本发明涉及生物检测
技术领域：
，特别是涉及一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法。
背景技术：
鱼是常见的八大过敏性食物之一，其中，小清蛋白(parvalbumins，pv)是其主要过敏原，据统计，95％以上的鱼类过敏患者的过敏症状是由小清蛋白引起的。pv的分子量为10～14kd，等电点为3.9～5.5，主要存在于鱼肉的肌浆蛋白部分，不同鱼类的pv之间存在着免疫交叉反应性，表明pv具有很高的氨基酸同源性。酶联免疫吸附法(elisa)是鱼类小清蛋白的主要检测方法。比如申请公布号为cn102707064a的中国发明专利公开了一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，包括以下步骤：1)淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备；2)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备；3)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记；4)鱼类小清蛋白竞争性elisa检测方法的建立；5)待检样品中鱼类小清蛋白的检测。但是elisa普遍存在假阳性和假阴性的现象。因此发明准确、简便、高灵敏度的鱼类小清蛋白痕量检测方法具有重大意义。公开号为cn105911127a的中国发明专利公开了一种用毛细管电泳快速检测鱼类小清蛋白的方法，包括如下步骤：(1)提取鱼肌肉中的全蛋白并溶于ph为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中所得峰面积代入鱼类小清蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品液中鱼类小清蛋白的浓度。这种方法受干扰因素较多，特别是在样品检测时，全蛋白样品中蛋白种类多且杂，容易干扰检测结果的准确性。核酸适配体(aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(selex)筛选得到的，能与靶标产生空间结构匹配的高亲和力和特异性结合的一段单链dna或rna分子。相对于抗体，核酸适配体具有选择性高、易合成、易修饰和相对稳定等优点。技术实现要素：本发明首次将筛选得到的一对核酸适配体应用于检测鱼类小清蛋白，建立基于核酸适配体的表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，spr)的鱼类小清蛋白检测方法。一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。本发明又提供了一种用于特异性检测鱼类小清蛋白的试剂盒，包含如权利要求1所述的核酸适配体。本发明又提供了另一种用于特异性检测鱼类小清蛋白的试剂盒，包含一对特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。上述两条核酸适配体均为筛选到的可以与鱼类小清蛋白特异性结合的，使用其中任意一条核酸适配体即可以用于特异性检测鱼类小清蛋白，但是使用一对核酸适配体时其中的另外一条可以与纳米金结合，起到一个信号放大的作用。使用纳米金结合核酸适配体与单条的核酸适配体和第二条核酸适配体没有纳米金修饰比较时，能够有效提高spr检测器的信噪比和检测灵敏度。连接一个荧光基团可以检测核酸适配体和小清蛋白的结合情况，但是用spr和纳米金可以达到更好的检测效果。本发明还提供了一种基于spr的鱼类小清蛋白检测方法，包括以下步骤：(1)将生物素化的第一核酸适配体偶联到空白spr传感器芯片上获得检测用spr传感器芯片，(2)使用步骤(1)制备的检测用spr传感器芯片检测含有已知浓度鱼类小清蛋白的标准样品以及待检测样品，(3)将标准样品的检测结果处理得到标准曲线，将待检测样品的检测结果代入标准曲线中获得待检测样品中的鱼类小清蛋白浓度，其中，所述第一核酸适配体的核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。步骤(1)中，芯片通过edc/nhs活化后再用亲和素处理，第一核酸适配体生物素化后与芯片孵育。