本发明涉及中药材中黄曲霉毒素检测中的前处理方法，具体涉及使用高效液相-荧光检测器检测中药中四种黄曲霉毒素的定量检测方法。
背景技术：
柏子仁、陈皮、莲子、地龙、水蛭等中药品种黄曲霉毒素含量超标的报道引发各界对中药中黄曲霉毒素的污染问题的日益关注和重视，2015版中国药典对部分种子类、动物类共19种中药材规定了限度检查。黄曲霉毒素是真菌毒素的一种，是真菌代谢产生的一种有毒产物，种类繁多，如黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、T-2毒素和伏马毒素等等，其中以黄曲霉毒素毒性最大。在食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。黄曲霉毒素一般的检测方法主要有薄层层析、液相色谱法、酶联免疫吸附法、金标试纸法。其中，液相色谱法由于除杂效果好，定量结果准确，被应用于中药中的黄曲霉毒素检测。目前液相色谱法检测主要通过甲醇水溶液提取，免疫亲和固相萃取纯化，荧光检测器或质谱检测器检测。该方法对于基质较为简单的中药材纯化效果较好，但对于基质较为复杂的中药会影响免疫亲和柱的吸附作用，导致回收率较低，影响检测。针对复杂基质的中药材中的黄曲霉毒素检测，需要一种更有效的前处理方法，以满足现在的检测需求。
为了解决上述问题，我们做出了一系列改进。
技术实现要素：
本发明提供了一种中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测方法，解决了现在技术中存在的免疫亲和柱受提取液基质影响导致的杂峰过多、回收率低等问题。本发明的前处理方法应用于中药黄曲霉毒素检测，可以缩短前处理时间，对于复杂的中药基质可以提高纯化效果，降低杂峰数量，提高回收率，适用于大多数中药中四种黄曲霉毒素的提取检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，具体包括：
一种中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)色谱条件设置：安捷伦Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm*150mm，2.7μm)；流动相水(A)-甲醇(B)—乙腈(C)，恒比例洗脱A：B：C＝64：18：18；流速1mL·min-1；柱温35℃；进样量20μL；荧光检测器激发波长360nm，发射波长450nm，在此条件下，各色谱峰分离度均大于1.5，四种黄曲霉毒素在15min内即可完成分析；
(2)对照品溶液的制备：精密移取黄曲霉毒素混合对照品1ml，置20ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，作为储备液；
(3)PBS缓冲液的配制：取氯化钠8g，取氯化钾0.2g，取磷酸氢二钠1.44g，取磷酸二氢钾0.24g，以上混合加去离子水约800mL充分搅拌溶解，以浓盐酸调pH 7.2，定容1L，即得；
(4)黄曲霉溶剂的提取：取步骤(3)的PBS缓冲液调制淋洗液，取本品粉末约2g，精密称定，置50mL离心管中，精密加入50％乙腈水溶液30mL，高速搅拌2分钟，加入氯化钠2.5g，震摇或涡旋至溶液分层，离心5分钟，黄曲霉毒素溶解于上层的乙腈层中，以移液枪精密量取上清液6mL转移至另一离心管中，并加入50ml淋洗液摇匀；
(5)黄曲霉溶剂的净化：取步骤(4)提取的黄曲霉溶剂，以少量水多次润洗离心管，并转移至免疫亲和柱，流速每分钟3mL，用水20mL洗脱除杂，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，加入甲醇1.4mL洗脱，收集洗脱液，置2mL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，以微孔滤膜滤过，取续滤液，供HPLC测定。
进一步，所述步骤2中，黄曲霉毒素混合对照品的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml，纯度均为98％。
进一步，所述步骤4中，淋洗液的配置：取步骤3的PBS缓冲液1L，加入1ml吐温-20，摇匀。
进一步，所述步骤4中，加入50％乙腈水溶液30m时的搅拌速度为11000～30000转/分钟，加入氯化钠2.5g时的离心速度4000～6000转/分钟。
本发明的有益效果：
(1)本发明去除大部分的水溶性杂质，降低这部分杂质对免疫亲和柱的干扰，促进提取液中杂质成分的溶解，降低其在免疫亲和柱上的吸附，从而提高免疫亲和柱的纯化效果，降低杂质干扰，使原本没办法进行定量检测的复杂基质中药得到检测。
