本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒、制备方法及使用方法。
背景技术
破伤风(tetanus)一词来源于希腊语，表示痉挛的意思，经常发生在创伤之后。如果机体伤口被厌氧的破伤风梭菌感染，该细菌就会在缺氧的环境下生长并产生外毒素而引起的急性、致死性的神经系统疾病。
破伤风梭菌是梭菌属成员，革兰阳性厌氧菌。芽孢呈正圆形，位于菌体一端，使菌体呈鼓槌状。芽孢抵抗力极强，在自然界中分布广泛，土壤、人和动物的粪便中都能分离到。破伤风梭菌有菌体抗原和鞭毛抗原。本菌可产生两种外毒素，一种为破伤风溶血素(tetanolysin)只在培养初期产生以后逐渐减少并消失。另一种为破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)是一种神经毒素，与破伤风梭菌的致病性有关，即通常所指的破伤风毒素。
破伤风的预防主要依赖于抗体，并且只能通过主动免疫(破伤风疫苗)或被动免疫(破伤风特异性免疫球蛋白)实现。破伤风疫苗由破伤风类毒素制成，后者是一种经过处理的神经毒素，可诱导产生保护性的抗毒素。经过免疫的孕妇可将抗毒素经胎盘传递给胎儿，从而防止新生儿发生破伤风。
目前市场上的破伤风杆菌igg抗体酶联免疫检测试剂样品采用血清/血浆，需血量多且需静脉抽血，基层使用存在诸多不便，尤其是低年龄组儿童采血更为困难，有的试剂还存在促凝剂对检测的干扰等问题。因此推出效期长、操作简便，适用于血清、血浆、全血检测的试剂已成为当务之急。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒、制备方法及使用方法，以克服上述现有技术中的不足。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒，试剂盒包括破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板、抗破伤风杆菌抗体、酶标记物、标准品溶液；所述酶标板上包被的破伤风类毒素灭活精纯抗原的蛋白质浓度为0.5-3.0ug/ml；所述酶标记物包括稳定剂a、生物防腐剂和辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体，所述鼠抗人igg单克隆抗体的蛋白浓度大于等于5mg/ml。
本发明的有益效果是：
1)采用酶联免疫吸附法，能较胶体金机读出准确的数值；
2)精纯的抗原包被，且使用浓度低，能有效的降低成本，使产品最终价格低廉，市场竞争力强，产品稳定，且效价高；
3)能检测血清、血浆及全血。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述辣根过氧化物酶的酶纯度大于等于3.0。
进一步，所述标准品溶液的浓度分别为0.1iu/ml、1.0iu/ml、2.0iu/ml、4.0iu/ml、8.0iu/ml和12.0iu/ml。
采用上述进一步的有益效果为：抗体检测浓度范围在0.1～12iu/ml，既能满足血浆站收集验证献血者合格血样，又能做普通人抗体检测，判断个体或群体免疫成功与否。
进一步，试剂盒还包括浓缩洗涤液、样品稀释液、底物液a、底物液b和终止液。
进一步，所述浓缩洗涤液为含有nacl、吐温-20的ph7.2的浓缩磷酸缓冲液；所述底物液a内含有过氧化脲；所述底物液b内含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为0.5m的h2so4溶液；所述样品稀释液内含有柠檬酸钠缓冲液和稳定剂b。
一种破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤s100a、制备破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板
步骤s110a、包被液配制：根据抗原包被浓度调试结果配制破伤风类毒素灭活精纯抗原包被液；
步骤s120a、封闭液配制：配制抗原封闭液；
步骤s130a、包被酶标板：
步骤s131a、抗原包被：将配制的破伤风类毒素灭活精纯抗原包被液加入到酶标板上的孔中，每孔加入的量为100μl，并将酶标板置于2～8℃环境下包被18～24h；
步骤s132a、封闭：将配制的抗原封闭液加入到酶标板上的孔中，每孔加入的量为150μl，置于2～8℃环境下18～24h；
步骤s133a、干燥：酶标板置于30℃以下、湿度小于35％的环境中干燥2～4h；