生物素化可以将核酸适配体和芯片连接同时表征核酸适配体和芯片的结合亲和力。优选的，所述的鱼类小清蛋白检测方法，步骤(2)中使用纳米金标记的第二核酸适配体进行信号放大，第二核酸适配体的核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.1所示，第二核酸适配体与第一核酸适配体的核苷酸序列不同。也就是说，第一核酸适配体核苷酸序列如seqidno.1所示，第二核酸适配体核苷酸序列如seqidno.2所示，或者第一核酸适配体核苷酸序列如seqidno.2所示，第二核酸适配体核苷酸序列如seqidno.1所示。最优选的情况为：所述第一核酸适配体的核苷酸序列如seqidno.1所示，第二核酸适配体的核苷酸序列如seqidno.2所示。若待测样品中有鱼类小清蛋白，则通入样品后，鱼类小清蛋白会与标记在spr传感器芯片上第一核酸适配体进行结合，从而使得spr传感器芯片表面的重量发生变化，进而引起折射率的变化。然后通入纳米金标记的第二核酸适配体，spr传感器表面则会产生更大的重量变化，从而使得spr信号放大，进而提高传感器的灵敏度，达到痕量检测鱼类小清蛋白的目的。上述检测方法中，所述纳米金标记的第二核酸适配体的制备方法包括以下步骤：(1)使用柠檬酸钠还原法制备获得纳米金溶液；(2)将巯基化修饰的第二核酸适配体加入纳米金溶液中，静置，然后分离得到所述纳米金标记的第二核酸适配体。第一核酸适配体的使用浓度为1～2μmol/l，体积为10～15μl。第二核酸适配体与纳米金结合起到信号放大的作用，如果不用信号放大就相当于只用一条核酸适配体进行检测，检测信号会降低。标准曲线制备时也需要通过纳米金的信号放大。在检测过程中，经过处理的芯片通过样品再通过金标核酸适配体，spr信号值趋于稳定后用缓冲液进行洗脱。相对于使用针对靶标蛋白的抗体(即常规spr检测或elisa检测时使用的二抗)进行信号放大，本发明中第二核酸适配体的作用相似，均用于信号放大，但是相比于抗体，适配体有更多的优点：①多元化的靶标分子；②适配体分子小，因其特殊的大小及空间结构，适配体可以在靶标分子的表面或在其内部起作用；③可以更安全高效的通过体外筛选获得，且相对抗体而言，筛选适配体时无需对实验动物进行抗原免疫，且实验过程简单快速无污染；④结构稳定，不易发生突变，较抗体有更好的热稳定性，可以采取很多修饰手段，不影响其结构的稳定性。⑤高特异性及亲和力，可以识别单个碱基的变化；⑥免疫原性小且无毒性，能与多种靶标进行物质高选择性、高特异性结合。本发明通过筛选获得了两条能够特异性与鱼类小清蛋白结合的核酸适配体，每一条均能用于特异性检测样品中的鱼类小清蛋白。本发明针对这两条核酸适配体开发了一种基于spr技术特异性检测鱼类小清蛋白的方法，操作简单、灵敏度高、有很强的特异性，具有极好的应用前景。附图说明图1为鱼类全蛋白样品sds-page电泳检测结果图，其中，泳道m为标准分子量蛋白marker，标准pv泳道为作为参照的小清蛋白标准品，样品泳道为所提取的鱼类全蛋白样品。图2为筛选获得的两条核酸适配体的二级结构示意图，其中图a为核酸适配体qp7(序列如seqidno.1所示)，图b为核酸适配体qp10(序列如seqidno.2所示)。图3为标准曲线构建结果图。图4为特异性检测结果图。具体实施方式实施例1样品的制备。取2g罗非鱼鱼肉，用液氮研磨成粉，然后采用凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白浸液。具体步骤如下：(1)在预冷的1mllysisbuffer中分别加入1μl蛋白酶抑制剂、10μl磷酸酶抑制剂及5μl100mmpmsf，混匀后置冰上保存数分钟待用；(2)取新鲜罗非鱼，将鱼肉用小刀切成泥状，置于研钵中，加入液氮研磨，直至粉末状；(3)快速称取0.1g步骤(2)中的粉末状罗非鱼鱼粉置于1.5ml预冷离心管中，加入1ml上述混合液(步骤(1)中待用的混合液)，混匀后4℃静置2h；(4)10000r/min，4℃离心5min，取上清液，分装保存于-80℃，应避免反复冻融。采用sds-page电泳分析样品液，结果如图1所示。实施例2小清蛋白标准品的制备。小清蛋白标准品从蛋白粗提液中经过煮沸、抽滤、硫酸铵沉淀、透析和离子交换层析获得。