(2)本方法已经方法学验证，各项结果符合要求，具有可靠性、准确性与稳定性，保证应用该分析方法获得的数据是可信的。
(3)本发明提高了现有方法的前处理纯化效果，同时降低前处理时间，提高检测效率。
附图说明：
图1为色谱条件图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
图1为色谱条件图。
一种中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测方法，包括以下步骤：
如图1所示，(1)色谱条件设置：安捷伦Poroshell EC-C18色谱柱(4.6mm*150mm，2.7μm)；流动相水(A)-甲醇(B)—乙腈(C)，恒比例洗脱A：B：C＝64：18：18；流速1mL·min-1；柱温35℃；进样量20μL；荧光检测器激发波长360nm，发射波长450nm，在此条件下，各色谱峰分离度均大于1.5，四种黄曲霉毒素在15min内即可完成分析。
(2)对照品溶液的制备：精密移取黄曲霉毒素混合对照品1ml，置20ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，作为储备液。
(3)PBS缓冲液的配制：取氯化钠8g，取氯化钾0.2g，取磷酸氢二钠1.44g，取磷酸二氢钾0.24g，以上混合加去离子水约800mL充分搅拌溶解，以浓盐酸调pH 7.2，定容1L，即得。
(4)黄曲霉溶剂的提取：取步骤(3)的PBS缓冲液调制淋洗液，取本品粉末约2g，精密称定，置50mL离心管中，精密加入50％乙腈水溶液30mL，高速搅拌2分钟，加入氯化钠2.5g，震摇或涡旋至溶液分层，离心5分钟，黄曲霉毒素溶解于上层的乙腈层中，以移液枪精密量取上清液6mL转移至另一离心管中，并加入50ml淋洗液摇匀。
(5)黄曲霉溶剂的净化：取步骤(4)提取的黄曲霉溶剂，以少量水多次润洗离心管，并转移至免疫亲和柱，流速每分钟3mL，用水20mL洗脱除杂，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，加入甲醇1.4mL洗脱，收集洗脱液，置2mL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，以微孔滤膜滤过，取续滤液，供HPLC测定。
所述步骤2中，黄曲霉毒素混合对照品的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml，纯度均为98％。
所述步骤4中，淋洗液的配置：取步骤3的PBS缓冲液1L，加入1ml吐温-20，摇匀。
所述步骤4中，加入50％乙腈水溶液30m时的搅拌速度为11000～30000转/分钟，加入氯化钠2.5g时的离心速度4000～6000转/分钟。
本发明的创新点在于：
采用的提取溶剂经过加盐分层，可以去除大部分的水溶性杂质，降低这部分杂质对免疫亲和柱的干扰，同时使用淋洗液可以促进提取液中杂质成分的溶解，降低其在免疫亲和柱上的吸附，从而提高免疫亲和柱的纯化效果，降低杂质干扰，使原本没办法进行定量检测的复杂基质中药得到检测。与原方法相比，无需使用微孔滤膜或玻璃纤维滤膜过滤，降低了实验成本，减少了前处理时间，提高了黄曲霉毒素适用的检测品种，方法稳定可靠。
本发明已经方法学验证，各项结果符合要求。线性关系显示黄曲霉毒素G2、B2在2.9-29μg/L范围内线性关系良好，黄曲霉毒素G1、B1在9.7μg/L-97μg/L范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.995。重复性验证结果RSD在0.9-5.0％之间，重复性良好。黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的检出限为0.056-0.44μg·kg-1，方法灵敏度较高。黄曲霉毒素的平均回收率为82.16-114.1％，方法准确度较好。最低检测限、重复性、回收率三项数据是分析方法建立与验证的重要参数，其意义在于考核分析方法的可靠性、准确性与稳定性，保证应用该分析方法获得的数据是可信的。
本发明提高了现有方法的前处理纯化效果，使得原本不能用药典现有方法检测的中药材中的黄曲霉毒素得到检测，同时降低前处理时间，提高检测效率。该方法适用于多种复杂中药基质的中药材的黄曲霉毒素的检测，可解决净化效果差，存在较多杂峰、色谱峰丢失、回收率较低的情况。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。