本发明属于食品检测技术领域，具体涉及凝固-漂浮分散液液微萃取与HPLC联用检测白葡萄酒中三唑类农药残留的方法。
背景技术：
三唑类的农药是常用的广谱性杀虫剂，食品与饮料中该类农药的残留会对人体造成伤害。目前已有许多国家对食品、饮料中的残留量做了严格控制。对于瓜果、蔬菜、谷类等农作物及植物油、葡萄酒等加工农产品中的检测已有较多报道。
现行葡萄酒中三唑类农药残留定量测定方法主要是气相色谱法、气相色谱-质谱联用法。这些测定方法灵敏、精密、准确，但是需要对样品进行前处理(提取、浓缩、净化)。
目前，葡萄酒中农药残留测定的标准前处理方法是溶剂萃取结合固相萃取柱净化浓缩,该方法操作步骤冗长，且需要消耗大量有机溶剂,提取效率偏低。现有技术中，一般采用乙腈为萃取液,在萃取液中加入无水MgS04除水，并加入氯化钠作为分相盐,然后取上清液加入净化剂(N-丙基乙二胺等)净化后直接进样分析。该方法在蔬菜水果等样品中得到广泛应用。目前,有研究者将该方法引入到葡萄酒检测的样品前处理中,取得了较好的效果。然而该方法仍然需要加入萃取液乙腈，而且检出限较低。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种凝固-漂浮分散液液微萃取与HPLC联用检测白葡萄酒中三唑类农药残留的方法，该方法可以有效将葡萄酒中的三唑类农药萃取出来，进而进行检测，而且检出限较低。
本发明是通过以下技术方案实现的：
凝固-漂浮分散液液微萃取与HPLC联用检测白葡萄酒中三唑类农药残留的方法，包括以下步骤：
（1）分散液液微萃取试验过程：准确量取样品于10mL具塞尖底玻璃离心管中，加入超纯水，用NaCl溶解后，加入萃取剂，振荡使管内形成均匀的乳浊液，静置5min，离心，萃取剂在液面成漂浮液珠，冰浴，使液珠凝固，迅速取出凝固状萃取剂，用甲醇复溶，过0.22有机微孔滤膜，待测；
（2）HPLC测定。
优选地，所述的萃取剂为正癸醇、十一醇或十二醇。
更优选地，步骤（1）中所述的萃取剂为十一醇。
优选地，步骤（1）中分散液微萃取试验过程为：准确量取2.5mL质量浓度为[z1] 样品于10mL具塞尖底玻璃离心管中，加入2.5mL超纯水，用0-0.8gNaCl溶解后，加入20-70μL十一醇，振荡使管内形成均匀的乳浊液，静置1-10min，于3000-4000r/min下离心15min，十一醇在液面成漂浮液珠，冰浴30min，使液珠凝固，迅速取出凝固状十一醇，用50μL甲醇复溶，过0.22μm有机微孔滤膜，待测。
更优选地，步骤（1）分散液微萃取试验过程为：准确量取2.5mL质量浓度为0.4mg/L的样品于10mL具塞尖底玻璃离心管中，加入2.5mL超纯水，用0.25gNaCl溶解后，加入30μL十一醇，振荡使管内形成均匀的乳浊液，静置5min，于3500r/min下离心15min，十一醇在液面成漂浮液珠，冰浴30min，使液珠凝固，迅速取出凝固状十一醇，用50μL甲醇复溶，过0.22μm有机微孔滤膜，待测。
上述步骤（2）中HPLC的检测条件为：ZORBAXEclipsePlusC18色谱柱(4.6mm×10cm，3.5μm)，流动相为V（甲醇）：V（水）=85：15，采用等度洗脱，流速0.32mL·min-1，柱温30℃，检测器DAD，检测波长220nm，进样量5μL。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种凝固-漂浮分散液液微萃取与HPLC联用检测白葡萄酒中三唑类农药残留的方法，该方法合理选择密度比水小的萃取剂，离心分相后漂浮的萃取剂凝固，萃取剂易于与水相分离，因此选择了十一醇作为萃取剂；而且萃取剂的体积以及萃取时间和盐的浓度对萃取的效率具有较大的影响，添加NaCl有利于目标分析物由水相转移到有机相，若基体NaCl浓度过大，会影响基质黏度，阻碍待分析物向有机相转移，产生盐的负效应，因此，NaCl必须选择合适的浓度和加入量。
