPX枪头式分散固相微萃取柱与手动及自动移液系统，能够快速、高效的完成样品处理及萃取可在10分钟内同时完成1-384个样品的纯化。
技术实现要素：
本发明为了解决目前没有一种有效的方法对动物源性食品中的喹诺酮类药物进行检测，尤其是定量高精度、高通量、节约型的测定的问题。
本发明为了解决上述问题采用DPX枪头式分散固相微萃取柱进行样品净化，建立一种高效液相色谱-串联质谱同时检测动物源性食品中7种喹诺酮类药物多残留的高通量、快速分析方法。该方法适用于动物源性食品中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、单诺沙星单个或多个药物残留的检测。采用该方法能建立起高通量的检测体系，在兽药残留检测等领域具有广阔的应用前景。
本发明的采用DPX枪头式分散固相微萃取柱分离动物源性食品中喹诺酮类残留药物进行LC-MS/MS检测的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、样品提取：称取试样，加入去离子水进行均质处理后，加入乙腈，涡流振荡，然后离心，收集上清液，氮气吹干，用体积百分含量为0.05～0.15％的乙酸水溶液700～800μL溶解后，得待净化液；
二、净化：先将DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃取柱依次用450～550μL甲醇，450～550μL水平衡；再将待净化液移液过柱；然后依次用700～800μL体积百分含量为2％甲酸水溶液，700～800μL甲醇洗涤柱子；最后用700～800μL的洗脱液洗脱；收集洗脱液，在55～65℃下氮气吹干，残余物用体积百分含量为0.05～0.15％甲酸-甲醇水溶液80～120μL溶解，涡旋混匀，14000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；
三、检测：将净化后的样品进行高效液相色谱-串联质谱仪测定：
其中，色谱条件如下：
色谱仪：Agilent 1260Infinity液相色谱仪；
色谱柱：C18,5μm,2.1×150mm；
流动相：A相-0.1％甲酸水溶液，B相-0.1％甲酸乙腈；
柱温：40℃；
进样量：20μL；
梯度洗脱：0～6min，77.5～85％A、15～22.5％B；6.1～7.5min，5～77.5％A、22.5～95％B；7.6～9.0min，5％A、95％B；9.1～10.0min，5～85％A、15～95％B；流速为0.3mL/min；
质谱条件如下：
质谱仪：安捷伦6460QQQ MS；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
电喷射电压：3500V；
干燥气流速：13L/min；
鞘气压力：25psi；
干燥气温度：350℃；
采集方式：多反应监测；
通过高效液相色谱-串联质谱仪检测，即完成所述的检测。
本发明的一种枪头式分散固相微萃取枪头(Dispersive pipette extraction,DPX tips)技术，在样品处理过程中枪头中松散的树脂与待测物可通过液体湍流作用最大化地结合，可使吸附与解吸附的效率更高，对待测物进行快速地纯化。该技术将提取、净化、浓缩于一个枪头中一步完成，可以同时检测多种喹诺酮类药物，并且DPX枪头式分散固相微萃取柱不仅可以与手动移液器连接使用，还可以与自动移液系统结合使用，在短时间内完成大量样品的萃取，有效缩短了样品前处理的时间。与固相萃取法相比，DPX枪头式分散固相微萃取柱所需样品量减少，使用溶剂量减少，节约了成本和时间，高通量，效率高，从而降低了实验操作人员在有毒溶剂中的暴露，尤其适用于大量样品快速筛查、检测。
本发明建立了动物源性食品中喹诺酮类药物多残留量检测的制样和高效液相色-串联质谱测定方法。该方法适用于动物源性食品中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、单诺沙星单个或多个药物残留的检测。
本发明建立了7种喹诺酮类药物残留量测定的高效液相-串联质谱方法，并结合可半自动化的DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃柱对动物源性食品中喹诺酮类药物的残留进行了检测。对于加标量为25μg/kg的样品进行了检测，回收率在58.36％～96.93％，DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃柱净化方法良好并且色谱方法稳定，表明方法能够满足喹诺酮类药物残留分析的要求。
附图说明
图1为喹诺酮类化合物的结构式图；
图2为喹诺酮类化合物的回收率与基质效应图；其中，A为基质效应，B为实施例1回收率；C为实施例2回收率；
图3为喹诺酮类药物混合标准溶液50ng/mL(50ppb)液相色谱/串联质谱质量色谱图；NOR:诺氟沙星,Norfloxacin；OFL:氧氟沙星,Ofloxacin；CIP:环丙沙星,Ciprofloxacin；LOM:洛美沙星,Lomefloxacin；DAN:单诺沙星,Danofloxacin；ENR:恩诺沙星,Enrofloxacin；SAR:沙拉沙星,Sarafloxacin。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的采用DPX枪头式分散固相微萃取柱分离动物源性食品中喹诺酮类残留药物进行LC-MS/MS检测的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、样品提取：称取试样，加入去离子水进行均质处理后，加入乙腈，涡流振荡，然后离心，收集上清液，氮气吹干，用体积百分含量为0.05～0.15％的乙酸水溶液700～800μL溶解后，得待净化液；
