本发明属于IgG含量测定
技术领域：
，涉及一种猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法。
背景技术：
：我国具有丰富的猪血资源，每年猪血总量约为108kg。猪血浆蛋白粉作为一种高品质蛋白质饲料原料，在其生产工艺过程中保留了原血浆中功能性免疫球蛋白(Ig一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白)的活性。而这些活性物质能显著降低免疫刺激，同时有效防止仔猪断奶后生长停滞和下痢。免疫球蛋白(Ig)依抗原性不同，可分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等。而IgG是动物血清中最重要的抗体，在体液免疫中起着“主力免疫”的作用。然而，在猪血液采集、运输及生产加工过程中，受外界环境及卫生条件的影响，会导致IgG含量的变化。因此，通过测定猪血浆蛋白粉IgG含量能有效地监控猪血浆蛋白粉质量及品质，对其采购和验收提供参考数据，同时对饲料品质安全具有重要的意义。目前，国内外测定IgG的方法有很多种，主要包括免疫胶体金法(ImmuneColloidalGoldMethod)、单向免疫扩散法(SingleRadialImmunodiffusion，SRID)、琼脂双向免疫扩散法(AgarDoubleImmunodiffusion)、酶联免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)、免疫比浊法(TurbidimetricImmunoassay)、高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)和毛细管电泳法(CapillaryElectrophoresis，CE)等。其中，GB/T21033-2007中规定了用高效液相色谱仪测定饲料中免疫球蛋白IgG含量的方法。样品通过磷酸盐缓冲溶液提取，采用Hi-TrapProteinGHP色谱柱进行分离，以磷酸缓冲盐溶液和甘氨酸缓冲盐进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为20μL，以280nm为最大吸收波长进行检测并通过外标法定量计算。HPLC法分析速度快，样品用量少，选择性好，灵敏度高，检出限低，可定量测定饲料中免疫球蛋白IgG的含量。然而，对于猪血浆蛋白粉这种粉末状样品，若采用国标中规定的方法测量IgG含量，其在匀浆过程中样品可能会因附着在匀浆机桨叶上，加之处理时间仅有5min，会导致IgG提取不完全，影响最终测定结果。技术实现要素：本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法，该方法包括以下步骤：1)取样：称取猪血浆蛋白粉，并加入至提取液中，得到待测样品；2)恒温提取：将待测样品置于恒温摇床或振荡培养箱中进行提取，经离心、过滤后，得到待测液；3)取待测液进行高效液相色谱检测。进一步地，步骤1)中，所述的提取液为磷酸钾缓冲液，该磷酸钾缓冲液的浓度为0.04-0.06mol/L，pH值为6.4-6.6。进一步地，步骤1)中，每1000mL提取液中加入1.5-2.5g猪血浆蛋白粉。国标中的料液比是1:250，浓度偏高，结果误差较大；本发明将料液比降低至1:500左右，提高了测定结果的精确度。进一步地，步骤2)中，所述的恒温摇床或振荡培养箱的温度为24-26℃，转速为150-200r/min，提取时间为25-35min。进一步地，步骤2)中，所述的离心过程中，离心机转速为7000-9000r/min，离心时间为8-12min。进一步地，步骤2)中，所述的过滤过程中，采用0.22μm滤膜对离心后的待测样品进行过滤。进一步地，步骤3)中，所述的高效液相色谱检测过程中，流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为甘氨酸盐酸缓冲液。进一步地，所述的磷酸盐缓冲液的pH值为6.4-6.6，所述的甘氨酸盐酸缓冲液的pH值为2.4-2.6。磷酸盐缓冲液用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制，甘氨酸盐酸缓冲液用甘氨酸和盐酸溶液配制。进一步地，步骤3)中，所述的高效液相色谱检测过程中，流速为0.45-0.55mL/min，进样量为10-25μL。