该方法采用合适的萃取剂、萃取剂的体积、萃取时间以及盐的浓度，即30μL十一醇作为萃取剂，萃取时间5min，离子强度100g·L-1，可以有效将葡萄酒中的三唑类农药萃取出来，进而进行检测，而且HPLC选择合适的检测条件，检出限低。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1.1主要材料与设备
Agilent1260Infinity液相色谱仪及工作站，配备真空脱气装置，二元泵，自动进样装置，柱温箱及DAD检测器（美国安捷伦公司），80-2离心机（上海浦东物理光学仪器厂），万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，雷磁PH计(仪电科学仪器)，
氯化钠(AR)，正癸醇(AR)，十一醇(AR)，十二醇(AR)，乙醇(AR)，甲醇（色谱级），DL-酒石酸(AR)，氢氧化钠(AR)(以上药品均购自国药集团化学试剂有限公司)，超纯水，白葡萄酒(1#、2#、3#)(购于济南某大型超市)，分析标准品：戊菌唑(98%)(购于西亚试剂有限公司)，氟硅唑(99.8%)，烯唑醇(99.5%)，苯醚甲环唑(98%)(均购于阿拉丁试剂有限公司)
1.2标准溶液和模拟酒样的配制
标准溶液：准确称取4种三唑类标准品（氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇）各10.0mg置于10mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，配制成浓度均为1.00g·L-1的4种三唑类标准品的混合标准溶液，4℃冷藏备用。
模拟酒样：配制体积分数为12%的乙醇溶液，加入适量酒石酸，调节pH为3.5。
质量浓度为0.4mg·L-1的样品：准确移取1.00g·L-1的标准溶液100μL，于250mL容量瓶中，用模拟酒样或白葡萄酒样品稀释定容。
1.3HPLC检测条件
ZORBAXEclipsePlusC18色谱柱(4.6mm×10cm，3.5μm)，流动相为V（甲醇）：V（水）=85：15，采用等度洗脱，流速0.32mL·min-1，柱温30℃，检测器DAD，检测波长220nm，进样量5μL。
1.4分散液液微萃取试验过程
准确量取2.5mL4种三唑类杀菌剂（氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇）质量浓度为0.4mg/L的模拟酒样或白葡萄酒于10mL具塞尖底玻璃离心管中，加入2.5mL超纯水，用0.25gNaCl溶解后，加入30μL十一醇，振荡使管内形成均匀的乳浊液，静置5min，于3500r/min下离心15min，十一醇在液面成漂浮液珠，冰浴30min，使液珠凝固，迅速取出凝固状十一醇，用50μL甲醇复溶，过0.22μm有机微孔滤膜，待测。
1.5分散液液微萃取试验条件
(1)萃取剂种类的选择
选择合适的萃取剂是提高萃取效率的关键。本研究选择密度比水小的萃取剂，离心分相后萃取剂漂浮于液面，分离比较困难，但如果使漂浮的萃取剂凝固，则萃取剂易于与水相分离，因此，本文考察了凝固点在室温附近的正癸醇(mp6℃)、十一醇(mp11℃)和十二醇(mp24℃)的萃取特性。
(2) 萃取剂体积的选择
实验分别取20μL、30μL、40μL、50μL、60μL和70μL萃取剂（正癸醇、十一醇、十二醇），考察氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇的萃取效率。
(3)萃取时间的选择
试验中通过改变静置时间（分别为1、5、10、15和20min），考察对氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇萃取效率的影响。
(4)盐浓度对萃取效率的影响
添加NaCl有利于目标分析物由水相转移到有机相，若基体NaCl浓度过大，会影响基质黏度，阻碍待分析物向有机相转移，产生盐的负效应，因此，必须对NaCl的加入量进行考察。本试验考察了氯化钠浓度为0-160g·L-1时，氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇的萃取效率。