二、净化：先将DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃取柱依次用450～550μL甲醇，450～550μL水平衡；再将待净化液移液过柱；然后依次用700～800μL体积百分含量为2％甲酸水溶液，700～800μL甲醇洗涤柱子；最后用700～800μL的洗脱液洗脱；收集洗脱液，在55～65℃下氮气吹干，残余物用体积百分含量为0.05～0.15％甲酸-甲醇水溶液80～120μL溶解，涡旋混匀，14000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；
三、检测：将净化后的样品进行高效液相色谱-串联质谱仪测定：
其中，色谱条件如下：
色谱仪：Agilent 1260Infinity液相色谱仪；
色谱柱：C18,5μm,2.1×150mm；
流动相：A相-0.1％甲酸水溶液，B相-0.1％甲酸乙腈；
柱温：40℃；
进样量：20μL；
梯度洗脱：0～6min，77.5～85％A、15～22.5％B；6.1～7.5min，5～77.5％A、22.5～95％B；7.6～9.0min，5％A、95％B；9.1～10.0min，5～85％A、15～95％B；流速为0.3mL/min；
质谱条件如下：
质谱仪：安捷伦6460QQQ MS；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
电喷射电压：3500V；
干燥气流速：13L/min；
鞘气压力：25psi；
干燥气温度：350℃；
采集方式：多反应监测；
通过高效液相色谱-串联质谱仪检测，即完成所述的检测。
本实施方式的DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃取柱购买自无锡微色谱生物科技有限公司。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：步骤一中所述的试样与水的质量体积比为202～108mg：1μL。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：步骤一中所述的试样与乙腈的质量体积比为0.202～0.108mg：1mL。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：步骤一中所述的离心条件：13000-18000r/min离心20min。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：步骤一中所述氮气吹干是用60℃氮气进行的。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：甲酸-甲醇水溶液的甲醇：水的体积比为5：95。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：洗脱液是由氨水与甲醇按体积比为1:4的比例混合物而成的。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：用体积百分含量为0.1％的乙酸水溶液750μL溶解后，得待净化液。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：用体积百分含量为0.12％的乙酸水溶液730μL溶解后，得待净化液。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：步骤二净化操作如下：先将DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃取柱依次用500μL甲醇，500μL水平衡；再将待净化液移液过柱；然后依次用750μL体积百分含量为2％甲酸水溶液，750μL甲醇洗涤柱子；最后用750μL的洗脱液洗脱；收集洗脱液，在60℃下氮气吹干，残余物用体积百分含量为0.1％甲酸-甲醇水溶液100μL溶解，涡旋混匀，14000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
本实施例的采用DPX枪头式分散固相微萃取柱分离动物源性食品中喹诺酮类残留药物进行LC-MS/MS检测的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、样品提取
称取(0.2±0.002)g搅碎的试样于2mL离心管中，加入200μL水，加入2-3粒研磨珠，用Benchmark BeadBlaster 24组织均质仪混匀，加入1mL乙腈，用涡流振荡器振荡1-2min，最高转速13000-18000r/min离心20min，分离上清液至新的离心管中，60℃下氮气吹干，用0.1％乙酸水溶液750μL溶解，作为待净化液。