具体步骤如下：(1)取5g罗非鱼鱼肉，加入约8倍体积的磷酸盐缓冲液(0.05mol/l，ph7.5)，搅拌约0.5h，4℃静置24h，过滤得蛋白粗提液；(2)将粗蛋白煮沸30min，冷却后抽滤，得滤液；(3)将所得滤液按照质量体积比加入60％硫酸铵，5000r/min，4℃离心15min；(4)将上清液继续按照质量体积比加入100％的硫酸铵，5000r/min，4℃离心15min，取沉淀溶于tris-hcl缓冲液(0.01mol/l，ph7.5)，在蒸馏水中透析过夜；(5)用阴离子交换树脂qsepharosexl进行分离，用tris-hcl(0.01mol/l，ph7.5)作平衡液，用0.1mol/lnacl溶液洗脱，收集洗脱液，用pbs溶液透析获得小清蛋白标准品，于-80℃储存。实施例3小清蛋白核酸适配体筛选。构建合成长度为66mer的小清蛋白随机ssdna文库，两端为固定序列，中间为随机序列(用于selex筛选的小清蛋白随机ssdna文库由上海生工合成，两端为固定序列，中间为含有30个核苷酸的随机序列：[5’-cgtacggtcgacgctagc-(随机序列)-cacgtggagctcggatcc-3’]，库容量大约为1015。)。在进行核酸适配体初级筛选时，应用multi-goselex筛选方法。将小清蛋白随机ssdna文库与石墨烯溶液共同孵育，ssdna通过π-π堆积作用吸附在石墨烯表面。加入目标蛋白小清蛋白后，由于靶标诱导机制，ssdna脱离石墨烯，将与小清蛋白结合的ssdna进行扩增和单链制备。核酸适配体进行负筛选时，将去除小清蛋白鱼全蛋白加入初筛获得的ssdna中，加入石墨烯孵育，使未与全蛋白结合ssdna保留进行扩增和单链制备，弃去与全蛋白结合的ssdna。经过多轮筛选和扩增获得5条能够特异性识别小清蛋白的ssdna，分别为qp7(核苷酸序列如seqidno.1所示)、qp10(核苷酸序列如seqidno.2所示)、qp1(核苷酸序列如seqidno.3所示)、qp14(核苷酸序列如seqidno.4所示)、qp27(核苷酸序列如seqidno.5所示)，通过spr矩阵分析(spr矩阵分析是指将筛选获得的5条核酸适配体连接到芯片上与小清蛋白进行孵育，然后分别通过其他的筛选获得的适配体，使其发生二级结合，共5×5组，在其中选择最佳的一对核酸适配体。)得到一对高亲和力和特异性的小清蛋白核酸适配体qp7和qp10。将筛选获得的核酸适配体与小清蛋白的特异性结合能力利用圆二色谱cd进行表征，利用mfold软件测定核酸适配体qp7、qp10的二级结构如图2所示。实施例4spr检测方法构建。(1)核酸适配体标记芯片：将spr传感器芯片(专利zl201410699155.9)在缓冲液中浸泡约15min，取出芯片，并用超纯水充分洗涤，然后将芯片用200mmedc和50mmdtp活化；将生物素化的核酸适配体qp7(核酸适配体5’端连接生物素，由上海生工合成)加入芯片表面的检测流池中，孵育30min，使核酸适配体固定在芯片上，然后用bsa溶液封闭芯片，取出芯片，并用超纯水充分洗涤，洗去未结合的核酸适配体。(2)核酸适配体修饰纳米金：用柠檬酸钠还原法制备纳米金，取一洁净锥形瓶，加入超纯水，加热至沸腾后快速加入柠檬酸三钠溶液，待溶液完全沸腾后加入haucl4溶液，加热至沸腾，继续加热10min，溶液颜色逐渐由无色经蓝色、紫红色最后至亮红色，反应结束后取下锥形瓶，常温搅拌，直至溶液冷却至常温，得到纳米金溶液。在5ml纳米金溶液(浓度为10nm)中加入10μl巯基化的核酸适配体qp10(核酸适配体5’端进行巯基修饰，由上海生工合成，浓度为20μm)，静置16h，离心，除去游离的巯基化的核酸适配体，并用mch(6-巯基-1-己醇)封闭纳米金表面未结合核酸适配体的位点，将核酸适配体修饰的纳米金用tris-hcl(ph7.4)洗涤，获得金标核酸适配体qp10。(3)配制不同浓度的鱼类小清蛋白标准品溶液以及空白对照组，首先在流池中注入缓冲液校准传感器基线，基线稳定后，浓度由低到高注入小清蛋白过敏原标准溶液，实时记录表面等离子共振角度变化数值，总结并绘制蛋白浓度和信号变化关系，将数据进行处理，得到一条对应的标准曲线。