1.6数据分析
正交试验结果按无交互作用作方差分析，检验各因素对富集倍数的影响。所有计算均通过正交小助手Ⅱv3.1数据分析系统完成。
2结果与分析
2.1分散液液微萃取条件优化
本试验通过预实验在单因素实验的分析基础上，采用各因素相互独立的L9(34)正交试验进一步优化各参数，其中主要对萃取剂的选择(A)、萃取剂体积(B)、萃取时间(C)、离子强度(NaCl的质量浓度)(D)4个影响因素，各取三个水平(见表1)，然后采用极差分析和方差分析来确定最佳萃取因素。优化这些实验参数是为了获得良好萃取效率达到最佳分析条件，试验中采用富集倍数(EF)来评价萃取效率。
表1.正交试验因素及水平
Table1Factorsandlevelsusedinorthogonalarrayexperiments
2.2正交试验结果
正交试验结果见表2，用富集倍数作为响应值，由试验结果可知，在各种不同组合的萃取条件下，氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇的富集倍数具有明显的差别，表明不同的萃取条件4种三唑类农药的萃取效果存在很大的差别。
为了判断各因素对富集倍数影响的主次，采用极差分析和方差分析对数据进行分析。以烯唑醇为例，由极差分析试验结果(表3)可知，不同萃取条件对富集倍数的影响程度从大到小分别为萃取剂种类、萃取剂体积、离子强度和萃取时间。比较K1、K2、K3并对试验结果进行趋势分析，可得到最佳萃取条件为:A2B1C2D3，即30μL十一醇作为萃取剂，萃取时间5min，离子强度100g·L-1。
表2.正交试验设计与结果
Table2Resultsandanalysisoforthogonalarrayexperiments
表3.正交试验极差分析
Table3Rangeanalysisoforthogonalexperiment
方差分析方法则可以定量分析各个因素对试验结果的影响程度。正交试验方差分析结果见表4，根据表中偏差平方和和F比的数值进行分析可知，萃取条件对富集倍数的影响大小顺序为萃取剂种类、萃取剂体积、离子强度和萃取时间，与极差分析结果一致。此外，由表4方差分析可知，萃取剂种类对烯唑醇的富集倍数有显著性影响。
表4.正交试验方差分析
Table4Varianceanalysisoforthogonalexperiment
3方法学验证
3.1标准工作曲线的制定、方法检出限和定量分析
在本研究选定的最佳条件下，外标法定量。将相应浓度的混合标准溶液分别添加到模拟酒样中，按照1.4节的方法测定。以添加混合标准溶液的模拟酒样中氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇的浓度(x,mg/L)为横坐标，对应色谱峰峰面积(y)为纵坐标，绘制工作曲线，进行回归计算。将样品萃取检测后得到的各农药的峰面积代入相应的回归方程，得到样品中各农药的浓度。
相关系数(r)在0.9994～0.9999之间。以3倍信噪比(S/N=3)计算得到4种三唑类杀菌剂（氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇）的检出限在1.0～1.5μg/L之间，富集倍数在28.1-47.4，表5所示。
表5三唑类农药线性回归方程、富集倍数和检出限
(2)方法准确度与精密度
以白葡萄酒作为空白基质，在3个不同添加水平下，每个水平重复5次。结果表明：3种白葡萄酒中（1#、2#、3#）氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇的添加回收率在90%～105%之间，相对标准偏差(RSD)(n=5)在2.9%～6.1%之间。该方法有较高的准确度和良好的稳定性，可用于白葡萄酒样中4种三唑类农药（氟硅唑、戊菌唑、苯醚甲环唑和烯唑醇）的残留检测。
表6白葡萄酒中三唑类杀菌剂的测定结果