步骤s134a、密封：用铝箔袋真空塑封，即得破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板；
步骤s200a、酶标记物的制备：将辣根过氧化物酶与鼠抗人igg单克隆抗体采用过碘酸钠氧化法进行偶联，得到辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体，再将辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体与稳定剂a和生物防腐剂混合，得到酶标记物；
步骤s300a、进行浓缩洗涤液、样品稀释液、底物液a、底物液b、终止液、标准品溶液的分装。
采用上述进一步的有益效果为：采用本方法所制备的试剂盒可在加速破坏性温度(37℃)下稳定贮存至少6天，可在2～8℃下稳定贮存至少14个月，可在2～8℃开启预包被板真空包装下稳定贮存至少10天，可在室温开启预包被板真空包装下稳定放置至少8小时。
进一步，所述破伤风类毒素灭活精纯抗原包被液的浓度由破伤风类毒素灭活精纯抗原与酶标记物采用配合滴定法确定。
进一步，所述步骤s100a需在十万级洁净区进行。
进一步，所述步骤s200a和所述步骤s300a需在万级洁净区进行。
一种破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤s100b、用样品稀释液按1：200稀释血清/血浆样品或按1：100稀释全血样品，取100μl到破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板的酶标孔中，37℃孵育30min；
步骤s200b、洗板5次，拍干；
步骤s300b、加酶标记物，37℃孵育30min；
步骤s400b、洗板5次，拍干；
步骤s500b、加入底物液a和底物液b，底物液a和底物液b中的显色剂被酶标记物上的辣根过氧化物酶催化显色，颜色的深浅和抗破伤风杆菌抗体的量成正比，若待测血清中不含抗破伤风杆菌抗体，则不显色；
步骤s600b、以标准品的含量为自变量(x)，以其对应的吸光度值为因变量(y)，以四参数logistic曲线拟合回归方程，将待测样品的吸光度值代入回归方程，计算出相应的含量，测定结果＞12.0iu/ml的样本须稀释后重新检测，线性回归系数r2＜0.99时，视为无效。
采用上述进一步的有益效果为：能准确反应样本的靶物质浓度，辅助判断检测物质量，定量的标曲设计为曲线，较直线的线性范围较窄，能极大的扩宽其检测范围，并通过logistic曲线拟合(四参数)公式最大限度的贴合曲线，使结果准确；调整酶联法的样本反应时间从普遍的1小时缩短为0.5小时，节约了总检测时间。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒，试剂盒包括破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板、抗破伤风杆菌抗体、酶标记物、标准品溶液。在本发明中酶标板购自厦门市云鹏科技发展公司，肉眼观察没有飞边及表面光洁度差的现象，底部无波纹或划伤等；用一定浓度人igg包被封闭后，用抗人igg-hrp检测，批内变异系数cv≤5％，批间变异系数cv≤10％。所述酶标板上包被的破伤风类毒素灭活精纯抗原购自武汉益昇生物科技有限公司，其蛋白浓度0.5-3.0ug/ml；所述酶标记物包括稳定剂a、生物防腐剂和辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体，所述鼠抗人igg单克隆抗体购自厦门波生生物技术有限公司，其蛋白浓度不低于5mg/ml，辣根过氧化物酶为武汉益昇生物科技有限产品，rz(酶纯度)≥3.0，稳定剂a用于稳定酶标记物里的蛋白，维持辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体的活性,稳定剂a包括缓冲剂，蛋白，胶体，防腐剂。所述标准品溶液的浓度分别为0.1iu/ml、1.0iu/ml、2.0iu/ml、4.0iu/ml、8.0iu/ml和12.0iu/ml，其对应规格均为0.5ml/瓶，标准品溶液包含阴性血清和阳性血清。