(4)将待测样品加入样品池中，当样品通过芯片表面时，标记在芯片上的核酸适配体qp7会特异性地对其捕获，通过金标核酸适配体qp10的信号放大作用，得到传感器的信号变化，将采集到的信号值代入标准曲线中，计算得到待测样品中鱼类小清蛋白的含量。传感器中样品进样的流动速度为5～400μl/min，并根据情况将样品流动速度控制在±0.5μl/min，检测时温度应该控制在室温(25℃)，控制精度为±0.5℃。实施例5使用实施例4中方法进行标准曲线构建。实验中分别配制终浓度为0.5、1、10、20、30、40μg/ml的小清蛋白溶液，以及空白对照组。首先在流池中注入系统缓冲液，用来校准spr传感器基线，通过调整参数待基线显示稳定后，按照浓度从低到高的顺序依次注入小清蛋白标准溶液，注入的速度5-20μl/min，注入总量为200μl。实时记录表面等离子共振角度变化数值，总结并绘制蛋白浓度和信号变化关系，将数据进行处理，得到一条对应的标准曲线，结果如图3所示，所得标准曲线为y＝2.1675x-1.2296，相关系数r2＝0.9954，最低检测浓度为0.1μg/ml。实施例6特异性检测。使用实施例4中方法对鱼杂蛋白混合液，即含有除小清蛋白以外的其他鱼类蛋白的混合液进行检测。鱼杂蛋白制备方法：用实施例1中方法提取鱼肉中的全蛋白，用阴离子交换树脂qsepharosexl进行分离纯化，用tris-hcl(0.01mol/l，ph7.5)作平衡液，用0-0.5mol/lnacl进行线性梯度洗脱，确定小清蛋白组分并弃去，收集其余蛋白溶液。配制终浓度为0.5、1、10、20、30、40μg/ml的鱼杂蛋白溶液进行特异性试验，在对芯片进行完活化、核酸适配体固定、位点封闭等步骤之后分别将各不同浓度的鱼杂蛋白通过spr传感器进行捕获实验时，结果如图4所示，spr信号值无明显变化，表明该方法特异性较强，只对小清蛋白发生反应，而对其他蛋白没有交叉反应。实施例7使用实施例4中方法对人工添加样品进行检测。表1人工添加样品检测结果(n＝3)样品实际浓度(μg/ml)样品检出值(μg/ml)回收率(％)0.50.51±0.0310210.98±0.0498109.94±0.0799.42020.11±0.04100.53028.75±0.0995.84041.45±0.11103.6分别配制终浓度为0.5、1、10、20、30、40μg/ml的小清蛋白溶液，每个浓度3个平行样，进行样品检测和回收率测定。检测结果如表1所示，在0.5～40μg/ml浓度添加范围内，回收率在95.8％～103.6％，表明该方法可以用于实际样品的检测。序列表<110>浙江工商大学<120>一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>66<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>1cgtacggtcgacgctagcagtggcaggtagtatctgcggcgcatggtccacgtggagctc60ggatcc66<210>2<211>62<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>2cgtacggtcgacgctagctacaagttggaggggttaaatgtgccgacgtggagctcggat60cc62<210>3<211>66<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3cgtacggtcgacgctagccttcatggcctgccaagtggctactactgtcacgtggagctc60ggatcc66<210>4<211>66<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>4cgtacggtcgacgctagccctctgtcgtggtggcatctgcgtatgtgccacgtggagctc60ggatcc66<210>5<211>66<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>5cgtacggtcgacgctagctctatcgtgcattctactacctacttccggcacgtggagctc60ggatcc66当前第1页12