二、净化方法
先将DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃柱取柱依次用500μL甲醇，500μL水平衡；将待净化液移液过柱；然后分别用750μL 2％甲酸水溶液，750μL甲醇洗涤柱子；最后用750μLV(氨水):V(甲醇)＝1:4洗脱；洗脱液在60℃下氮气吹干，残余物用0.1％甲酸-甲醇水溶液(甲醇：水＝5：95)100μL溶解，涡旋混匀，14000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)测定。
三、检测方法
1.1色谱条件
色谱仪：Agilent 1260Infinity液相色谱仪
色谱柱：Agilent EclipsePlus C18,5μm,2.1×150mm，或类似色谱柱
流动相：A相-0.1％甲酸水溶液，B相-0.1％甲酸乙腈
柱温：40℃；进样量：20μL；梯度洗脱：见表1
1.2质谱条件
质谱仪：安捷伦6460QQQ MS
离子源：电喷雾离子源
扫描方式：正离子扫描
毛细管电压：3500V
干燥气流速：13L/min
干燥气温度：350℃
采集方式：多反应监测(MRM)
其他质谱参数见表2
表2喹诺酮类药物的质谱参数
实施例2
此实施例为对照例。此实施例在净化操作步骤采用了与实施例1不同的方法，即采用了常规的操作方法。
按照以下步骤进行的：
一、样品提取
称取(0.2±0.002)g搅碎的试样于2mL离心管中，加入200μL水，加入2-3粒研磨珠，用Benchmark BeadBlaster 24组织均质仪混匀，加入1mL乙腈，用涡流振荡器振荡1-2min，最高转速13000-18000r/min离心20min，分离上清液至新的离心管中，60℃下氮气吹干，用去离子水750μL溶解，作为待净化液。
二、净化方法
吹干的试样残渣用去离子水750μL溶解，充分混匀作为待净化液。先将DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃取柱依次用500μL甲醇，500μL水平衡；将待净化液上柱；然后依次用750μL水溶液，750μL 2％甲酸水溶液，750μL甲醇洗涤柱子；最后用新鲜配置的750μL 5％氨水甲醇溶液洗脱；洗脱液在60℃下氮气吹干，残余物用0.1％甲酸-甲醇水溶液(甲醇：水＝5：95)100μL溶解，涡旋混匀，14000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)测定。
三、检测方法
1.3色谱条件
色谱仪：Agilent 1260Infinity液相色谱仪
色谱柱：Agilent EclipsePlus C18,5μm,2.1×150mm，或类似色谱柱
流动相：A相-0.1％甲酸水溶液，B相-0.1％甲酸乙腈柱温：40℃；进样量：20μL；梯度洗脱：见表1
1.4质谱条件
质谱仪：安捷伦6460QQQ MS
离子源：电喷雾离子源
扫描方式：正离子扫描
毛细管电压：3500V
干燥气流速：13L/min
干燥气温度：350℃
采集方式：多反应监测(MRM)
其他质谱参数见表2
表2喹诺酮类药物的质谱参数
实验结果
喹诺酮类药物的结构式、pKa和LogP值如图1所示，这些化合物的结构中同时包含有氨基和羧基，属于两性分子。
当采用实施例2方法净化时，回收率为43.12％～77.27％，回收率偏低(如图2所示)。因而，对样品前处理和净化方法进行优化。在样品前处理过程中，比较使用水、5％甲酸水溶液和0.1％乙酸水溶液溶解吹干的试样残渣，结果表明用0.1％乙酸水溶液溶解时，回收率明显增加。由于溶液的酸性增强，喹诺酮化合物所带正电荷增多，有助于喹诺酮化合物与DPX固相微萃取柱中树脂的结合。在洗脱步骤中，对比了洗脱液中不同比例氨水含量对实验结果的影响。结果表明，选择20％氨水甲醇溶液作为洗脱液时，7种喹诺酮药物的回收率均最佳。当溶液的pH值大于化合物的pKa值时，化合物以分子形式存在，氨基基团上的正电荷减少，所以化合物与树脂结合的作用力减弱，使得化合物更好地从DPX固相微萃取柱洗脱下来。
为此，采用实施例1的方法处理样品，加标量为25μg/kg回收率为58.36％～96.93％，(如图2所示和表3所示)，实施例1方法能够满足喹诺酮类药物残留分析的要求。通过计算得到此方法猪肉定量限为0.5μg/kg，基质效应不显著(如图2所示)，表明DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃取柱净化效果良好，达到了萃取富集喹诺酮类药物的果效。如图3所示，所有化合物均在3到6min之间流出，7种喹诺酮类药物较好的分离开，且各物质峰形良好，保留时间稳定，并且没有明显的杂质干扰峰出现，说明样品处理方法可以有效地去除各组织样品中的干扰组分。
实施例1建立了7种喹诺酮类药物残留量测定的高效液相-串联质谱方法，并结合可半自动化的DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃柱对动物源性食品中喹诺酮类药物的残留进行了检测。对于加标量为25μg/kg的样品进行了检测，回收率在58.36％～96.93％，DPX TipsTM-CX枪头式分散固相微萃柱净化方法良好并且色谱方法稳定，表明本实施例方法能够满足喹诺酮类药物残留分析的要求。