试剂盒还包括浓缩洗涤液、样品稀释液、底物液a、底物液b和终止液，其中，所述浓缩洗涤液为含有nacl、吐温-20的ph7.2的浓缩磷酸缓冲液；所述底物液a内含有过氧化脲；所述底物液b内含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为0.5m的h2so4溶液；所述样品稀释液内含有柠檬酸钠缓冲液和稳定剂b，稳定剂b用于稳定加入其中的样本，提供维持血细胞代谢的基本营养物质，不让血细胞过早凋亡，造成溶血，影响实验结果，同时可以维持血清血浆中待测抗体的活性，稳定剂b包括缓冲剂，蛋白，胶体，防腐剂。
一种破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤s100a、在十万级洁净区中制备破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板
步骤s110a、包被液配制：根据破伤风类毒素灭活精纯抗原与酶标记物采用配合滴定法确定的结果配制破伤风类毒素灭活精纯抗原包被液；
步骤s120a、封闭液配制：配制抗原封闭液；
步骤s130a、包被酶标板：
步骤s131a、抗原包被：将配制的破伤风类毒素灭活精纯抗原包被液加入到酶标板上的孔中，每孔加入的量为100μl，并将酶标板置于2～8℃环境下包被18～24h，取出用洗涤液洗板一次，拍干；
步骤s132a、封闭：将配制的抗原封闭液加入到经过抗原包被处理后的酶标板上的孔中，每孔加入的量为150μl，置于2～8℃环境下18～24h，取出拍干；
步骤s133a、干燥：将经过封闭处理后的酶标板置于30℃以下、湿度小于35％的环境中干燥2～4h；
步骤s134a、密封：将经过干燥处理后的酶标板用铝箔袋真空塑封，即得破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板；
步骤s200a、在万级洁净区中进行酶标记物的制备：将辣根过氧化物酶与鼠抗人igg单克隆抗体采用过碘酸钠氧化法进行偶联，得到辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体，再将辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体与稳定剂a和生物防腐剂混合，得到酶标记物；
步骤s300a、在万级洁净区中进行浓缩洗涤液、样品稀释液、底物液a、底物液b、终止液、标准品溶液的分装。
一种破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤s100b、用样品稀释液按1：200稀释血清/血浆样品或按1：100稀释全血样品，取100μl到破伤风类毒素灭活精纯抗原包被的酶标板的酶标孔中，37℃孵育30min，血清样本中的抗破伤风杆菌抗体与酶标板上的破伤风类毒素灭活精纯抗原充分结合；
步骤s200b、洗板5次，拍干，洗去酶标板的酶标孔中未与破伤风类毒素灭活精纯抗原结合的抗体及蛋白物质；
步骤s300b、加酶标记物，37℃孵育30min，酶标记物与结合于破伤风类毒素灭活精纯抗原上的抗破伤风杆菌抗体充分结合；
步骤s400b、洗板5次，拍干，洗去未与抗破伤风杆菌抗体结合的酶标记物；
步骤s500b、加入底物液a和底物液b，底物液a和底物液b中的显色剂被酶标记物上的辣根过氧化物酶催化显色，颜色的深浅和抗破伤风杆菌抗体的量成正比，若待测血清中不含抗破伤风杆菌抗体，则不显色；
步骤s600b、每次试验都应设标准品，以标准品的含量为自变量(x)，以其对应的吸光度值为因变量(y)，以四参数logistic曲线拟合回归方程，将待测样品的吸光度值代入回归方程，计算出相应的含量，测定结果＞12.0iu/ml的样本须稀释后重新检测，线性回归系数r2＜0.99时，视为无效。
临床灵敏度和特异性
使用德国维润赛润公司生产的破伤风igg抗体检测试剂盒(酶联免疫法)(对比试剂)与本发明所研制的试剂盒(研究试剂)分别在湖北省疾病预防控制中心(组长单位)、江苏省疾病预防控制中心和四川省疾病预防控制中心进行了临床试验，共计1096例。
三家医疗机构的临床试验结果见表1：
表1：临床试验汇总结果
临床试验结论：本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒(酶联免疫法)阳性一致性百分比为98.60％【95％可置信区间：97.74％，99.46％】，阴性一致性百分比为95.57％【95％可置信区间：93.51％，97.63％】，总一致性百分比为97.54％【95％可置信区间：96.62％，98.46％】，配对卡方检验分析表明研究试剂与对比试剂结果差异无统计学意义，由kappa一致性检验结果可知：研究试剂与对比试剂具有极强的一致性，证明研究试剂与对比试剂等效，适合临床使用。