与现有技术相比，本发明具有以下特点：1)在前处理工艺上看，本发明采用24-26℃恒温提取，可以规避因前处理过程中环境温度的变化而影响IgG提取效果的问题，确保了IgG活性；同时，提取时间设定为30min左右，有利于IgG的充分提取和均匀地分散在提取液中，避免出现样品附着在匀浆机(国标)的桨叶上及处理时间不充分而导致的提取不完全问题，与国标相比，本发明方法具有更好的提取效果，且操作便捷，线性关系好；2)从料液比上来看，本发明采用1:500左右的料液比，既能充分、均匀地提取出猪血浆蛋白粉中的IgG，又能规避国标中(料液比1:250)因待测液浓度过大而使测定结果误差较大的问题；同时，降低料液比，还能节约IgG标准品的用量，并确保待测样品浓度在IgG标准品曲线范围内，进一步提高测定结果的准确性；3)从最终测定结果上来看，本发明还能够避免超声提取破坏部分样品成分活性的可能，避免出现异常结果；4)本发明操作过程简便快捷，试验结果误差小，测得的数据稳定性好，准确性高，操作简便，更具有可靠性，适合推广应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法为：精确称量猪血浆蛋白粉约0.1000g，并加入至50mLpH＝6.5、0.05mol/L的磷酸钾缓冲液(即料液比1:500)；之后在25℃恒温摇床中以150r/min转速振摇30min进行恒温提取，再于8000r/min离心10min，后过0.22μm滤膜，得到待测液；取20μL待测液进行高效液相色谱检测。其中，高效液相色谱条件如下：(1)仪器设备：Agilent1260，配备紫外检测器，检测波长280nm；(2)色谱柱：PharmaciaHI-TrapProteinG柱，1mL；(3)流动相A：pH6.5、0.05mol/L磷酸钾缓冲液(0.05mol/L磷酸二氢钾与0.05mol/L磷酸氢二钾按体积比68.5:31.5混合均匀，并用pH计进行微调)；流动相B：pH2.5、0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液(250mL0.2mol/L甘氨酸溶液与141.5mL0.2mol/L盐酸溶液混合均匀，并用pH计进行微调)；(4)柱温：室温(夏季炎热天气，开空调保持室内温度约25℃)；(5)流速0.5mL/min；进样量20μL；梯度洗脱条件如下表所示：时间/min流速/(mL/min)流动相A/％流动相B/％00.510004.50.510005.50.5010015.00.5010017.50.5100025.00.51000注：先用超纯水0.5mL/min洗柱10min，再用流动相A0.5mL/min平衡柱20min，必要时可适当延长平衡柱时间，然后按洗脱程序进行洗脱。国标中，前处理过程用茄形瓶和匀浆机匀浆5min进行提取，但由于猪血浆蛋白粉属于粉末状样品，在匀浆过程中样品可能会附着在匀浆机桨叶上，加之处理时间仅有5min，导致IgG提取不完全，影响最终测定结果；而本实施例对前处理过程进行改进，通过恒温摇床进行恒温提取，相比而言，恒温提取结果(即IgG含量)会更可靠(对于免疫球蛋白，温度的控制有利于确保IgG活性，从而保证最终测定结果的可靠性)。另外，本方法也避免了超声提取法所存在的破坏部分样品成分活性、导致结果出现异常的问题。如上表所示，同一猪血浆蛋白粉样品，经不同的前处理后，最终测定结果会有区别：在国标的前处理方法中，可能由于部分样品附着在匀浆机桨叶上，加之处理时间仅有5min，导致IgG提取不完全，所以最终测定结果略低；采用本实施例方法不仅避免了样品附着在匀浆机桨叶上的问题，还可以规避前处理过程中环境温度的变化而影响IgG提取效果的问题，加之提取时间为30min，可实现IgG的充分提取，并规避了超声提取法中因超声(超声过程中温度会升高，IgG在高温条件下的热稳定性差，且浓度越低IgG对温度变化越敏感)破坏部分样品成分活性而引起测定结果异常的缺陷。由此表明，在猪血浆蛋白粉IgG含量测定中，采用本实施例的前处理方法(25℃恒温摇床进行30min提取)，与国标相比具有更好的提取效果。实施例2：猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定如下：1、试验所需溶剂及仪器设备1.1HPLC：Aglient1260，具紫外检测器；1.2色谱柱：PharmaciaHI-TrapProteinG柱，1mL；1.3Millipore纯水机；1.4分析天平：精确至0.0001g；1.5带塞锥形瓶：250mL；1.6移液管：50mL移液管，需定期校正；1.7恒温振荡培养箱：上海精宏HZP-150；1.8高速离心机：转速可调0～16000r/min；1.9流动相A：pH6.5±0.1，0.05mol/L磷酸钾缓冲液(68.5％0.05mol/L磷酸二氢钾与31.5％0.05mol/L磷酸氢二钾混合均匀，并用pH计进行微调)；1.10流动相B：pH2.5±0.1，0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液(250mL0.2mol/L甘氨酸溶液与141.5mL0.2mol/L盐酸溶液混合均匀，并用pH计进行微调)。1.11IgG储备标准溶液配制：称取IgG标准品(纯度≥95％)约0.0200g，用流动相A溶解并定容至25mL，摇匀，浓度约为760μg/mL。1.12IgG工作标准溶液配制(临用现配)：取IgG储备标准溶液，用流动相A稀释成含IgG152μg/mL、304μg/mL、456μg/mL、608μg/mL、760μg/mL的标准系列溶液。2、试样的选取及制备选取有代表性的试样，其原始量应在1000g以上。用四分法将原始样品缩减至500g，再用四分法缩至200g，装入密封容器，贴上标签，避光低温保存备用。