交叉实验
用德国维润赛润公司生产的破伤风杆菌igg抗体检测试剂盒(酶联免疫法)检测筛选出破伤风igg抗体阴性样本，再用德国维润赛润公司生产的检测抗百日咳igg抗体和白喉igg抗体的试剂盒检测上述样本，最后用本发明所研制的三批试剂进行检测，研究是否产生交叉实验。
用本发明筛选的甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、水痘-带状疱疹病毒igg抗体阳性样本各30份，同时用德国维润赛润研发公司和本发明所研制的破伤风杆菌igg抗体检测试剂盒(酶联免疫法)同时检测相关样本，研究是否产生交叉反应。
用南漳县妇幼保健院提供的梅毒螺旋体、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、弓形虫igg抗体阳性样本以各30份，同时用德国维润赛润研发公司和本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒(酶联免疫法)同时检测相关样本，研究是否产生交叉反应。
用武穴市妇幼保健院提供的丙型肝炎病毒、eb病毒、肺炎支原体igg抗体阳性的样本各30份，同时用德国维润赛润研发公司和本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒(酶联免疫法)同时检测相关样本，研究是否产生交叉反应。
hiv病毒igg抗体阳性样本的交叉反应委托咸宁市疾病预防控制中心进行。
交叉实验研究结果表明：
本发明所研制的试剂盒与白喉杆菌igg抗体阳性标本、百日咳杆菌igg抗体阳性标本、甲肝肝炎病毒igg阳性标本、乙肝肝炎病毒表面抗体阳性标本、水痘-带状疱疹病毒igg抗体阳性标本、丙型肝炎病毒igg抗体阳性标本、梅毒螺旋体igg抗体阳性标本、hiv病毒igg抗体阳性标本、eb病毒igg抗体阳性标本、肺炎支原体igg抗体阳性标本、巨细胞病毒igg抗体阳性标本、单纯疱疹病毒igg抗体阳性标本、弓形虫igg抗体阳性样本不发生交叉反应。
干扰实验
将血红蛋白(hb)、甘油三酯、胆红素添加到阴性样品和阳性样品中并进行检测，以此来研究临床常见异常标本：溶血标本(临床高值1.8g/l)、脂血标本(临床高值5.65mmol/l)、高胆红素标本(临床高值85μmol/l)是否会对试剂盒测定结果产生干扰。
用德国维润赛润公司生产的破伤风igg抗体检测试剂盒(酶联免疫法)与本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒(酶联免疫法)共同检测南漳县妇幼保健院提供的类风湿因子和抗核抗体阳性的血清样本各30份和南漳县妇幼保健院提供的孕妇血清样本各30份，根据试验结果分别评估类风湿因子、抗核抗体及孕妇样本对检测结果的干扰。
根据实验结果分析，溶血标本(临床高值1.8g/l)、脂血标本(临床高值5.65mmol/l)、高胆红素标本(临床高值85μmol/l)，od值与对照组比较，变化不大，不会对本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒的测定结果产生干扰反应。对于血脂标本，血脂浓度较低时，不会对试剂盒产生干扰，但当样本为高血脂样本(甘油三酯>5.0mmol/l)，在对待检测结果时应考虑可能出现的假阴性。
因血红蛋白高值超过溶血标本中血红蛋白高值浓度、胆红素高值超过高胆红素血症标本中胆红素高值浓度，此2种情况均无干扰，故在临床上高血红蛋白或高胆红素标本对本试剂盒的检测干扰反应不大，但高血脂标本不宜用于本试剂盒的检测，应重新抽血制备待检样本。
类风湿因子和抗核抗体阳性样本及孕妇血清样本对赛润破伤风试剂盒检出的破伤风抗体阴性样本无影响，本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒检测破伤风igg抗体与赛润试剂盒的结果一致。
稳定性
通过加速稳定性实验、实际稳定性研究实验和拆封后室温环境下的稳定性研究实验，其研究数据表明：本发明所研制的破伤风免疫球蛋白血样筛选试剂盒(酶联免疫法)，可在加速破坏性温度(37℃)下稳定贮存至少6天，可在2～8℃下稳定贮存至少14个月，可在2～8℃开启预包被板真空包装下稳定贮存至少10天，可在室温开启预包被板真空包装下稳定放置至少8小时。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。