3、测定试样3.1样品前处理取干燥洁净的带塞锥形瓶若干，用移液管准确加入50mL流动相A(pH6.5±0.1，0.05mol/L磷酸钾缓冲液)后，精确称量待测猪血浆蛋白粉样品约0.1000g(精确至0.0001g)，一边缓慢倾入锥形瓶，一边轻摇锥形瓶，使其均匀地分散在溶液中。然后，将锥形瓶放置于25℃恒温振荡培养箱中以转速150r/min振摇30min，取溶液10mL于离心管，以8000r/min离心10min，过0.22μm滤膜作为待测溶液，取20μL待测液进行HPLC分析。3.2测定3.2.1HPLC测定参数的设定检测波长：280nm；色谱柱：PharmaciaHI-TrapProteinG柱，1mL；进样量：20μL柱温：室温(夏季炎热天气，开空调保持室内温度约25℃)。3.2.2梯度洗脱条件梯度洗脱条件见下表所示。时间/min流速/(mL/min)流动相A/％流动相B/％00.510004.50.510005.50.5010015.00.5010017.50.5100025.00.51000注：先用超纯水0.5mL/min洗柱10min，再用流动相A0.5mL/min平衡柱20min，必要时可适当延长平衡柱时间，然后按洗脱程序进行洗脱。3.3测定：分别取猪血浆蛋白粉样品待测液和IgG工作标准溶液进行测定，以色谱峰面积积分值做单点或多点校准定量。4、结果计算猪血浆蛋白粉待测样品IgG含量W，以质量分数表示，数值以％表示，按如下公式计算：式中：Pi—猪血浆蛋白粉待测样品峰面积值；V—猪血浆蛋白粉待测样品提取液体积，此处为50mL；c—IgG工作标准溶液浓度，单位μg/mL；PSTD—IgG工作标准溶液峰面积值；m—试样质量，单位g。取猪血浆蛋白粉样品1-4号，国标方法(茄形瓶+匀浆机，5min，离心机转速3500r/min，离心10min)为对照组1，超声提取(超声10min，离心机转速5000r/min，离心10min)为对照组2，本发明作为第三种方法，分别对比以上三种方法对同一猪血浆蛋白粉水溶性的测定结果，其结果如下表所示：测定方法对照组1(国标)对照组2(超声提取)本发明1号IgG含量(％)18.5023.5619.282号IgG含量(％)12.0314.0712.703号IgG含量(％)22.7428.1524.164号IgG含量(％)22.2627.6923.86以同一猪血浆蛋白粉作为试验对象，采用本发明方法测定结果如下表：由上表可见，本发明方法测得试验结果误差小，且数据稳定性好。实施例3：一种猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法，包括以下步骤：1)取样：称取猪血浆蛋白粉，并加入至磷酸钾缓冲液中，每1000mL磷酸钾缓冲液中加入2g猪血浆蛋白粉，得到待测样品，其中，磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH值为6.5；2)恒温提取：将待测样品置于25℃恒温摇床中以转速150r/min进行提取30min，之后在8000r/min下离心10min，再采用0.22μm滤膜对离心后的待测样品进行过滤，得到待测液；3)取待测液进行高效液相色谱检测，高效液相色谱检测过程中，流动相A为磷酸盐缓冲液(pH值为6.5)，流动相B为甘氨酸盐酸缓冲液(pH值为2.5)，流速为0.5mL/min，进样量为20μL。实施例4：一种猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法，包括以下步骤：1)取样：称取猪血浆蛋白粉，并加入至磷酸钾缓冲液中，每1000mL磷酸钾缓冲液中加入1.5g猪血浆蛋白粉，得到待测样品，其中，磷酸钾缓冲液的浓度为0.06mol/L，pH值为6.4；2)恒温提取：将待测样品置于26℃振荡培养箱中以转速180r/min进行提取25min，之后在9000r/min下离心8min，再采用0.22μm滤膜对离心后的待测样品进行过滤，得到待测液；3)取待测液进行高效液相色谱检测，高效液相色谱检测过程中，流动相A为磷酸盐缓冲液(pH值为6.4)，流动相B为甘氨酸盐酸缓冲液(pH值为2.4)，流速为0.45mL/min，进样量为25μL。实施例5：一种猪血浆蛋白粉中IgG含量的测定方法，包括以下步骤：1)取样：称取猪血浆蛋白粉，并加入至磷酸钾缓冲液中，每1000mL磷酸钾缓冲液中加入2.5g猪血浆蛋白粉，得到待测样品，其中，磷酸钾缓冲液的浓度为0.04mol/L，pH值为6.6；2)恒温提取：将待测样品置于24℃恒温摇床中以转速200r/min进行提取35min，之后在7000r/min下离心12min，再采用0.22μm滤膜对离心后的待测样品进行过滤，得到待测液；3)取待测液进行高效液相色谱检测，高效液相色谱检测过程中，流动相A为磷酸盐缓冲液(pH值为6.6)，流动相B为甘氨酸盐酸缓冲液(pH值为2.6)，流速为0.55mL/min，进样量为10μL。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3